Poređenje između QPCR i RNA-seq otkriva izazove kvantifikacije HLA ekspresije, 2. dio

Normalizacija

Koristili smo procjene ekspresije u transkriptima na milion (TPM), što je standardna normalizacija koju proizvodi Salmon i koja odgovara relativnoj količini datog transkripta u uzorku. Za bilo koji gen, procjena je jednostavno zbir TPM-ova za njegove transkripte. U nekim slučajevima kada prikazujemo standardne normalne transformisane procjene, izvršili smo rang normalnu transformaciju RNAseq podataka koristeći GenABEL R paket (Aulchenko et al. 2007), koji se obično primjenjuje, na primjer, u linearnim modelima eQTL mapiranja (Delaneau et al. 2017).

QTL mapiranje je metoda za proučavanje regulatornog mehanizma ekspresije gena upoređivanjem povezanosti između ekspresije gena i polimorfizma gena u populaciji. Linearni model je uobičajena metoda eQTL mapiranja, koja može koristiti model linearne regresije za procjenu korelacije između ekspresije gena i polimorfizma gena.

Imuni sistem je složen biološki sistem koji štiti organizam od infekcija i bolesti kao što je rak. Regulacija ekspresije gena igra važnu ulogu u imunološkom sistemu i može utjecati na razvoj, diferencijaciju i funkciju imunoloških stanica.

Stoga se linearni modeli eQTL mapiranja mogu koristiti za analizu odnosa između regulatornih mehanizama ekspresije gena i imuniteta. Na primjer, proučavanje korelacije između određenog genotipa i ekspresije ključnog imunološkog gena u populaciji može otkriti utjecaj ovog genotipa na regulaciju ekspresije imunoloških gena. Takva istraživanja mogu pružiti važno prosvjetljenje za liječenje i prevenciju imunoloških bolesti. To pokazuje važnost imuniteta, tako da svoj imunitet treba da poboljšavamo svaki dan. Mljeveno meso ima i antivirusna, antikancerogena i druga dejstva, koja mogu ojačati imunitet. Sposobnost sistema da se odupre i poboljša imunitet organizma.

Kliknite na zdravstvene prednosti cistanchea

Pročitajte poravnanje prema referentnom genomu

Za analizu pokrivenosti čitanjem kod HLA gena prikazanih na slici S7, uskladili smo čitanja sa referentnim genomom GRCh38 sa STAR v2.7.3a (Dobin et al. 2013), koristeći napomene gena Gencode v37. Kako bismo kontrolirali pristrasnost mapiranja kod HLA gena, dalje smo obrađivali BAM datoteke pomoću hlamappera v4.3 (Castelli et al. 2018).

Simulacija

Podaci o osnovnoj istini

Za generiranje simuliranih podataka, prvo smo pokrenuli Salmon v1.3.0 (Patro et al. 2017) na stvarnom uzorku #66K00003 da naučimo nivoe ekspresije Gencode v37 transkripata. Zatim smo koristili poliesterski paket (v1.26.0) da generišemo 50 sintetičkih uzoraka sa identičnim nivoima ekspresije u celom transkriptomu, osim za HLA-A, -B i -C. Nivoi ekspresije ovih gena su zasnovani na 50 nasumično odabranih pojedinaca iz naših stvarnih podataka (za koje imamo dostupne podatke o HLA alelu). Za svaki HLA gen odabrali smo izoforme koje su činile najmanje 90 posto ukupne ekspresije transkripta koji kodira proteine ​​u testu Salmon na stvarnom skupu podataka (što je rezultiralo samo 1 transkriptom po genu) i personalizirali sekvence transkripta prema HLA alele koje nosi svaki pojedinac.

Ova procedura nam je omogućila da sintetički generišemo 50 individua sa identičnim nivoima ekspresije u pozadini, ali sa varijabilnom HLA ekspresijom i sa HLA polimorfizmom ugrađenim u simulirana očitavanja.

Kako bismo odrazili naše stvarne podatke, simulirano je trideset miliona čitanja uparenih krajeva od 126 bp sa srednjom veličinom fragmenta od 261 bp za svakog pojedinca, koristeći zadane postavke za druge parametre poliestera (npr. standardnu ​​devijaciju dužine fragmenta=25 bp, stopa greške=0.005, ujednačena distribucija čitanja i bez pristrasnosti). Poliester proizvodi FASTA fajlove, od kojih smo proizveli FASTQ fajlove sa konstantnom ocenom kvaliteta (odgovarajući simbol "F").

metrika za tačnost

TPM-ovi su izračunati na osnovu simuliranih brojeva s obzirom na dužine transkripta i prosječnu veličinu fragmenta od 261 bp. Omjer "Procijenjeni TPM/Pravi TPM" se koristi za procjenu performansi u obnavljanju simuliranih nivoa ekspresije i omogućava nam da uočimo smanjenje ili precijenjenje.

