Komparativna studija o hemijskim sastojcima i sadržaju Cistanche Tubulosa (Guanhua Roucongrong) i njegovih prerađenih proizvoda

Abstract

Cilj:Istražiti varijacije (obrasci promjene) u sadržaju hemijskih sastojaka prerađenih proizvodaCistanche tubulosa(Guanhua Roucongrong).
Metode:Odabrano je pet vrsta decokcija, uključujući sirove kriške, kriške kuhane na pari, parene kriške, kriške obrađene sa crnim grahom i kriške obrađene u soku od crnog graha. Ustanovljena je HPLC metoda otiska prsta koja je kombinovana sa procenom sličnosti, klaster analizom (CA) i analizom glavnih komponenti (PCA) da bi se pregledale i potvrdile različite komponente između sirovog proizvoda i prerađenih proizvoda. Upotrebljene su kemometrijske metode i HPLC za određivanje i poređenje razlika u sadržaju ukupnih feniletanoidnih glikozida, polisaharida, ukupnih flavonoida i četiri feniletanoidna glikozida u sirovim i prerađenim uzorcima.
Rezultati:HPLC otisci prstijuCistanche tubulosa and its processed products were established. With Mark peak matching, 9 common peaks were assigned for raw slices, whereas 11 common peaks were assigned for the other four processed products. Peaks No. 2 and No. 7 were differential chromatographic peaks. By comparison with reference standards, four chromatographic peaks were identified as echinacoside, cistanoside A, acteoside, and isoacteoside. Fingerprints of the processed products showed similar profiles with the same number of common peaks; similarity values were all >0.9. Korišćenjem ehinakozida kao referentnog pika, RSD relativnih vremena zadržavanja uobičajenih pikova među različitim prerađenim proizvodima kretao se od 0,11% do 0,82%, dok se RSD relativnih vršnih površina kretao od 15,46% do 76,07%. Kada je razmak između klasa postavljen na 10, CA je klasifikovao sirove kriške i prerađene proizvode u tri kategorije. PCA je ukazala na kompozicione razlike između sirovih i obrađenih uzoraka: 11 vršnih varijabli svedeno je na tri glavne komponente; različite glavne komponente koreliraju sa različitim hromatografskim pikovima. Na osnovu matrice komponenti i linearnog ponderisanja, sveobuhvatni rezultati su pokazali da su kriške obrađene u soku od crnog pasulja i kriške kuhane na pari u žutom vinu i pare u vodi bolje rangirane. Sadržaj u sirovim i prerađenim uzorcima bio je sljedeći: ukupni feniletanoidni glikozidi 3,80%–7,07%, ukupni polisaharidi 5,85%–6,70%, ukupni flavonoidi 14,16%–24,26%; ehinakozid 4,11%–5,99%, akteozid 0,67%–1,34%, cistanozid A 0,06%–0,36% i izoakteozid 0,25%–1,66%. Među prerađenim proizvodima postojale su značajne razlike.
zaključak:Ustanovljena HPLC metoda otiska prsta ima snažnu specifičnost, efikasno razlikuje sirove kriške od prerađenih proizvodaCistanche tubulosa, i pogodan je za kvalitativnu i kvantitativnu analizu ehinakozida, akteozida, cistanozida A i izoakteozida u sirovom lijeku i prerađenim proizvodima. Uporedno profilisanje i promjene sadržaja između različitih uzoraka mogu pružiti naučnu osnovu za identifikaciju i kontrolu kvalitetaCistanche tubulosai njeni različiti prerađeni proizvodi.

Ključne riječi: Cistanche tubulosa; obrada; hemijski sastojci; otisak prsta; tečna hromatografija visokih performansi (HPLC)

 

1 Uvod

Cistanche tubulosa(Schenk) Wight (Guanhua Roucongrong) je višegodišnja biljka Orobanchaceae i službeno je naveden izvor Cistanches Herba u Farmakopeji Narodne Republike Kine (u daljem tekstu "Kineska farmakopeja"). Ljekoviti dio je osušena mesnata stabljika sa ljuskavim listovima. Tople je prirode, slatkastog i slanog okusa, te ulazi u meridijane bubrega i debelog crijeva, sa funkcijama toniziranja janga bubrega, blagotvornog djelovanja na esenciju i krv, te vlaženja crijeva radi ublažavanja opstipacije [1]. Moderne farmakološke studije potvrdile su višestruke aktivnosti, kao što su anti-aging, jačanje imuniteta, tonizirajući i afrodizijački efekti bubrega, laksativni efekti i antihipertenzivna aktivnost.

