Brisanje MiR-29b2/c dovodi do ubrzanog starenja i neuroprotekcije kod miševa uzrokovanih Parkinsonovom bolešću MPTP

Abstract

Studije otkrivaju vezu između miR-29a u starenju i Parkinsonove bolesti (PD). Ovdje pokazujemo da serumski nivoi miR-29s u 1-metil-4-fenil-1,2,3,6-tetrahidropiridinom (MPTP)-indukovanom PD miševi su pokazali dinamičke promjene. Uloga miR-29b2/c u starenju i PD proučavana je korištenjem miR-29b2/c gen nokaut miševa (miR-29b2/c KO). miR-29b2/c KO miševi su bili okarakterisani značajno manjom težinom, kifozom, slabošću mišića i abnormalnim hodom u poređenju sa miševima divljeg tipa (WT). WT je također razvio očigledno zadebljanje dermisa i smanjenje masnog tkiva. Međutim, nedostatak miR-29b2/c je ublažio MPTP-indukovana oštećenja dopaminergičkog sistema i glijalnu aktivaciju u nigrostrijatalnom putu i posljedično poboljšala motoričku funkciju KO miševa tretiranih MPTP-om. Nokautiranje miR-29b2/c inhibira ekspresiju inflamatornih faktora u primarnim kulturama miješane glije, primarnih astrocita ili LPS-om tretiranim s 1-metil-4-fenil piridinijumom (MPP plus ) primarna mikroglija. Štaviše, nedostatak miR-29b2/c pojačao je aktivnost AMPK, ali je potisnuo NF-κB p65 signalizaciju u glijalnim ćelijama. Naši rezultati pokazuju da miR-29b2/c KO miševi pokazuju fenotip sličan progeriji. Manje aktivirane glijalne ćelije i potisnuta neuroinflamacija mogu dovesti do dopaminergičke neuroprotekcije kod miR- 29b2/c KO miševa. Konačno, miR-29b2/c je uključen u regulaciju starenja i igra štetnu ulogu u Parkinsonovoj bolesti.

Ključne riječi

MiR-29b2/c; neuroprotekcija; MPTP-indukovana Parkinsonova bolest;Cistanche koristi.

Kliknite ovdje da dobijetekoji su efekti Cistanchea

Uvod

Parkinsonova bolest (PD) je druga najčešća neurodegenerativna bolest koju karakterizira progresivni gubitak dopaminergičkih neurona u supstanci nigra par compacta (SNpc) srednjeg mozga, te povećana glijalna aktivacija i neuroinflamacija [1–3]. MikroRNA su kratke nekodirajuće RNA molekule koje regulišu ekspresiju gena na post-transkripcionom nivou [4, 5]. MikroRNA su uključene u regulaciju razvoja nervnog sistema, neuronske plastičnosti i neurodegenerativnih bolesti. Porodica MicroRNA29 (miR- 29s) se sastoji od dva klastera gena: miR-29a/b1 i miR-29b2/c, koji se nalaze na hromozomu 6 i hromozomu 1, respektivno. genom miša. miR-29a i miR-29c imaju samo jednu nukleotidnu razliku, dok su miR-29b1 i miR{17}}b2 identični u sekvenci [6]. miR-29i su uključeni u više bioloških procesa. Mnogi ciljni geni miR-29i su eksperimentalno verifikovani, uključujući gene preživljavanja Procella Bcl-2, Mcl-1, Cdc42 i p85- ; proapoptotički geni Puma, Bim, Bak i Bmf; i proinflamatorni citokini IFN- i IL-12. U perifernom sistemu, studije su pokazale da su miR-29 uključeni u fibrozu tkiva [7–9], metabolizam i imunološku regulaciju [10–13].

miR-29 se široko eksprimiraju u centralnom nervnom sistemu, a njihovi transkripti postoje i u neuronima i u glijalnim ćelijama [14, 15]. Povezanost između miR-29a i neuroloških bolesti je sve više ilustrovana. miR-29 su uključeni u regulaciju proizvodnje -amiloida, i oni su smanjeni u mozgu pacijenata sa AD [16, 17]; Nivoi miR-29 također se smanjuju kod pacijenata s Huntingtonovom bolešću (HD) i HD modela miševa [18, 19], dok se povećavaju kod pacijenata s amiotrofičnom lateralnom sklerozom (ALS) i ALS mišjih modela [16, 20]. I miR-29a/b-1-deficijentni miR-29 miR-29 miševi sa smanjenom regulacijom pokazuju fenotip sličan ataksiji [6, 21]. Što se tiče efekata ekspresije miR-29a na neuroprotekciju i promociju neuronske smrti u modelima ishemijskih glodara, prijavljeni su suprotni rezultati [22, 23]. U prethodnim studijama, uočili smo da su nivoi miR-29 značajno smanjeni u serumu pacijenata sa PD sa opadajućim trendom koji se odnosi na teži parkinsonizam [24]. Nadalje, nivoi miR-29 su korelirali sa performansama pamćenja kod pacijenata sa PD [25]. Zaključili smo da je miR-29b2/c blisko povezan sa PD, ali su njegove fiziološke funkcije i patološki mehanizmi uključeni u PD uglavnom nepoznati.