Grafika

Sve planove u ovom članku pripremili smo koristeći paket ggplot2 v3.3.2 (Wickham 2016) u R.

Rezultati

Preciznost kvantifikacije RNA-seq HLA

S obzirom na nepostojanje metode koja se može smatrati eksperimentalnim zlatnim standardom za kvantifikaciju ekspresije HLA iz RNA-seq podataka, u početku smo procijenili tačnost metoda kvantifikacije RNA-seq za HLA koristeći simulirane podatke gdje su poznati pravi nivoi ekspresije otkako su generirani u kompjuteru za oponašanje stvarnih eksperimenata. Ovo je učinjeno kako bi se odabrao najbolji računski pristup među metodama zasnovanim na RNA-seq, omogućavajući naknadni kontrast sa pristupima koji nisu RNA-seq.

Simulirali smo RNA-seq eksperiment za 50 osoba koristeći poliesterski paket (Frazee et al. 2015). Ove sintetičke individue imaju iste nivoe ekspresije za sve gene u genomu, osim za HLA-A, -B i -C, za koje smo varirali nivoe ekspresije. Također smo personalizirali označene sekvence HLA transkripta iz Gencode v37 kako bismo uveli stvarnu genetsku varijaciju uočenu kod nasumično odabranih pojedinaca iz skupa podataka od 96 osoba (koje su HLA genotipizirane Sangerovim sekvenciranjem kako je opisano u nastavku). Rezultirajući personalizirani transkripti imali su središnji identitet sekvence sa referencom većom od 95 posto za sve HLA lokuse.

Uporedili smo procene ekspresije HLA dobijene pomoću dve bioinformatičke metode: (1) "Ref transkriptom", koji koristi Salmona (Patro et al. 2017) za usklađivanje čitanja sa standardnim referentnim transkriptomom, kvantificirajući obilje transkripta i (2) "Personalizovano," koji takođe koristi lososa, ali mapira čitanje personalizovanih HLA transkripta, odražavajući HLA genotip pojedinca (slika 1). „Personalizovani“ pristup proširuje našu prethodnu strategiju (Aguiar et al. 2019) korišćenjem personalizovanog transkripta, umesto jedne kanonske sekvence kodiranja za svaki alel koji nosi pojedinac.

Metoda "Ref transkriptoma" potcijenila je nivoe ekspresije, posebno za alele sa većim udjelom razlika sekvenci u odnosu na referentni genom (slika 1). Ovo je očekivano jer veća stopa neusklađenosti između očitavanja i reference negativno utiče na poravnanje (Brandt et al. 2015). Ovaj pristup je takođe precijenio ekspresiju HLA-C za neke pojedince, što je posljedica mapiranja očitavanja iz HLA-B u referentne transkripte HLA-C (slika S1). „Personalizovani“ pristup, s druge strane, kontroliše pristrasnost mapiranja i postiže optimalnu tačnost.

Iako naša simulacija daje ohrabrujuće rezultate u pogledu kvantifikacije ekspresije HLA pomoću RNAseq-a, moramo uzeti u obzir neka upozorenja. Modificirali smo sekvencu označenih izoforma prema HLA alelima pojedinaca koristeći jedan skup izoforma za sve alele na datom HLA genu. Te sekvence su korišćene kako u simulaciji čitanja tako iu kvantifikaciji ekspresije; stoga očekujemo optimalnu tačnost. U stvarnom scenariju, različiti HLA aleli mogu biti povezani s različitim izoformama. Kasnije u ovom radu raspravljamo o specifičnom primjeru koji smo uočili za HLA-A, u skladu s hipotezom da su određene izoforme isključive za specifične alele. Ipak, s obzirom da nas uglavnom zanimaju procjene ekspresije na nivou gena i HLA alela, očekujemo da personalizirane sekvence predstavljaju poboljšanje u odnosu na jedan referentni transkriptom smanjenjem pristranosti mapiranja.

Procjena ekspresije HLA iz stvarnih RNA-seq podataka

Izvršili smo procjenu ekspresije na podacima RNA-seq cijelog transkriptoma za 96 osoba, za koje su prethodno procijenjeni qPCR za HLAA, -B i -C i HLA-C površinske ekspresije (Kulkarni et al. 2013; Ramsuran et al. 2015, 2017), i može se koristiti za poređenje sa rezultatima RNAseq-a (vidi Sliku S2 za QC analize na RNA-seq podacima).