Cistanche tubulosabogat je feniletanoidnim glikozidima, iridoidima i njihovim glikozidima, lignanima, oligosaharidnim esterima, poliolima, polisaharidima, flavonoidima i drugim sastojcima [2]. Među njima, feniletanoidni glikozidi su glavne aktivne komponente i najzastupljenija jedinjenja; oni su također komponente markera za određivanje sadržaja u farmakopeji i pokazuju različite bioaktivnosti kao što su antioksidativni efekti, promocija metabolizma, poboljšanje učenja i pamćenja, te poboljšanje seksualne funkcije [3].

Cistanche tubulosapreferira slano-alkalno zemljište i pustinjske regije Gobi, parazitira na korijenimaTamarixspp., a uglavnom je rasprostranjen u Unutrašnjoj Mongoliji, Xinjiangu i Gansuu u Kini [4]. Divlja i kultivirana geo-autentična područja uključuju okrug Minfeng, Yutian, Pishan i Moyu u prefekturi Hotan, Xinjiang. Njegova prerada se uglavnom razvija u narezane komade decokcije, sirove biljne materijale, ekstrakte, zdravstvene proizvode i funkcionalnu hranu; među njima, komercijalni komadi decokcije ostaju mainstream. Međutim, na tržištu se različiti prerađeni proizvodi – kao što su sirove kriške, kriške obrađene vinom, kriške inaktivirane enzimima na visokoj temperaturi i kriške kuhane na pari – često miješaju i teško ih je razlikovati.

Obrada Cistanches Herba je evoluirala tokom vremena, od drevnih zapisa kao nprTaiping Shenghui Fang, Zhenglei Bencao, iPuji Fang[5–7] (npr. pranje vinom, prženje s vinom, kuhanje na pari/pečenje s vinom, natapanje/pečenje na suho s vinom, kuhanje u vodi, trostruko kuhanje na pari i prženje na maslacu) do modernih metoda kao što su maceracija vina (kuhanje na pari), jednokratno kuhanje na pari, „prerada na četiri pare i četiri-sunce“ [8]. Različite metode obrade mogu uticati na sadržaj aktivnih sastojaka, sigurnost i biološku aktivnost. Cai Hong et al. [9] su otkrili da je enzimska inaktivacija svježeg materijala sa 70 stupnjeva vruće vode u trajanju od 6 minuta rezultirala sadržajem ehinakozida i akteozida 7,3 puta i 6,5 puta više od direktnog sušenja na suncu. Tie Xiaoyan i dr. [10] izvijestili su da je obrada parom značajno poboljšala kvalitetu komada dekokcije u poređenju sa svježim materijalima. Chen Weijun i dr. [11] primijetili su da se sadržaj betaina smanjuje nakon obrade vina, soli i pare u usporedbi sa svježim proizvodima. Zhang Chao et al. [12] su pokazali da se tokom kuhanja vina na pari, s dužim vremenom kuhanja na pari, ehinakozid, akteozid, cistanozid A i 2′-acetilakteozid postepeno smanjuju, dok se izoakteozid značajno povećava.

Sadašnje izdanje Kineske farmakopeje iz 2025. samo postavlja ograničenja za ehinakozid i akteozid u sirovim kriškama i kriškama kuhanim na pari u vinu, ali ne navodi komponente markera za druge prerađene proizvode i nedostaju efikasne metode kontrole sadržaja. Stoga su analiza i poređenje karakterističnih sastojaka i istraživanje obrazaca promjena sastava posebno važni za kvalitativnu identifikaciju i kvantitativnu kontrolu sirovih i prerađenih proizvoda.