U ovoj studiji, nivoi miR-29 u serumu miša kao odgovor na davanje MPTP-a mjereni su do 120 dana nakon injekcije. Efekti deficijencije miR-29b2/c na periferna tkiva proučavani su korištenjem miR-29b2/c KO miševa. Dopaminergički neurotoksin MPTP je dalje korišten za indukciju mišjeg modela PD. Zatim su istražene povrede nigrostriatalnog dopaminergičkog sistema, performanse ponašanja i potencijalni mehanizmi. Uočili smo da nivoi miR-29 u serumu miša pokazuju dinamičke promjene nakon primjene MPTP-a. miR- 29b2/c KO miševi su pokazali ubrzano starenje, na šta ukazuje manja tjelesna težina, smanjenje masnog tkiva, kifoza, zadebljanje kože, slabost mišića i abnormalnost hoda. Međutim, nedostatak miR-29b2/c doveo je do ublažavanja dopaminergičkog oštećenja i glijalne aktivacije, a posljedično i do poboljšanja ponašanja u životinjskom modelu sličnom PD.

Cistanche pilule

Rezultat

1. Fenotip sličan progeriji kod miR-29b2/c KO miševa

miR-29b2/c nokaut miševi (miR-29b2/c KO) generirani su upotrebom CRISPR-Cas9 tehnike. Strategija ciljanja gena i genotipizacija mutantnih miševa predstavljeni su na Dodatnoj slici 1. Četiri i 16--mjesečni miR-29b2/c KO miševi imali su smanjenu tjelesnu težinu (Slika 1A). Sa tri mjeseca starosti, karakteristike miR-29b2/c KO miševa ostale su nepromijenjene, što je dokazano rendgenskom mikro-kompjuterskom tomografijom (mikro-CT) skeniranjem (dodatna slika 2A). Nije bilo razlika u mineralnoj gustini kostiju (BMD), srednjoj BMD trabekula, trabekularnoj separaciji, debljini trabekule i indeksu strukturnog modela (SMI) između miR-29b2/c KO miševa i njihovog WT kolege u dobi od 13 mjeseci ( Dodatna slika 2B). Bojenjem hematoksilinom i eozinom (H&E) otkrili smo da 13-mjesečni miR-29b2/c KO miševi pokazuju zadebljani dermis sa povećanim i produbljenim borama (Slika 1B, 1C). A kifoza je bila očigledna kod 16-mjesečnih miR-29b2/c KO miševa (slika 1C). miR-29b2/c KO miševi u mladoj dobi (stari 3 mjeseca) imali su normalno masno tkivo (dopunska slika 2C, 2D). Međutim, abdominalno masno tkivo (kombinovano potkožno i visceralno masno tkivo) i smeđe masno tkivo su dramatično smanjeni kod miR-29b2/c KO miševa u poređenju sa WT miševima u dobi od 16 mjeseci (Slika 1D). Nadalje, analizirani su nivoi transkripcije markera starenja p21 i p53 u mozgu. One su se značajno povećale u hipokampusu, ali ne i u korteksu miR-29b2/c KO miševa u dobi od šest mjeseci. Nivoi proteina p53 i p16 u hipokampusu s nedostatkom miR-29b2/c nisu se razlikovali od WT kontrola. Osim toga, aktivnost -galaktozidaze, poznata karakteristika ćelijskog starenja, nije se razlikovala između mozga tromjesečnih WT i miR-29b2/c KO miševa.

Slabost mišića i abnormalnost hoda kod miR- 29b2/c KO miševa

Procijenjeno je ponašanje miševa s nedostatkom miR-29b2/c. Snaga mišića mjerena je testovima Wire hanging i Grid hanging testa. MiR-29b2/c KO miševi su postigli niže rezultate od kontrolnih miševa u testu viseće žice (Slika 2A). A latencija pada je bila dramatično kraća kod miR-29b2/c KO miševa u poređenju sa divljim tipovima miševa u Grid hanging testu (Slika 2B), ali performanse Rotarod testa WT i miR{{10} }b2/c KO miševi se nisu značajno razlikovali (slika 2C). Sistem za analizu Catwalk XT detektirao je hod životinja. Iznenađujuće, i brzina i dužina koraka miR-29b2/c KO miševa su bile veće od onih kod njihovih kolega, dok su ciklus koraka, stajanje i vrijeme zamaha bili kraći, a radni ciklus smanjen, u miR{ {15}} miševi sa nedostatkom b2/c (slika 2D).

Promjene miR-29 u PD mišjem serumu izazvanom MPTP

Nivoi miR-29 su se smanjili u serumu pacijenata sa PD u poređenju sa zdravim kontrolama [24]. U ovoj studiji, nivoi miR-29 u serumu PD miševa su kvantificirani 3, 30 i 120 dana nakon primjene subakutnog režima MPTP. Nivoi miR-29a i miR-29b su se smanjili 3 dana nakon injekcije i vratili se na početne vrijednosti nakon 30 dana, a ponovo su se smanjili nakon 120 dana. Međutim, nivo miR-29c se nije značajno promijenio (dopunska slika 5).