S obzirom na veću preciznost personaliziranog pristupa u simulaciji, ovu metodu procjene ekspresije zasnovane na RNA seq suprotstavljamo metodi drugih ne-RNA-seq pristupa, ali pružamo rezultate za referentne pristupe zasnovane na transkriptomima u "Dopunskim informacijama. " Personalizirali smo sekvence transkripta s obzirom na pojedinačne HLA genotipove dobijene Sanger sekvenciranjem. Proveli smo HLApers (Aguiar et al. 2019) i Kourami (Lee i Kingsford 2018) da zaključimo alele direktno iz RNA-seq podataka i potvrdimo Sangerove pozive (pogledajte "Materijali i metode").

Procjene ekspresije na nivou gena pokazuju da HLA-B ima najveću ekspresiju među HLA lokusima u našem skupu podataka, a slijede HLA-C i HLA-A (slika 2A). Ovaj poredak je u skladu sa GTEx skupom podataka pune krvi (GTEx Consortium 2020) i s prethodnom metodom HLA-hvatanja RNAseq primijenjenoj na PBMC (Yamamoto et al. 2020). Međutim, ovaj obrazac se razlikuje od onog koji su vidjeli Boegel i suradnici (2018), koji su uočili slične nivoe u genima koristeći drugačiju strategiju za postupanje s mapiranjem čitanja na više lokusa, što može doprinijeti nedostatku razlike između lokusa u smislu nivoa ekspresije ). Buduće studije će morati da razdvoje doprinos razlika u metodologijama ili sastavu ćelijskog tipa ovim razlikama.

Poređenje RNA-seq i qPCR na stvarnim podacima

Zatim smo uporedili procene ekspresije RNA-seq sa onima dobijenim pomoću qPCR (slika 2B). Iako je korelacija između RNA-seq i qPCR ekspresije bila statistički značajna za sve gene (p=0.024, 0.002, 0.000000016, za HLA-A, -B i -C, respektivno; Spearmanov test za pozitivnu povezanost), veličina korelacije je bila skromna za HLA-A i -B, a veća za -C. Upotreba personalizovane reference za RNA-seq skromno je povećala korelaciju sa qPCR u poređenju sa standardnom referencom (slika S3). Ovo se slaže s našim prethodnim zapažanjem da se procjene ekspresije na nivou gena ne razlikuju bitno između pristupa zasnovanog na referentnom genomu ili personaliziranih pristupa za gene HLA klase I (Aguiar et al. 2019), pri čemu su glavne prednosti personaliziranih pristupa procjene na Nivo HLA alela, koji istražujemo u nastavku. Upotreba korekcije pristranosti kod lososa (GC pristranost, pristranost specifična za sekvencu i pristranost specifična za poziciju) poboljšava korelaciju sa qPCR, sa najvećim uticajem za HLA-B (uporedite slike 2B i S4, za ispravljene i nekorigovane podatke, odnosno).

Poređenje nivoa mRNA sa površinskom ekspresijom

Budući da je ekspresija RNK informativna o početnim koracima ćelijske signalizacije i odgovora na podražaje, analiza njenog odnosa sa nizvodnim molekularnim fenotipovima (kao što je ekspresija proteina na površini ćelije) može nam pomoći da razumijemo ulogu post-transkripcione i post-translacijske regulacije na HLA ekspresija. Razlike između RNK i obilja proteina su očekivane jer su podložne različitim načinima regulacije. Tehnički efekti također mogu unijeti razlike jer se tehnike RNK i proteina razlikuju i na njih utiču nekorelirani tipovi grešaka (Li i Biggin 2015; Kaur et al. 2017; Carey et al. 2019). Nadalje, u slučaju naše studije, ekspresija gena je mjerena na ukupnim PBMC, dok je ekspresija proteina mjerena na sortiranim CD3 plus ćelijama. Imajući na umu ovu razliku, izmjerili smo stepen do kojeg se HLA protein na površini ćelije može predvidjeti ekspresijom mRNA. Ova analiza je urađena isključivo za HLA-C jer je to jedini lokus za koji je dostupno antitijelo koje može vezati sve alele sa jednakim afinitetima. Zanimljivo je da je postojala visoka korelacija između mRNA i ekspresije proteina za HLAC, sa nešto višom korelacijom za RNA-seq (slika 2C).