Tradicionalna kineska medicina (TCM) uzimanje otisaka prstiju je holistički prikaz hemijskih sastojaka. Uz prednosti integriteta, specifičnosti i bogatih informacija, široko se koristi u evaluaciji kontrole kvaliteta sirovih lijekova i preparata, usklađivanju sa međunarodnim standardima, identifikaciji autentičnosti, praćenju proizvodnog procesa i istraživanju farmakodinamičkih supstanci [13]. Na osnovu HPLC otiska prsta, ova studija je odabrala ehinakozid, akteozid, cistanozid A i izoakteozid kao markere kvaliteta i koristila analizu sličnosti, CA i PCA u kombinaciji sa određivanjem sadržaja za upoređivanje hemijskih sastojaka i obrazaca promene sadržaja među različitim prerađenim proizvodima, pružajući naučnu osnovu za identifikaciju i kontrolu kvaliteta.

 

2 Instrumenti i materijali

2.1 Instrumenti

U3000 HPLC sistem (Thermo Fisher); UPL-111-20R sistem ultra čiste vode (Sichuan Youpu); AB 265-S elektronska vaga (Mettler Toledo); KQ-5200DA ultrazvučni ekstraktor/čistač (Kunshan Ultrasonic); GZX-9240MBE električna pećnica za sušenje (Shanghai Boxun); UV-2600 UV-Vis spektrofotometar (Shimadzu, Kina).

2.2 Lijekovi i reagensi

SvežeCistanche tubulosa(Serija br.. 20241008) isporučila je Xinjiang Congrongtang Biotechnology Co., Ltd., a autentičnost je potvrdio istraživač Wang Guoping (Institut Materia Medica autonomne regije Xinjiang Uygur) kao mesnat stabljikeCistanche tubulosa(Schenk) Wight (Orobanchaceae).

Referentne supstance: bezvodna D-glukoza (Br. serije. 361810, 100,00%, Shenzhen Jinhui Biotechnology Co., Ltd.); ehinakozid (serija br. 111670-201907), rutin (serija br. 11530-202315), akteozid (serija br. 11530-202315), cistanozid A (serija br. 313512) i izoakteozid (serija br. 313413), sa čistoćom HPLC analize veća od ili jednaka 91,8%, 97,6%, 97,6%. 98,09%, respektivno, iz Nacionalnog instituta za kontrolu hrane i lijekova (Kina).(Napomena: jedna linija čistoće je skraćena u datom tekstu; gore slijedi dio koji se može čitati.)

Vino od žute riže (polusuvo, alkohol 16%; Zhejiang Guyuelongshan Shaoxing Wine Co., Ltd.); metanol i acetonitril (HPLC grade, Fisher Scientific, SAD). Ostali reagensi su bili analitičke čistoće.

3 Metode i rezultati

3.1 Priprema sirovih kriški i prerađenih proizvoda odCistanche tubulosa

Za pripremu sirovih kriški i prerađenih proizvoda korištene su sljedeće metode, svaka u 6 serija.

Sirove kriške:SvežeCistancheje isečen na kriške od 3 mm i osušen na 60 stepeni.

Metoda kuhanja na pari:Prema literaturi [14], 20 g čistih kriški pomešano je sa 6 mL destilovane vode u zatvorenoj posudi, vlažno 4 h [12], pareno nad vodom 12 h, ohlađeno i sušeno na 60 stepeni.

Metoda prerade vina:Pripremljeno prema metodi dinstanja ili kuhanja vina na pari (Opšte pravilo 0213, Kineska farmakopeja).

Prerada sa crnim pasuljem:Pripremljeno premaKineska Materia Medica(Zhonghua Bencao) pod Cistanches Herba; crni pasulj je dodan u količini od 1 kg na 10 kgCistanchematerijal.

Prerada soka od crnog pasulja:Kriške su pomiješane sa sokom od crnog pasulja, a zatim obrađene gore opisanom metodom parenja; doza crnog pasulja je bila ista kao gore.

3.2 Određivanje predmeta inspekcije

Vlažnost je određena sušenjem u pećnici (Opšte pravilo 0832, Kineska farmakopeja); ukupni pepeo prema Općem pravilu 2302; ekstrakti rastvorljivi u alkoholu metodom hladne maceracije prema Opštem pravilu 2201. Rezultati su prikazani u tabeli 1.