Cistanche suplementi

Nedostatak miR-29b2/c ublažava nigrostrijalne ozljede izazvane MPTP-om i motorne deficite kod miševa

miR-29b2/c nokaut miševi i WT legla su ubrizgani MPTP da bi se inducirao PD model. Nivoi ekspresije p21, p53 i Pai1 u striatumu miR-29b2/c KO miševa i WT kontrola nisu se promijenili nakon primjene MPTP. Izloženost MPTP-u izazvala je značajno smanjenje TH-pozitivnih dopaminergičkih neurona u SNpc [F(1, 20)=5.441, P=0.0302] i TH-pozitivnih nervnih terminala, TH proteina [F(1, 20)=10.5, P=0.0041] i nivoi dopamina, DOPAC-a i HVA u striatumu (Slika 3A-3D). Međutim, nigrostriatalne povrede kod miR-29b2/c KO miševa tretiranih MPTP-om su dramatično ublažene u poređenju sa MPTP-tretiranim WT kontrolama kao što su broj dopaminergičkih neurona, gustina dopaminergičkih nervnih terminala i nivoi strijatalnog TH proteina i koncentracije dopamina bile su značajno veće; Osim toga, promjene u omjerima DOPAC prema DA i HVA prema DA [F(1, 19)=12.64, P=0.0021] su značajno ublažene (Slika 3A-3D). Kod normalnih miR-29b2/c KO miševa ubrizganih fiziološkim rastvorom, strijatalne koncentracije 5-HT i njegovog metabolita 5-HIAA porasle su u poređenju sa njihovim WT kolegama, a koncentracije NE bile su blizu između divlji tip i miR-29b2/c KO miševi (slika 3D). Rearing i Pole test su korišteni za procjenu spontane vertikalne aktivnosti [26, 27] i lokomotorne aktivnosti miševa [28], respektivno. Dva dana nakon posljednje injekcije MPTP-a, učestalost uzgoja se smanjila kod WT miševa u posljednja 2 minute u poređenju sa normalnim WT kontrolama tretiranim slanim rastvorom. Slični eksperimenti nisu otkrili efekat deficijencije miR- 29b2/c na promjene frekvencije uzgoja izazvane MPTP (Slika 3E). Slično, ukupno vrijeme utrošeno na okretanje i spuštanje se povećalo kod WT miševa nakon primjene MPTP-a u Pole testu, dok je ukupno vrijeme bilo blizu između normalnog fiziološkog rastvora i miR-29b2/c KO miševa tretiranih MPTP-om (Slika 3F) .

Nedostatak miR-29b2/c smanjuje glijalnu aktivaciju izazvanu MPTP-om kod miševa

Aktivacija glijalnih ćelija i neuroinflamacija posredovana glijalnim ćelijama uključeni su u patologiju PD [29]. Astrociti su se značajno povećali u nigrostrijatalnom putu WT miševa, dok su se GFAP plus astrociti povećali u striatumu, ali ne i u SNpc [F(1, 8)=5.412, P=0.0484] miR -29b2/c KO miševi tri dana nakon MPTP injekcije. Značajno je da se gustine astrocita nisu razlikovale u dva regiona WT i miR-29b2/c KO miševa tretiranih MPTP-om (Slika 4A, 4B). Iba 1 plus mikroglija povećana je u supstanciji nigra WT miševa, iu striatumu [F(1, 8)=12.74, P=0.0073] i WT i miR{{21} }b2/c KO miševi nakon primjene MPTP-a. Štaviše, kod miR-29b2/c KO miševa MPTP injekcija je značajno smanjila gustinu mikroglija (Slika 4C, 4D).

2. Efekti nedostatka miR-29b2/c u primarno kultiviranim astrocitima

Korišten je test ogrebotina da se testira da li nedostatak miR-29b2/c utiče na proliferaciju i migraciju astrocita. Primarni miR-29b2/c KO astrociti nisu pokazali razliku u sposobnosti proliferacije i migracije. Vijabilnost ćelija primarnih WT i miR-29b2/c KO astrocita nije se manifestovala na početku. Nakon MPP plus intoksikacije, vitalnost ćelija WT astrocita je bila veća u odnosu na kontrolu, dok se vitalnost mutantnih astrocita nije promijenila [F(1, 18)=5.727, P=0.0278 ]. Uočeni su pojačani ROS produkt i unos glukoze u WT i miR-29b2/c KO astrocitima tretiranim MPP plus.