Ekspresija na nivou alela HLA

HLA geni sadrže regulatorne elemente povezane s konstitutivnom transkripcijom i dinamički aktiviranom transkripcijom (René et al. 2016). Kao rezultat toga, ekspresija HLA varira u različitim tkivima i može se modulirati regulatornim mrežama koje pokreću različiti stimulansi (Anderson 2018; Carey et al. 2019). Sve je veći interes za razumijevanje da li su različiti HLA aleli povezani s različitim bazalnim nivoima ekspresije i regulatornim programima (Aguiar et al. 2019; Gutierrez-Arcelus et al. 2020), i da li ova varijacija doprinosi fenotipovima bolesti ili ishodima transplantacije (Petersdorf et al. 2014, 2015; René i dr. 2016; Bettens i ostali 2022; Johansson i drugi 2022). Stoga su upoređene procjene nivoa ekspresije HLA alela za qPCR i RNA-seq. Budući da su pojedinačni aleli često prilično rijetki u skupu podataka, grupisali smo ih prema alelnim linijama (tj. grupama alela koje su filogenetski definirane odnosom egzona) (Elsner et al. 2002).

Klasirali smo loze prema njihovim nivoima ekspresije na osnovu podataka RNA-seq i qPCR i procenili podudarnost rangiranja među metodama (slika 3). Naš personalizirani RNA-seq pristup direktno pruža procjene na nivou alela, budući da se sekvence alela HLA koriste za indeksiranje poravnanja, tako da smo poredali alelne loze prema njihovim srednjim nivoima ekspresije. Budući da su naše procjene ekspresije qPCR-a na nivou gena i ne daju direktno procjene na nivou alela, naručili smo alelne loze prema njihovim efektima u linearnom modelu nivoa ekspresije koji je objašnjen HLA genotipom (vidi Ramsuran et al. 2015). Na slici 3, vrednosti ekspresije su dva puta ucrtane za svaki nivo za svaki alel pojedinca, a za qPCR, to je jednostavno dva puta ucrtana ekspresija na nivou gena, odražavajući prisustvo dva alela.

Redoslijed procjena ekspresije je sličniji između RNA-seq i qPCR za HLA-C nego za -A i -B (prosječna apsolutna razlika u redoslijedu, gdje se razlika u redoslijedu odnosi na uočenu razliku u pozicijama unutar rangiranog reda vrijednosti ekspresije , između RNA-seq i qPCR kvantifikacije, od 2,3 za HLA-C, 3,1 za -A i 3,9 za -B), slijedeći sličan obrazac slaganja sa ekspresijom na nivou gena, za koju smo pronašli najveću korelaciju između RNA-seq i qPCR za HLA-C.

Među lozama sa najvećom razlikom između RNA-seq i qPCR je A*11. Izmjerili smo površinsku ekspresiju na podskupu heterozigota za A*03 ili A*11 koristeći antitelo koje ima jednak afinitet za obe loze i primetili da qPCR robusnije korelira sa ekspresijom na površini ćelije ova dva alotipa nego RNA-seq (Sl. S5). Zatim, predstavljamo opsežniju procjenu rasporeda alela kroz poređenje s prethodnim studijama ekspresije HLA mRNA.

Iako postoji interes za poređenje razlika u ekspresiji između HLA alela, različite studije pokazuju da su varijacije u ekspresiji unutar alela ili alelne loze često prilično velike, a razlike između alela različitih rangova često su male i beznačajne. Kao posljedica toga, može biti nerealno očekivati ​​održavanje rangova u više alela, a možda bi bilo poželjno upoređivati ​​procjene ekspresije za alele u ekstremima ekspresije.

Za naše RNA-seq podatke, upoređujemo naše procjene s onima iz dva prethodna HLA pristupa RNA-seq na PBMC-ima. Općenito postoji dobra podudarnost sa Yamamoto et al. (2020), gdje su A*24, A*02, C*04 i C*06 visoko izraženi, a A*03, C*03 i B*15 su izraženi na niskim nivoima, iako vidimo i razlike kao što su što se tiče B*35, što bi se više slagalo sa našim qPCR podacima. Kada uporedimo naše RNA-seq podatke sa Johansson et al. (2021), međutim, vidimo mnogo više razlika, iako imaju vrlo male uzorke za mnoge loze.

Takođe smo uporedili naše rezultate sa onima iz dve prethodne qPCR studije koje su primenjivale prajmere specifične za alele. Bettens et al. (2014) koristili su alel-specifične prajmere za neke HLAC loze i vidjeli su C*04 i C*06 kao visoko eksprimirane, dok su C*07 i C*03 eksprimirani na niskim razinama, u skladu s onim što imamo za oba RNA-seq i qPCR. René i dr. (2015) primijenili su alel-specifične prajmere za HLA-A i uočili A*02 (visoki) i A*29 (niski) na ekstremima ekspresije, što se više slaže s našim RNAseq rezultatima nego našim qPCR; međutim, vidimo mnoge razlike u drugim alelnim linijama

U nekim slučajevima možemo ocijeniti i slaganje s funkcionalnim studijama. Na primjer, prethodne analize mjesta vezivanja faktora transkripcije (TFBS) i aktivnosti promotora (pregledane u Anderson 2018), te studije o regulaciji miRNA (Kulkarni et al. 2011), pokazuju da su C*03 i C*07 slabo izraženi aleli, što se slaže sa našim zapažanjima i za RNA-seq i za qPCR.