 

3.3 Komparativna analiza HPLC otisaka prstijuCistanche tubulosai njegovi prerađeni proizvodi

3.3.1 Kromatografski uvjeti

Kolona Waters Xterra RP18 (250 mm × 4,6 mm, 5 µm). Mobilna faza: acetonitril (A)–0,1% mravlja kiselina (B) sa gradijentom eluiranja: 0–12 min, 14% A → 17% A; 12–30 min, 17% A → 19% A; 30–35 min, 19% A → 14% A; 35–50 min, 14% A. Brzina protoka: 1,0 mL·min⁻¹. Temperatura kolone: ​​30 stepeni. Talasna dužina detekcije: 330 nm. Zapremina injekcije: 10 µL.

3.3.2 Priprema rastvora

Referentna rješenja:Referentne supstance ehinakozida, akteozida, cistanozida A i izoakteozida su precizno izvagane i rastvorene u 50% metanolu u volumetrijskim tikvicama od 10 mL da bi se dobili rastvori od 1,1301, 0,2294, 0,2255, odnosno 0,2109 mg,¹·mL; filtrirati kako bi se dobila konačna otopina.

Primjeri rješenja:0,5 g praha od 80 mesh sirovih i obrađenih uzoraka precizno je izvagano, ekstrahirano sa 50% metanola u volumetrijskoj tikvici od 25 mL, ultrazvučno obrađeno (200 W, 40 kHz) 40 minuta, ohlađeno, miješano, ostavljeno da stoji i filtrirano kroz membranu od 0,22 µm; korišten je filtrat.

3.3.3 Validacija metode (otisak prsta)

3.3.3.1 Preciznost

Isti rastvor uzorka je ubrizgan šest uzastopnih puta. Koristeći ehinakozid kao referentni pik, RSD relativnih vremena retencije uobičajenih pikova je<0.48% and the RSD of relative peak areas was <2.86%, indicating good instrumental precision.

3.3.3.2 Ponovljivost

Šest paralelnih otopina uzoraka pripremljeno je iz iste serije (sirovi rez S1). Korišćenjem ehinakozida kao referentnog pika, RSD relativnog vremena zadržavanja je bio<0.07% and the RSD of relative peak areas was <2.77%, indicating good method repeatability.

3.3.3.3 Stabilnost

Isti rastvor uzorka analiziran je u 0, 3, 6, 9, 12 i 24 h. Korišćenjem ehinakozida kao referentnog pika, RSD relativnog vremena zadržavanja je bio<0.11% and the RSD of relative peak areas was <2.33%, indicating stability within 24 h.

3.3.4 Utvrđivanje otisaka prstiju

Cistanche tubulosai analizirani su prerađeni proizvodi. Korišten je "Sistem za procjenu sličnosti za hromatografski otisak prsta tradicionalne kineske medicine" (izdanje 2012.). Sirova kriška S1 i kriška J1 kuhana na pari u žutom vinu korišteni su kao referentni otisci prstiju; srednja metoda i širina vremenskog prozora od 0,1 min primijenjeni su za korekciju u više tačaka i podudaranje mark pika za generiranje otisaka prstiju (Slike 1-2), a dobijeni su i hromatogrami sa preklapanjem sa miješanim referentnim standardima (Slika 3).

Rezultati su pokazali da četiri obrađena proizvoda imaju profile otisaka prstiju slične onima u sirovim kriškama. Sirove kriške imale su 9 uobičajenih vrhova, dok su kriške kuhane na pari, kuhane na pari, promiješane-s-crnim-pasulom i kriške obrađene u soku od crnog graha imale 11 uobičajenih vrhova. Obojica su dijelili devet zajedničkih vrhova. Vrhovi br.. 2 i br.. 7 bili su karakteristični vrhovi koji razlikuju sirove kriške od prerađenih proizvoda. Profili otisaka prstiju među četiri obrađena proizvoda bili su slični i nisu jasno odražavali razlike među njima.