Cistanche tubulosa

Izmjereni su nivoi ekspresije neurotrofnih faktora, molekula povezanih s upalom, astrocitnih A1 tipa i A2 markerskih gena u MPP plus-tretiranim astrocitima. 12 h nakon izazivanja, ekspresija BDNF-a je bila povišena u WT i miR-29b2/c KO astrocitima (Slika 5A). Nivo ekspresije TGF- 1 je značajno povećan u WT astrocitima nakon izlaganja MPP plus, dok je smanjen u miR- 29b2/c KO astrocitima u poređenju sa astrocitima divljeg tipa i na početku i nakon intoksikacija (Slika 5B). Osnovni nivo TNF transkripta bio je niži u miR-29b2/c KO astrocitima u poređenju sa WT astrocitima. Nakon 12 h tretmana, nivoi ekspresije IL-1 , IL-6 i COX-2 su značajno porasli u WT i miR-29b2/c astrocitima, dok TNF transkript bio je povišen samo u WT astrocitima, a transkripti IL-1, TNF i COX-2 smanjeni su u miR-29b2/c KO astrocitnim ćelijama u poređenju sa divljim tipovima (slika 5C) . A1 marker H2-T23 i A2 marker CD14 bili su značajno niži u miR- 29b2/c KO astrocitima tretiranim PBS-om u poređenju sa WT kontrolama. Nakon 12 h tretmana, A1 markeri H2-D1, Ggta1 i C3, i A2 markeri Clcf1 i S100 10 su povećani u WT i miR{46}}b2/c KO astrocitima; H2-T23 povećan samo u WT astrocitima; Gbp2 i CD14 se nisu promijenili u dva genotipa astrocita. Štaviše, transkripti H2-T23, H2-D1 i CD14 su smanjeni u miR-29b2/c KO astrocitima u poređenju sa WT kontrolama (Slika 5D, 5E). 12 h i 24 h nakon tretmana, nivoi AMPK proteina i fosforiliranih-AMPK proteina nisu se promijenili u WT astrocitima, dok se 24 h nakon MPP plus izazova nivo AMPK proteina smanjio u miR-29b2/ c KO astrocitima, a omjer p-AMPK i AMPK u mutantnim astrocitima povećan je u poređenju sa WT astrocitima i PBS-tretiranim mutantnim astrocitima (slika 5F). Dodatno, kondicionirani medij iz BV2 ćelija tretiranih sa PBS ili LPS (kratki naziv CM i LCM) korišten je za stimulaciju primarnih astrocita WT i miR{71}}b2/c KO miševa. Iako ekspresija p-AMPK proteina nije promijenjena nakon 12 h tretmana LCM, bila je značajno viša u miR-29b2/c KO astrocitima u poređenju sa WT astrocitima. Uočili smo da su pAMPK proteini povećani u oba genotipa astrocita nakon 24 tretmana LCM. LCM stimulacija je značajno povećala ekspresiju COX- 2 proteina [F(2, 18)=10.29, P=0.0010], međutim, nivo COX-2 proteina u miR-29b2/c KO astrociti su smanjeni u poređenju sa WT astrocitima (Slika 5G). Koncentracija nitrita u LCM-tretiranim miR-29b2/c KO astrocitima je također bila značajno niža u poređenju sa LCM-tretiranim WT astrocitima [F(2, 30)=17, P<0.0001] (Figure 5H). Further, the expression of senescence marker genes was evaluated. 12 h-treatment of MPP+ increased p53 transcript levels in both WT and miR- 29b2/c KO astrocytes. p19 and Pai1 transcripts were elevated only in WT astrocytes, and Pai1 expression levels in miR-29b2/c KO astrocytes were decreased compared to WT astrocytes after the treatment. Moreover, Bcl-2, Bax protein levels, and the ratio of Bcl-2 to Bax did not change in WT and miR-29b2/c KO astrocytes.

3. Efekti nedostatka miR-29b2/c u primarno kultiviranoj mikrogliji

Za mjerenje odgovora mikroglije s nedostatkom miR-29b2/c na inflamatorne stimuluse korišten je LPS. Nivo ekspresije BDNF bio je niži u miR-29b2/c KO mikroglije na početku. Četiri i osam sati nakon LPS tretmana, količina IL-1, IL-6, TNF i COX{7}} transkripata je povećana, dok je ekspresija IGF-1 smanjena u WT i miR-29b2/c KO mikroglijalne ćelije, ekspresija BDNF se smanjila samo u WT mikroglijama [F(2, 27)=41.5, P<0.0001]. IL-10 transcript increased in WT and miR-29b2/c KO microglia [F(2, 27) = 3.753, P=0.0365], and TGF-β1 transcript decreased in WT microglia at eight hours after the LPS challenge. BDNF and TGF-β1 transcripts were not changed in miR-29b2/c KO microglia. In addition, IL-6 transcripts were significantly reduced in miR-29b2/c KO microglia after the challenge compared to WT controls, IGF-1 and IL-10 transcripts were markedly higher in miR-29b2/c KO microglia after four and eight hours of intoxication, respectively (Figure 6A–6C). At baseline, the p-AMPK protein level and pAMPK to AMPK ratio were dramatically elevated in miR-29b2/c KO microglia when compared with WT microglia. 24 h after the treatment of LPS, p-AMPK level [F(1, 17) = 5.066, P=0.0379] and the ratio [F(1, 17) = 5.537, P=0.0309] were elevated only in WT microglia (Figure 6D). At one hour after the treatment, the phosphorylated-NF-κB p65 (p-p65) proteins and pp65 to p65 ratio, but not p65 proteins, increased in wildtype and miR-29b2/c KO microglial cells, yet the ratio decreased modestly in miR-29b2/c KO microglial cells when compared with WT microglia (p=0.071) (Figure 6E). The expression of COX-2 was enhanced in the two genotypes of microglial cells; whereas, the level of COX-2 in mutant microglia decreased when compared with WT controls after 24 h-treatment of LPS [F(1, 17) = 5.33, P=0.0338] (Figure 6D). Nitrite product was induced by the treatment of LPS in both genotypes of microglia, however, it was dramatically lower in miR- 29b2/c KO microglia at baseline and after the treatment of LPS [F(1, 20) = 14.03, P=0.0013] (Figure 6F).