Potencijalni izvori razlika

Zatim smo istražili da li je obrada uzoraka korištenih za RNA-seq mogla doprinijeti razlikama između procjena ekspresije dobijenih pomoću qPCR-a i RNA-seq-a.

Jedna posebna briga bila je dužina vremena u kojem su uzorci bili pohranjeni u zamrzivaču na -80 stepeni (otprilike 4 godine između qPCR i RNA-seq testova), kao i drugi koraci specifični za RNA-seq eksperiment, uključujući odmrzavanje uzoraka. Da bismo to riješili, izveli smo drugi RNAseq eksperiment na svježoj krvi ponovo nacrtanoj od 11 osoba, koje su podskup od 96 analiziranih u ovoj studiji, i uporedili smo procjene ekspresije između dvije vremenske tačke. Iako ovaj drugi test nosi i tehničke i biološke razlike u odnosu na prvi RNA-seq eksperiment (sl. S6A i B), korelacija na nivou transkriptoma u procjenama ekspresije između vremenskih tačaka je visoka (slika S6C).

Iako procjena korelacije sa 11 pojedinaca može biti bučna, korelacije na HLA genima su među najvećim genskim korelacijama između dva uzorka (sl. S6D i F). Također smo izračunali omjer alela unutar pojedinca, koji je omjer ekspresije između dva HLA alela heterozigotne osobe, i uporedili ih između vremenskih tačaka. Korelacija je bila veća od 0.94 za HLA-A, -B i -C (slika S6E). Stoga nismo vidjeli dokaze o velikom doprinosu degradacije RNK koji bi objasnio nisku korelaciju između RNA-seq i qPCR u našem originalnom uzorku.

Drugi mogući doprinos razlikama između RNA-seq-a i qPCR-a je da specifični HLA alel može biti više pristrasan u jednoj ili drugoj metodi, u kom slučaju bi pojedinci koji nose takve alele doprinijeli velikim razlikama. Na primjer, za osobe koje nose A*03, ili za homozigote za C*07, postoji negativna veza između qPCR i RNA-seq (slika 4A).

Dodatni izvor razlika između metoda može proizaći iz činjenice da, u našem RNA-seq pristupu, personaliziramo sve transkripte označene Gencode-om za svaki HLA alel; međutim, prava raznolikost transkripta i njegova povezanost sa specifičnim HLA alelima nisu dobro shvaćeni. Na primjer, Kulkarni et al. (2017) su pokazali da A*01 i A*11 proizvode kraće 3′-UTR. Da bismo istražili možemo li ponoviti to financiranje u našim RNA-seq podacima, mapirali smo očitanja na referentni genom i ispravili za mapiranje pristranosti kod HLA gena pomoću hla-mappera (Castelli et al. 2018). Zaista, za pojedince koji nose A*01 ili A*11, pokrivenost očitavanjem na 3′-UTR HLA-A pokazuje oštar pad na ~120 bp prije označenog kraja gena (slika S7).

Budući da se vrijednosti transkripta na milion (TPM) izračunavaju uzimajući u obzir referentnu dužinu, korištenje reference koja je duža od pravog transkripta dovodi do potcjenjivanja izraza. Pokušali smo da kontrolišemo mogućnost takvih kraćih transkripata uključivanjem verzije svakog HLA-A transkripta sa skraćenim 3′-UTR u naš indeks za poravnanje čitanja. Međutim, nismo pronašli dokaze o ekspresiji kraće izoforme (slika S8), vjerovatno zato što su ove kraće izoforme sadržane u izoformama normalne dužine, a Salmonova implementacija dodjeljuje sva čitanja većoj izoformi. Zanimljivo je da ekspresija na nivou izoforme otkriva izoformu sa dužim 5′-UTR ekskluzivno za A*11, što doprinosi velikom udjelu ukupne ekspresije za ovaj alel (slika S8).

Također smo testirali normalizaciju naših procjena ekspresije, u kojoj smo prilagodili dužine čitanja s obzirom na pokrivenost čitanja koja podržava proksimalni ili distalni 3′-UTR završetak (ponderisani prosjek dužina transkripta koristeći pokrivenost čitanja kao težine). Iako primjećujemo povećanje do 20 posto u nivoima ekspresije za osobe koje nose A*01 i/ili A*11, vidimo samo malo poboljšanje u korelaciji sa qPCR nakon ovog prilagođavanja (od rho=0. 20 na slici 2 do rho=0.24 na slici 4B).