3.3.5 Analiza sličnosti

Using J1 as the reference fingerprint, similarity analysis was performed for different processed products (Table 2). Similarities were all >0,9, što ukazuje na slične karakteristike otiska prsta među različitim prerađenim proizvodima.

3.3.6 Identifikacija zajedničkih vrhova

Poređenjem vremena retencije sa mešovitim referentnim standardima i hromatogramom sirovog preseka, identifikovana su četiri hromatografska pika: Peak 4, ehinakozid; Peak 9, cistanozid A; Peak 10, akteozid; Pik 11, izoakteozid (Slika 2). Sa pikom 4 (ehinakozid) kao referentnim pikom, RSD vrednosti relativnih vremena zadržavanja uobičajenih pikova među različitim serijama četiri prerađena proizvoda kretale su se od 0,11% do 0,82%, a RSD vrednosti relativnih površina pikova su se kretale od 15,46% do 76,07%.

3.3.7 Analiza klastera

SPSS 27.0 je korišten za klaster analizu sirovih kriški i prerađenih proizvoda. Primijenjeno je međugrupno povezivanje i korišten je kvadrat Euklidske udaljenosti (slika 4). Kada je međurazredna udaljenost bila<5, water-steamed slices and wine-steamed slices clustered together. When the inter-class distance was 10, raw slices and the four processed products were classified into three categories: raw materials (S1–S6) as one category; black-bean-juice-processed slices (H1–H6) as one category; and wine-steamed slices (J1–J6) together with water-steamed slices (Q1–Q6) and stir-processed-with-black-beans slices (C1–C6) as one category. When the inter-class distance was between 15 and 25, black-bean-juice-processed slices formed a separate cluster from the other samples.

3.3.8 Analiza glavnih komponenti

Nakon standardizacije vršnih površina, PCA je izveden pomoću SPSS 27.0. KMO vrijednost je bila 0,679, a značajnost Bartlettovog testa<0.001, indicating suitability for PCA. With eigenvalues >1, tri glavne komponente su ekstrahovane sa sopstvenim vrednostima 6.815, 1.987 i 1.105. Stope doprinosa varijanse bile su 61,954%, 18,063% i 10,047%, respektivno, uz kumulativnu stopu doprinosa varijanse od 90,064% (Tabela 3). Ovo ukazuje da je prva glavna komponenta najvažniji indikator za sveobuhvatni rezultat.

Matrica komponenti je pokazala da su u prvoj glavnoj komponenti apsolutni koeficijenti varijabli površine vrha za vrhove 2–9 i vrh 11 bili relativno veliki, što ukazuje na snažan utjecaj na F1. Druga glavna komponenta je u korelaciji sa informacijama o vrhovima 1 i 10, a treća glavna komponenta u korelaciji sa vrhom 1. Matrica komponenti je prikazana u tabeli 4; dijagram sipina i grafikon opterećenja prikazani su na slikama 5 i 6. Koristeći rezultate tri glavne komponente i njihove stope doprinosa varijansi kao pondere za linearno ponderisanje, izračunati su sveobuhvatni rezultati (tabela 5), ​​koji ukazuju na to da kriške obrađene sokom od crnog pasulja, kriške parene parene kriške i kriške vina više rangiraju

 

3.4 HPLC određivanje više sastojaka uCistanche tubulosai njegovi prerađeni proizvodi

3.4.1 Kromatografski uvjeti i specifičnosti

Uvjeti hromatografije bili su isti kao oni korišteni za uzimanje otisaka prstiju. Ubrizgani su rastvori uzoraka, referentni rastvori i negativni prazni rastvori (žuto pirinčano vino, prečišćena voda, sok od crnog graha) (10 µL). Upoređena su vremena zadržavanja. Negativne slijepe otopine nisu pokazale interferencije s ehinakozidom, cistanozidom A, akteozidom i izoakteozidom.[tekst nedostaje u izvoru]

3.4.2 Linearnost

Referentne otopine ehinakozida, akteozida, cistanozida A i izoakteozida u koncentracijama od 1,1301, 0,2294, 0,2255 i 0,2109 mg·mL⁻¹ su precizno pipetirane na 1, 2, 4, 8 i 16 µL i 10µ. Izvedena je linearna regresija sa površinom pika XXX u odnosu na ubrizganu koncentraciju YYY (mg·mL⁻¹). Linearne jednačine i rasponi prikazani su u tabeli 6.