Diskusija

Ekspresija članova porodice miR-29 se pojačava u više tkiva kada pojedinci stare [30–32]. Radovi iz naše i drugih laboratorija pokazali su vezu između miR-29a i Parkinsonove bolesti [33]. U ovoj studiji proučavana je uloga miR- 29b2/c u starenju i Parkinsonovoj bolesti. miR-29i ispoljavaju pro- i anti-aging efekte u zavisnosti od tkiva, vrste i faza razvoja. Otkrili smo da 3-mjesečni miR-29b2/c KO miševi imaju normalan skelet i masno tkivo, a 4-mjesečni miR- 29b2/c KO miševi pokazali manju tjelesnu težinu u poređenju sa svojim WT kolegom, što je u skladu s drugim studijama [11, 34]. Slabost mišića i nestabilan hod otkriveni su kod 3-mjesečnih miR- 29b2/c KO miševa. Trinaestomjesečni miR-29b2/c KO miševi su pokazali zadebljanje dermisa. Međutim, imali su normalnu finu strukturu kosti femura. Došlo je do smanjenja tjelesne težine kod 16-mjesečnih miR-29b2/c KO miševa. U ovom uzrastu, miR-29b2/c KO miševi su imali manje trbušne masti i smeđe masti i ispoljili su očiglednu kifozu. miR-29 su uključeni u p{35}posredovano zaustavljanje ćelijskog ciklusa [35, 36] i p16/Rb vođeno ćelijsko starenje [37]. Međutim, ćelijsko starenje nije bilo evidentno u miR-29b2/c KO mišjem mozgu. Stoga, iako miR-29b2/c doprinosi regulaciji starenja, njegove uloge u perifernim tkivima i mozgu mogu biti različite.

Nivoi miR-29 u serumu su smanjeni kod pacijenata sa PD u poređenju sa zdravim kontrolama [24]. Ovdje smo otkrili da ekspresija miR-29a u PD mišjem serumu varira od 3 do 120 dana nakon primjene MPTP. miR-29 su u izobilju u mozgu [6, 30]. Prolaskom kroz GEO profil, otkriveno je da je ekspresija miR-29 povećana u substantia nigra pacijenata sa PD (p=0.0059, Mann-Whitney testom), štoviše, miR{{12 }}c ekspresija u gornjem frontalnom girusu nije se razlikovala (p=0.47, Student-T-testom), u poređenju sa kontrolnim subjektima (dodatna slika 10). Ovdje su miR-29b2/c KO miševi bili izazvani MPTP-om da izazovu povrede slične PD. Mutantni miševi su pokazali manje ozbiljne povrede nigrostriatalnog dopaminergičkog sistema i blažu glijalnu aktivaciju, a kasnije i otpornost na ponašanje u određenoj mjeri. Dakle, miR-29b2/c ima štetnu ulogu u patologiji PD. Uočili smo da se u modelu PD kod miša izazvanog MPTP, strijatalni nivoi transkripata p21, p53 i Pai1 nisu promijenili, što sugerira da se možda neće dogoditi ćelijsko starenje. Starenje se smatra faktorom visokog rizika za razvoj PD [38], međutim, promjene u mozgu povezane sa starenjem, posebno u dopaminergičkom sistemu, mogu biti važniji faktor.

Primarna glija iz WT i miR-29b2/c KO miševa uzgajana je kako bi se istražili osnovni mehanizmi. MPP plus tretman je povećao ekspresiju GDNF i smanjio ekspresiju IL-1 u mješovitoj gliji s nedostatkom miR-29b2/c. MPP plus je također povećao ekspresiju proinflamatornih gena u WT astrocitima, ali ne i u miR- 29b2/c-deficijentnim astrocitima. Isto tako, mutantni astrociti su proizveli manje NO u poređenju sa WT astrocitima nakon što su bili izloženi kondicioniranom mediju BV2 ćelija tretiranih LPS-om. U primarnoj kulturi mikroglije, u poređenju sa LPS-tretiranim WT kontrolama, transkripti antiinflamatornog citokina IL-10 i neurotrofičnog faktora IGF-1 bili su značajno viši, a transkripti proinflamatornog citokina IL{ {15}} smanjena LPS-tretirana miR-29b2/c KO mikroglija. Nivoi NO su smanjeni u miR-29b2/c KO mikroglije na početku i nakon intoksikacije LPS-om. Studije su pokazale da su miR{20}}i i mnogi predviđeni ciljni geni uključeni u metaboličke procese [34, 39–41]. Kao esencijalni regulator, dokazano je da AMPK štiti od PD kada se aktivira [42]. Aktivacija AMPK stimuliše Sirtuin 1 i indirektno inhibira aktivaciju NF-κB i nizvodne ciljne gene upale [43]. Uočili smo da su nivo fosforiliranog-AMPK proteina i odnos p-AMPK prema AMPK povećani u LCM-tretiranim i MPP plus-tretiranim miR- 29b2/c KO astrocitima. Nivo COX-2 proteina je smanjen u LCM-tretiranim mutantnim astrocitima u poređenju sa WT astrocitima. Na početku, aktivnost AMPK je bila povišena u miR-29b2/c KO mikroglije. Količina COX-2 proteina je značajno smanjena u miR-29b2/c KO mikroglije u poređenju sa WT kontrolama nakon tretmana LPS. Pod LPS tretmanom, omjer p-p65 i p65 bio je blago smanjen u mutantnoj mikrogliji, što implicira smanjeni NF-κB signalni put. Naši rezultati pokazuju da pojačana aktivnost AMPK i smanjeni upalni odgovor u gliji štite nigrostrijatni put kod miR-29b2/c KO miševa (Slika 6G). Konačno, miR-29b2/c igra važnu ulogu u starenju i oštećenju nigrostrijatalnog dopaminergičkog sistema.