A*01 i A*11 su među alelima sa najvećim razlikama u rangu između RNA-seq i qPCR (slika 3), a nesavršen prikaz njihovih povezanih transkripata u napomeni može uvesti pristrasnost u našim procjenama RNA-seq.

Konačno, metode normalizacije koje se koriste za dobijanje konačnih procjena ekspresije iz sirovih qPCR podataka također mogu biti izvor razlika između qPCR i RNA-see procjena. Kvantitativni PCR testovi za gene HLA klase I obično pojačavaju regije unutar eksona 1 do 4, a standardizacija ekspresijom kućnog gena kao što je B2M (2-mikroglobulin) se obično provodi (kao što je bio slučaj u ovoj studiji). ). Obrazloženje za ovu proceduru je da ako su nivoi ekspresije standardizovani stabilno izraženom referencom, procene za različite pojedince se stavljaju na istu skalu, što omogućava poređenje među pojedincima.

B2M kodira laki lanac u molekulu HLA klase I, i vjerovatno je da geni B2M i HLA klase I imaju određenu koordinaciju ekspresije, budući da dijele slične promotorske arhitekture (Kobayashi i van den Elsen 2{{1{{12} }}}12; Vijayan et al. 2019), i može se regulisati zajedničkim faktorima transkripcije (na primjer, NLRC5/CITA inducira ekspresiju i HLA klase I i B2M u Jurkat ćelijskim linijama (Meissner et al. al. 2{{20}}10). Normalizacija ekspresije HLA gena koreliranim vrijednostima može uvesti pristrasnost u našim qPCR procjenama, posebno za HLA-B, za koji vidimo visoku korelacija sa B2M ekspresijom (slika 4C). Skaliranje varijable drugom, ali koreliranom varijablom može dovesti do perturbacije dovođenjem ekstremnih vrijednosti u sredinu distribucije i smanjenjem varijanse; u skladu s ovom hipotezom, koeficijenti varijacije za qPCR podatke su 0,61 i 0,50 za HLA-A i -C, respektivno, ali pada na 0,17 za HLA-B (za poređenje, CV za RNA-seq podatke su 0,20, 0,14 i 0,29 za HLA-A, -B i -C , odnosno). Međutim, koristeći isti qPCR dizajn, Ramsuran et al. (2017) normalizovao je HLA-B ekspresiju bilo B2M, GAPDH, 18 s i b-Actin genom i uočio vrlo konzistentne rezultate, koji ne podržavaju uticaj normalizacije B2M na qPCR procjene.

Diskusija

Pouzdane procene ekspresije HLA transkripta mogu doprineti različitim istraživačkim pitanjima, i iako se ishod bolesti često istražuje u kontekstu varijacija kodiranja HLA, nivoi ekspresije će takođe verovatno objasniti varijacije u kliničkim ishodima (pregledano u Dendrou et al. 2018; i u Johansson et al. 2022). Nivoi ekspresije takođe imaju potencijal da donesu odluke prilikom planiranja transplantacije hematopoetskih matičnih ćelija; na primjer, ako savršeno podudaranje nije dostupno u selekciji za alogene donore, čini se da je korisno odabrati one koji se ne podudaraju na alelima niske ekspresije (Petersdorf et al. 2014, 2015). Pouzdane procene ekspresije transkripta mogu takođe pomoći u identifikaciji eQTL-ova koji su u osnovi kontrole ekspresije HLA, koji bi se mogli integrisati u nalaze GWAS-a, ispitivanjem da li se poznati pogoci u MHC regionu poklapaju sa eQTL-ovima za HLA gene (vidi, npr. tabelu S6 u Aguiar et al. 2019.). Općenito, poboljšane procjene ekspresije HLA transkripta pomoći će nam da razumijemo genetsku arhitekturu regulacije HLA, identifikujući relativni doprinos varijanti koje djeluju na cis (tj. onih u susjedstvu HLA gena koji regulišu) i varijanti transakcije (one u udaljenim genomske lokacije, uključujući i druge hromozome). Ovo će pružiti informacije u vezi sa stepenom do kojeg je varijacija u ekspresiji HLA alel-specifična osobina naspram međuindividualne karakteristike nezavisne od alelnog identiteta (videti Bettens et al. 2022).