3.4.3 Preciznost

Isti rastvor uzorka je ubrizgan šest uzastopnih puta. RSD vrednosti sadržaja za četiri analita (ehinakozid, cistanozid A, akteozid, izoakteozid) iznosile su 0,23%, 2,71%, 0,53% i 2,08% respektivno (tabela 7), sve<3%, indicating good instrumental precision.

3.4.4 Ponovljivost

Šest paralelnih otopina uzoraka pripremljeno je iz iste serije (sirovi rez S1). Dinarske vrednosti sadržaja za četiri analita bile su 0,22%, 2,46%, 0,50% i 2,46% respektivno (tabela 7).<3%, indicating good repeatability.

3.4.5 Stabilnost (unutar dana)

Isti rastvor uzorka analiziran je u 0, 3, 6, 9, 12 i 24 h. Dinarske vrednosti sadržaja za četiri analita bile su 0,80%, 1,62%, 1,72% i 1,49% respektivno (tabela 7).<2.0%, indicating stability within 24 h.

3.4.6 Stabilnost (međudnevno)

Isti rastvor uzorka analiziran je pet uzastopnih dana. RSD vrednosti sadržaja za četiri analita tokom pet dana bile su 2,80%, 2,53%, 3,53% i 2,88% respektivno (tabela 7), što ukazuje na stabilnost u roku od pet dana.

3.4.7 Oporavak

Odgovarajuću količinuCistanche tubulosauzorak je izvagan, a referentni standardi ehinakozida, akteozida, cistanozida A i izoakteozida su dodani u omjeru 1:1. Pripremljeno je i analizirano šest paralelnih otopina uzoraka (10 µL injekcija). Prosječni povrati iznosili su 99,29%, 98,75%, 99,45% i 96,13% (n=6), sa dinarskim vrijednostima od 2,51%, 0,38%, 1,71% i 0,49%, respektivno.

3.4.8 Rezultati određivanja

Za svaki uzorak tačno je izvagano 0,5 g praha; 10 µL je ubrizgano da bi se odredio i izračunao procenat sadržaja četiri sastojka. Rezultati su prikazani na slikama 7–10.

 

3.5 Određivanje ukupnih feniletanoidnih glikozida, ukupnih polisaharida i ukupnih flavonoida

3.5.1 Određivanje ukupnih feniletanoidnih glikozida

3.5.1.1 Priprema referentnog rastvora

Odgovarajuća količina referentne supstance ehinakozida je precizno izmerena i rastvorena u metanolu u volumetrijskoj tikvici od 10 mL da bi se dobio rastvor sa koncentracijom od 0,32 mg·mL⁻¹. Prema literaturi [15], pipetirano je 0,1, 0,2, 0,4, 0,6, 0,8, 1,0 i 1,2 mL referentne otopine, razrijeđeno do 10 mL metanolom, a apsorbancija (A) je izmjerena na 333 nm. Uklopljena standardna jednačina krive bila je Y=24.7596X+0.0147Y=24.7596X + 0.0147Y=24.7596X+0.0147, R2=0.9995R^2=0.9995R2=0.9995, sa linearnim rasponom od 0,0029–0,0359 mg¹·m⁻

3.5.1.2 Priprema otopine uzorka

100 mg uzorka praha (propuštenog kroz sito od 100 mesh) je precizno izvagano, ekstrahirano ultrazvučno metanolom 30 minuta (200 W, 40 kHz), razrijeđeno do 10 mL i filtrirano kroz membranu od 0,22 µm. Zatim je 0,2 mL filtrata dalje razrijeđeno do 10 mL sa metanolom i pomiješano za analizu.

3.5.1.3 Određivanje

Za svaki uzorak korišteno je 100 mg praha za pripremu otopine uzorka. Apsorpcija je izmjerena na 333 nm i izračunat je postotak sadržaja ukupnih feniletanoidnih glikozida (Tabela 9).