Reference

1. Braak H, Del Tredici K. Pozvani članak: Patologija nervnog sistema kod sporadične Parkinsonove bolesti. Neurologija. 2008; 70:1916–25.

2. Wang Q, Liu Y, Zhou J. Neuroinflamacija kod Parkinsonove bolesti i njen potencijal kao terapijski cilj. Transl Neurodegener. 2015; 4:19.

3. Wang Z, Dong H, Wang J, Huang Y, Zhang X, Tang Y, Li Q, Liu Z, Ma Y, Tong J, Huang L, Fei J, Yu M, et al. Prosurvival i anti-inflamatorne uloge NF-κB c-Rel u modelima Parkinsonove bolesti. Redox Biol. 2020; 30:101427.

4. Zhu S, Wu H, Wu F, Nie D, Sheng S, Mo YY. MikroRNA- 21 cilja tumorske supresorske gene u invaziji i metastazama. Cell Res. 2008; 18:350–59.

5. Qiu L, Zhang W, Tan EK, Zeng L. Dešifriranje funkcije i regulacije mikroRNA u Alchajmerovoj bolesti i Parkinsonovoj bolesti. ACS Chem Neurosci. 2014; 5:884–94.

6. Papadopoulou AS, Serneels L, Achsel T, Mandemakers W, Callaerts-Vegh Z, Dooley J, Lau P, Ayoubi T, Radaelli E, Spinazzi M, Neumann M, Hébert SS, Silahtaroglu A, et al. Nedostatak klastera miR-29a/b-1 dovodi do ataksičnih karakteristika i cerebelarnih promjena kod miševa. Neurobiol Dis. 2015; 73:275–88.

7. Hyun J, Choi SS, Diehl AM, Jung Y. Potencijalna uloga Hedgehog signalizacije i mikroRNA-29 u fibrozi jetre kod miševa s nedostatkom IKK. J Mol Histol. 2014; 45:103–12.

8. Qin W, Chung AC, Huang XR, Meng XM, Hui DS, Yu CM, Sung JJ, Lan HY. TGF-/Smad3 signalizacija promovira renalnu fibrozu inhibiranjem miR-29. J Am Soc Nephrol. 2011; 22:1462–74.

9. Xiao J, Meng XM, Huang XR, Chung AC, Feng YL, Hui DS, Yu CM, Sung JJ, Lan HY. miR-29 inhibira plućnu fibrozu izazvanu bleomicinom kod miševa. Mol Ther. 2012; 20:1251–60.

10. Steiner DF, Thomas MF, Hu JK, Yang Z, Babiarz JE, Allen CD, Matloubian M, Blelloch R, Ansel KM. MikroRNA-29 reguliše faktore transkripcije T-boxa i proizvodnju interferona u pomoćnim T ćelijama. Imunitet. 2011; 35: 169–81.

11. Dooley J, Garcia-Perez JE, Sreenivasan J, Schlenner SM, Vangoitsenhoven R, Papadopoulou AS, Tian L, Schonefeldt S, Serneels L, Deroose C, Staats KA, Van der Schueren B, De Strooper B, et al. Porodica mikroRNA-29 diktira ravnotežu između homeostatskog i patološkog upravljanja glukozom kod dijabetesa i gojaznosti. Dijabetes. 2016; 65:53–61.

12. Adoro S, Cubillos-Ruiz JR, Chen X, Deruaz M, Vrbanac VD, Song M, Park S, Murooka TT, Dudek TE, Luster AD, Tager AM, Streeck H, Bowman B, et al. IL-21 indukuje antivirusnu mikroRNA-29 u CD4 T ćelijama da ograniči HIV-1 infekciju. Nat Commun. 2015; 6:7562.

13. Ma F, Xu S, Liu X, Zhang Q, Xu X, Liu M, Hua M, Li N, Yao H, Cao X. MikroRNA miR-29 kontrolira urođene i adaptivne imune odgovore na unutarćelijsku bakterijsku infekciju ciljanjem interferona- . Nat Immunol. 2011; 12:861–69.