Kvantitativne PCR tehnike su nam omogućile da otkrijemo povezanost između ekspresije HLA i fenotipova bolesti. U skorije vrijeme, RNA-seq je postao metoda izbora za procjenu ekspresije gena u velikim skupovima podataka cijelog transkriptoma različitih populacija. Biti u stanju izvući tačne informacije za ekspresiju HLA iz takvih podataka je važan izazov, a za postizanje ovog cilja predložene su mnoge metode. Međutim, trenutno nije poznat stepen u kojem se rezultati koji proizilaze iz RNA-seq analiza slažu sa onima akumuliranim upotrebom qPCR. Iako ove metode ciljaju na isti molekularni fenotip (broj RNK), one se značajno razlikuju u korištenim eksperimentalnim tehnikama, oblicima analize i normalizacije podataka, bioinformatičkim procedurama i pristranostima kojima su podložni.

Prema našim saznanjima, prethodne studije koje su upoređivale HLA prilagođene RNA-seq pristupe sa qPCR-om uključivale su male uzorke. Na primjer, Johansson et al. (2021) potvrdili su svoj HLA-ciljani RNA-sek sa qPCR-om na samo 5 uzoraka na HLA-C, finansirajući Pearsonov koeficijent korelacije od 0,9, što nije bilo značajno (p=0.08) .

U ovoj studiji uporedili smo kvantitativne PCR i RNA-seq procjene ekspresije za klasični HLA gen klase I HLA-A, -B i -C u podudarnom skupu od 96 osoba. Pronašli smo skromne, ali značajne korelacije u ekspresiji na uzorku od 96 osoba. S obzirom na nedostatak zlatnog standarda sa kojim bi se uporedile ove procjene, greške u procjeni i pristranosti povezane s obje metode mogu doprinijeti ukupnom rezultatu.

Istražili smo efekte različitih faktora koji mogu objasniti nisku korelaciju između RNA-seq i qPCR procjena, kao što je loša procjena ekspresije za specifične HLA alele i normalizacija pomoću jednog gena za održavanje kućanstva u qPCR-u. Naši rezultati se ne mogu generalizirati na svaki qPCR dizajn ili RNA-seq cjevovod, za koji postoji širok izbor različitih pristupa. Međutim, prema našim saznanjima, ovo je prvo direktno poređenje između qPCR i RNA-seq za procjenu ekspresije HLA.

Naša studija sugerira područja koja zahtijevaju poboljšanje u određivanju ekspresije HLA transkripta. Poređenja između RNA-seq i qPCR, na primjer, trebale bi koristiti jednoobraznu obradu uzoraka kroz različite metode (npr. isti protokol izolacije RNK, vrijeme skladištenja/odmrzavanja, integritet RNK) kako bi se ograničile artefaktičke razlike povezane sa ovim metodama. Mapiranje kratkih čitanja na pojedinačne referentne genome ili transkriptome stvara pristranosti, a strategije koje mapiraju čitanja uzimajući u obzir HLA polimorfizam su neophodne. S obzirom na to da postoji nekoliko strategija za postizanje ovoga (Boegel et al. 2012; Lee et al. 2018; Aguiar et al. 2019; Gutierrez-Arcelus et al. 2020; Darby et al. 2020), bit će ključno usporediti relativnu tačnost ovih pristupa.

Takođe postoji potreba da se razviju metode koje na adekvatan način uzimaju u obzir varijacije izoforme, ne samo da obezbede još jedan sloj informacija, već i preciznije procene izraza, budući da je normalizacija broja čitanja netačnom dužinom transkripta potencijalni izvor greške. U tom kontekstu, dugo čitani podaci, koji direktno generiraju punu informaciju o transkriptu, mogu biti moćan alat (Cornaby et al. 2022). Konačno, varijacija broja kopija, poznata karakteristika za određene HLA lokuse (npr. DRB), takođe treba uzeti u obzir kada se kvantifikuju nivoi ekspresije.

Priznanja

Zahvaljujemo Tatiani Torres (Univerzitet u Sao Paulu), Yang Luou (Harvard Medical School) i članovima Zajedničkog biološkog konzorcijuma u Bostonu na njihovim korisnim raspravama.

Doprinos autora

Diogo Meyer, Mary Carrington, Richard M. Single i Vitor RC Aguiar doprinijeli su koncepciji i dizajnu studije. Pripremu materijala, prikupljanje podataka i eksperimente izveli su Maureen P. Martin, Veron Ramsuran, Smita Kulkarni, Arman Bashirova, Danillo G. Augusto i Mary Carrington. Analizu podataka izvršili su Vitor RC Aguiar, Erick Castelli, Richard M. Single, Maria Gutierrez-Arcelus i Diogo Meyer. Rukopis su napisali Vitor RC Aguiar i Diogo Meyer. Svi autori su pročitali, dali doprinose i odobrili konačni rukopis.