Jednadžba (1):
Sadržaj (%) =C×V×Dm×100%= \\dfrac{C \\times V \\times D}{m} \\times 100\\%=mC×V×D​×100%
gdje je CCC koncentracija analita u otopini uzorka, VVV je volumen razrjeđenja, DDD je faktor razrjeđenja, a mmm je masa uzorka (mg).

3.5.2 Određivanje ukupnih polisaharida

3.5.2.1 Priprema referentnog rastvora

Odgovarajuća količina bezvodne referentne supstance D-glukoze je precizno izmerena, rastvorena u prečišćenoj vodi i razblažena do 10 mL da se dobije rastvor od 0,190 mg·mL⁻¹. Nakon miješanja i filtracije (0,22 µm), pipetirano je 0,2, 0,4, 0,6, 0,8 i 1,0 mL. Razvoj boje izveden je metodom antron-sumporna kiselina [16]. Apsorpcija je izmjerena na 625 nm. Uklopljena jednačina standardne krive bila je Y=35.1316X−0,0079Y=35.1316X - 0.0079Y=35.1316X−0,0079, R2=0.9957R^2=0.9957R2=0.9957, sa linearnim rasponom od 0,0098–0,00 mg·m¹·m¹.

3.5.2.2 Priprema otopine uzorka

40 mg uzorka praha je precizno izvagano, ultrazvučno rastvoreno u prečišćenoj vodi tokom 30 minuta (200 W, 40 kHz), razblaženo do 10 mL i filtrirano kroz membranu od 0,22 µm.

3.5.2.3 Određivanje

Za svaki uzorak korišteno je 40 mg za pripremu otopine uzorka. Zatim je pipetirano 0,1 mL filtrata i dopunjeno pročišćenom vodom do 2,00 mL. Nakon razvoja boje metodom antron-sumporna kiselina, izmjerena je apsorpcija i izračunat je postotak sadržaja ukupnih polisaharida (tablica 8).

3.5.3 Određivanje ukupnih flavonoida

3.5.3.1 Priprema referentnog rastvora

Odgovarajuća količina referentne supstance rutina je tačno izmerena, rastvorena u 70% etanolu i razblažena do 25 mL; filtriran kroz membranu od 0,22 µm. Zatim je pipetirano 0,5, 1,0, 2,0, 3,0 i 4,0 mL. Razvoj boje izveden je metodom natrijum nitrit–aluminijum nitrat–natrijum hidroksid [17]. Apsorpcija je izmjerena na 510 nm. Uklopljena standardna jednačina krive bila je Y=11.5699X+0.0684Y=11.5699X + 0.0684Y=11.5699X+0.0684, R2=0.9989R^2=0.9989R2=0.9989, sa linearnim rasponom od 0,0097–0,0738 mg·l⻁

3.5.3.2 Priprema otopine uzorka

50 mg praha je precizno izvagano, ultrazvučno rastvoreno u 70% etanolu tokom 30 minuta (200 W, 40 kHz), razblaženo do 10 mL i filtrirano kroz membranu od 0,22 µm.

3.5.3.3 Određivanje

Za svaki uzorak korišteno je 50 mg za pripremu otopine uzorka. Zatim je 0,5 mL filtrata prebačeno u volumetrijsku tikvicu od 10 mL i dodavani su reagensi za boju prema gore navedenom redoslijedu. Pročišćena voda služila je kao blanko. Izmjerena je apsorpcija i izračunat procentualni sadržaj ukupnih flavonoida (Tabela 8).

 

4 Diskusija

U ovoj studiji, HPLC otisci prstiju odCistanche tubulosa and its various processed products were established. Peak matching across different batches confirmed 9 common peaks in raw slices and 11 common peaks in processed products. By comparison with reference standards, four common peaks were identified as echinacoside, cistanoside A, acteoside, and isoacteoside. Similarity analysis showed that similarity values among four processed products were all >0,9, a ukupni profili otisaka prstiju su bili slični, što ukazuje da su njihovi sastavni tipovi bili bliski. Međutim, velike razlike u RSD relativnih vršnih površina ukazuju na značajne razlike u sadržaju sastojaka.