14. Jovičić A, Roshan R, Moisoi N, Pradervand S, Moser R, Pillai B, Luthi-Carter R. Sveobuhvatne analize ekspresije miRNA specifičnih za tip neuralne ćelije identificiraju nove determinante specifikacije i održavanja neuronskih fenotipova. J Neurosci. 2013; 33:5127–37.

15. Ouyang YB, Xu L, Lu Y, Sun X, Yue S, Xiong XX, Giffard RG. MiR-29a obogaćen astrocitima cilja PUMA i smanjuje ranjivost neurona na ishemiju prednjeg mozga. Glia. 2013; 61:1784–94.

16. Shioya M, Obayashi S, Tabunoki H, Arima K, Saito Y, Ishida T, Satoh J. Aberantna ekspresija mikroRNA u mozgu neurodegenerativnih bolesti: miR-29a smanjen u mozgu Alchajmerove bolesti cilja neuronski navigator 3. Neuropathol Appl Neurobiol. 2010; 36:320–30.

17. Hébert SS, Horré K, Nicolaï L, Papadopoulou AS, Mandemakers W, Silahtaroglu AN, Kauppinen S, Delacourte A, De Strooper B. Gubitak klastera mikroRNA miR-29a/b-1 sporadično Alchajmerova bolest korelira sa povećanom ekspresijom BACE1/beta-sekretaze. Proc Natl Acad Sci USA. 2008; 105:6415–20.

18. Johnson R, Zuccato C, Belyaev ND, gostujući DJ, Cattaneo E, Buckley NJ. Put disregulacije gena zasnovan na mikroRNA kod Huntingtonove bolesti. Neurobiol Dis. 2008; 29:438–45.

19. Packer AN, Xing Y, Harper SQ, Jones L, Davidson BL. Bifunkcionalna mikroRNA miR-9/miR-9* reguliše REST i CoREST i smanjena je kod Huntingtonove bolesti. J Neurosci. 2008; 28:14341–46.

20. Nolan K, Mitchem MR, Jimenez-Mateos EM, Henshall DC, Concannon CG, Prehn JH. Povećana ekspresija mikroRNA-29a kod ALS miševa: funkcionalna analiza njegove inhibicije. J Mol Neurosci. 2014; 53:231–41.

21. Roshan R, Shridhar S, Sarangdhar MA, Banik A, Chawla M, Garg M, Singh VP, Pillai B. Obaranje miR-29 specifično za mozak dovodi do smrti neuronskih ćelija i ataksije kod miševa. RNA. 2014; 20:1287–97.

22. Khanna S, Rink C, Ghoorkhanian R, Gnyawali S, Heigel M, Wijesinghe DS, Chalfant CE, Chan YC, Banerjee J, Huang Y, Roy S, Sen CK. Gubitak miR-29b nakon akutnog ishemijskog moždanog udara doprinosi smrti neuralnih ćelija i veličini infarkta. J Cereb Blood Flow Metab. 2013; 33:1197–206.

23. Shi G, Liu Y, Liu T, Yan W, Liu X, Wang Y, Shi J, Jia L. Povećana regulacija miR-29b promoviše smrt neuronskih ćelija inhibiranjem Bcl2L2 nakon ishemijske ozljede mozga. Exp Brain Res. 2012; 216:225–30.

24. Bai X, Tang Y, Yu M, Wu L, Liu F, Ni J, Wang Z, Wang J, Fei J, Wang W, Huang F, Wang J. Smanjenje regulacije mikroRNA u krvnom serumu 29 porodice kod pacijenata sa Parkinsonovom bolešću . Sci Rep. 2017; 7:5411.

25. Han L, Tang Y, Bai X, Liang X, Fan Y, Shen Y, Huang F, Wang J. Udruženje serumske mikroRNA{1}} porodice sa kognitivnim oštećenjem kod Parkinsonove bolesti. Starenje (Albany NY). 2020; 12:13518–28.

26. Chinta SJ, Woods G, Demaria M, Rane A, Zou Y, McQuade A, Rajagopalan S, Limbad C, Madden DT, Campisi J, Andersen JK. Ćelijsko starenje je izazvano neurotoksinom iz okoline parakvatom i doprinosi neuropatologiji povezanoj sa Parkinsonovom bolešću. Cell Rep. 2018; 22:930–40.

27. Willard AM, Bouchard RS, Gittis AH. Diferencijalna degradacija motoričkih deficita tokom postepenog iscrpljivanja dopamina sa 6-hidroksidopaminom kod miševa. Neuroscience. 2015; 301:254–67.

28. Kam TI, Mao X, Park H, Chou SC, Karuppagounder SS, Umanah GE, Yun SP, Brahmachari S, Panicker N, Chen R, Andrabi SA, Qi C, Poirier GG, et al. Poli(ADP-riboza) pokreće patološku -sinukleinsku neurodegeneraciju kod Parkinsonove bolesti. Nauka. 2018; 362:eaat8407.

29. Huang D, Xu J, Wang J, Tong J, Bai X, Li H, Wang Z, Huang Y, Wu Y, Yu M, Huang F. Dinamičke promjene u nigrostrijatalnom putu u MPTP mišjem modelu Parkinsonove bolesti. Parkinsonova bolest 2017; 2017:9349487.