Finansiranje

Agencija za finansiranje São Paula (FAPESP, http://www.fapesp. br/en/) obezbijedila je sredstva za DM (2012/18010-0 i 2013/22007-7) i VRCA (2014/{{ 5}} i 2016/24734-1). Nacionalni instituti za zdravlje, SAD, obezbijedili su sredstva za DM (NIH R01 GM075091), koji je podržao dio VRCA postdoc. Conselho Nacional de Desenvolvimento Científco e Tecnológico (CNPq) & Ministarstvo zdravlja, Brazil obezbijedili su sredstva za RNA-seq eksperimente i istraživačke posjete, kao dio zajedničkog prijedloga SAD-Brazila koji je dodijeljen MC i DM (470043/{{13} }). NIH/NIAID R01AI157850 podržava SK. VR je finansirao Južnoafričko vijeće za medicinska istraživanja (SAMRC) sredstvima Odjeljenja za nauku i tehnologiju (DST); i također dijelom podržan kroz Podsaharsku afričku mrežu za izvrsnost istraživanja TB/HIV-a (SANTHE), DELTAS Afričku inicijativu (Grant # DEL-15-006) od strane AAS-a.

Ovaj projekat je u cijelosti ili djelimično finansiran federalnim sredstvima iz Frederick National Laboratory for Cancer Research, pod ugovorom br. HHSN261200800001E. Sadržaj ove publikacije ne odražava nužno stavove ili politike Ministarstva zdravlja i socijalnih usluga, niti spominjanje trgovačkih naziva, komercijalnih proizvoda ili organizacija implicira podršku Vlade SAD-a. Ovo istraživanje je dijelom podržano od strane Intramuralnog istraživačkog programa NIH-a, Frederick National Lab, Centra za istraživanje raka.

Dostupnost podataka

Podaci RNA-seq predstavljeni u trenutnoj publikaciji su deponovani i dostupni su iz baze podataka dbGaP pod dbGaP pristupom phs003177.v1.p1.

Reference

1. Aguiar VRC, César J, Delaneau O, et al (2019) Procjena ekspresije i eQTL mapiranje za HLA gene s personaliziranim cevovodom. PLoS Genet 15:e1008091.

2. Alcina A, Abad-Grau MDM, Fedetz M et al (2012) Varijanta rizika od multiple skleroze HLA-DRB1*1501 povezuje se sa visokom ekspresijom DRB1 gena u različitim ljudskim populacijama. PLoS One 7:e29819.

3. Anderson SK (2018) Molekularna evolucija elemenata koji kontroliraju ekspresiju HLA-C: Prilagođavanje ulozi liganda receptora imunoglobulina sličnog imunoglobulinu ćelije ubice koji reguliše funkciju prirodne ćelije ubice. HLA 92:271–278.

4. Apps R, Meng Z, Del Prete GQ et al (2015) Relativni nivoi ekspresije proteina HLA klase-I u normalnim i HIV-inficiranim ćelijama. J Immunol 194:3594-3600.

5. Apps R, Qi Y, Carlson JM, et al (2013) Utjecaj nivoa ekspresije HLA-C na kontrolu HIV-a. Science 340:87–91.

6. Arshad N, Laurent-Rolle M, Ahmed WS et al (2023) SARS-CoV-2 pomoćni proteini ORF7a i ORF3a koriste različite mehanizme za smanjenje ekspresije MHC-I na površini. Proc Natl Acad Sci USA 120:e2208525120.

7. Aulchenko YS, Ripke S, Isaacs A, van Duijn CM (2007) GenABEL: R biblioteka za analizu asocijacija na nivou genoma. Bioinformatika 23:1294–1296.

8. Bachtel ND, Umviligihozo G, Pickering S, et al (2018) HLA-C regulacija od strane HIV-1 prilagođava se HLA genotipu domaćina. PLoS Patog 14: e1007257.

9. Bettens F, Brunet L, Tiercy JM (2014) Visoka alelna varijabilnost u ekspresiji HLA-C mRNA: povezanost sa HLA-proširenim haplotipovima. Genes Immun 15:176–181.

10. Bettens F, Ongen H, Rey G et al (2022) Regulacija ekspresije HLA klase I pomoću nekodirajućih genskih varijacija. PLoS Genet 18:e1010212

11. Boegel S, Bukur T, Castle JC, Sahin U (2018) In Silico tipizacija klasičnih i neklasičnih HLA alela iz standardnih RNA-Seq čitanja. Metode Mol Biol 1802:177–191.

For more information:1950477648nn@gmail.com