30. Ugalde AP, Ramsay AJ, de la Rosa J, Varela I, Mariño G, Cadiñanos J, Lu J, Freije JM, López-Otín C. Starenje i hronična reakcija oštećenja DNK aktiviraju regulatorni put koji uključuje miR{{2} } i p53. EMBO J. 2011; 30:2219–32.

31. Hu Z, Klein JD, Mitch WE, Zhang L, Martinez I, Wang XH. MikroRNA-29 indukuje ćelijsko starenje u mišićima koji stare preko više signalnih puteva. Starenje (Albany NY). 2014; 6:160–75.

32. Fenn AM, Smith KM, Lovett-Racke AE, Guerau-deArellano M, Whitacre CC, Godbout JP. Povećana mikroRNA 29b u ostarjelom mozgu korelira sa smanjenjem faktora rasta sličnog insulinu-1 i fraktalkinskog liganda. Neurobiol Aging. 2013; 34:2748–58.

33. Wang R, Yang Y, Wang H, He Y, Li C. MiR-29c štiti od upale i apoptoze u modelu Parkinsonove bolesti in vivo i in vitro ciljajući SP1. Clin Exp Pharmacol Physiol. 2020; 47:372–82.

34. Caravia XM, Fanjul V, Oliver E, Roiz-Valle D, Morán-Álvarez A, Desdín-Micó G, Mittelbrunn M, Cabo R, Vega JA, Rodríguez F, Fueyo A, Gómez M, LoboGonzález M, et al. Regulatorna os mikroRNA-29/PGC1 je kritična za metaboličku kontrolu srčane funkcije. PLoS Biol. 2018; 16:e2006247.

35. Varela I, Cadiñanos J, Pendás AM, Gutiérrez-Fernández A, Folgueras AR, Sánchez LM, Zhou Z, Rodríguez FJ, Stewart CL, Vega JA, Tryggvason K, Freije JM, LópezOtín C. Accele de 2. proteaza je povezana sa aktivacijom signalizacije p53. Priroda. 2005; 437:564–68.

36. Park SY, Lee JH, Ha M, Nam JW, Kim VN. miR-29 miRNA aktiviraju p53 ciljajući p85 alfa i CDC42. Nat Struct Mol Biol. 2009; 16:23–29.

37. Martinez I, Cazalla D, Almstead LL, Steitz JA, DiMaio D. miR-29 i miR-30 regulišu ekspresiju B-Myb tokom ćelijskog starenja. Proc Natl Acad Sci USA. 2011; 108:522–27.

38. Collier TJ, Kanaan NM, Kordower JH. Starenje i Parkinsonova bolest: različite strane istog novčića? Mov Disord. 2017; 32:983–90.

39. Massart J, Sjögren RJ, Lundell LS, Mudry JM, Franck N, O'Gorman DJ, Egan B, Zieath JR, Krook A. Izmijenjena miR- 29 ekspresija kod dijabetesa tipa 2 utječe na metabolizam glukoze i lipida u skeletu Muscle. Dijabetes. 2017; 66:1807–18.

40. Dooley J, Lagou V, Garcia-Perez JE, Himmelreich U, Liston A. miR-29a-deficijencija ne modificira tok mišjeg acinarnog karcinoma pankreasa. Oncotarget. 2017; 8:26911–17.

41. Kwon JJ, Factora TD, Dey S, Kota J. Sistematski pregled miR-29 kod raka. Mol Ther Oncolytics. 2018; 12:173–94.

42. Lu M, Su C, Qiao C, Bian Y, Ding J, Hu G. Metformin sprečava smrt dopaminergičkog neurona u modelu Parkinsonove bolesti izazvanom MPTP/PI kod miša putem autofagije i mitohondrijske ROS klirensa. Int J Neuropsychopharmacol. 2016; 19:pyw047.

43. Salminen A, Hyttinen JM, Kaarniranta K. AMP-aktivirana protein kinaza inhibira NF-κB signalizaciju i upalu: utjecaj na zdravlje i životni vijek. J Mol Med (Berl). 2011; 89:667–76.

Xiaochen Bai 1,2, Xiaoshuang Zhang 1, Rong Fang 1, Jinghui Wang 1, Yuanyuan Ma 1, Zhaolin Liu 1, Hongtian Dong 1, Qing Li 1, Jingyu Ge 1, Mei Yu 1, Jian Fei 3,4, Ruilin Sun 4, Fang Huang 1

1. Odsjek za translacijsku neuronauku, bolnica okružnog centra Jing'an u Šangaju, Državna ključna laboratorija za medicinsku neurobiologiju i MOE Frontiers Centar za nauku o mozgu, Instituti za nauku o mozgu, Univerzitet Fudan, Šangaj 200032, Kina

2. Odsjek za rehabilitacijsku medicinu, Šesta narodna bolnica pridruženog univerziteta Jiao Tong u Šangaju, Šangaj 200233, Kina

3. Škola prirodnih nauka i tehnologije, Univerzitet Tongji, Šangaj 200092, Kina

4. Shanghai Engineering Research Center for Model Organisms, Shanghai Model Organisms Center, INC, Šangaj 201203, Kina