U poređenju sa sirovim kriškama, četiri prerađena proizvoda pokazala su dva dodatna vrha (pikovi 2 i 7), što ukazuje da su se hemijski sastojci promijenili nakon kuhanja vina na pari, vodene pare ili obrade crnog graha. Pretpostavlja se da su ovi novogenerisani pikovi formirani tokom obrade; karakterizacija njihovih komponenti će biti obrađena u narednim studijama.

CA rezultati su pokazali da kada je međurazredna udaljenost bila<5, wine-steamed and water-steamed slices clustered together, suggesting similar chemical composition and content. At an inter-class distance of 10, raw slices could be separated from black-bean-juice-processed slices, stir-processed-with-black-beans slices, and wine/water-steamed slices. At inter-class distances of 15–25, differences between black-bean-juice-processed slices and other samples became more prominent. PCA results indicated that three principal components had substantial influence on comprehensive evaluation.

Različite metode obrade direktno su uticale na nivoe različitih sastojaka. Na osnovu kemometrijskog određivanja, ukupni feniletanoidni glikozidi rangirani su kao: prerađeni u soku od crnog graha > sirove kriške > kuhane na vodi > kuhane na pari u vinu > promiješane-obrađene sa crnim pasuljem. Ukupni polisaharidi rangirani kao: pareni u vodi > kuhani na pari u vinu > promiješati-obrađeni-s-crnim-pasulom > crni grah-obrađeni sokom > sirove kriške. Ukupni flavonoidi rangirani kao: crni pasulj-obrađen u soku > pareni u vodi > promiješati-obrađen-s-crnim-pasulom > kuhano u vinu > sirove kriške. U poređenju sa sirovim kriškama, obrada soka od crnog pasulja povećala je ukupne feniletanoidne glikozide, dok su ga druge metode obrade smanjile; sve četiri metode obrade značajno su povećale ukupne polisaharide i ukupne flavonoide. Između dvije metode crnog pasulja, prerada soka od crnog pasulja dovela je do većeg povećanja ukupnih feniletanoidnih glikozida i ukupnih flavonoida od miješane obrade sa crnim grahom, sa statističkim razlikama.

 

Tabela 8. Rezultati određivanja ukupnih feniletanoidnih glikozida, ukupnih polisaharida i ukupnih flavonoida uCistanche tubulosai njegovih prerađenih proizvoda

Prerađeni proizvod (komadi odvarka)	Ukupni feniletanoidni glikozidi (%)	Ukupni polisaharidi (%)	Ukupni flavonoidi (%)
Sirove kriške	6.81 ± 0.06	5.85 ± 0.10	14.16 ± 0.24
Kriške kuhane na vinu	5.10 ± 0.05***	6.61 ± 0.05***	20.84 ± 0.33***
Kriške kuvane na pari	5.23 ± 0.05***	6.70 ± 0.15***	21.59 ± 0.37***
Promešano obrađeno kriškama crnog pasulja	3.80 ± 0.02***	6.56 ± 0.09***	21.02 ± 0.35***
Kriške obrađene u soku od crnog pasulja	7.07 ± 0.09****	6.09 ± 0.03****	24.26 ± 0.18****

Napomene: U poređenju sa sirovim kriškama: *P < 0,05, **P < 0,01, ***P < 0,001; u poređenju sa kriškama obrađenim sa crnim pasuljem: *P < 0,05, **P < 0,01, ***P < 0,001.

Ehinakozid, akteozid, cistanozid A i izoakteozid su ključni feniletanoidni glikozidi koji doprinose tonizirajućem i esencijalnom efektimaCistanche tubulosa. HPLC poređenje ova četiri sastojka pokazalo je da razlike u površini pikova između uobičajenih pikova mogu poslužiti kao osnova za razlikovanje različitih obrađenih proizvoda. U poređenju sa sirovim kriškama, ehinakozid, cistanozid A i izoakteozid su se povećali u različitom stepenu u prerađenim proizvodima, sa izraženijim povećanjem u proizvodima od soka od crnog graha. Akteozid je smanjen u tri prerađena proizvoda, ali se povećao u proizvodima prerađenim miješanjem sa crnim grahom. Ovo se može odnositi na inherentnu stabilnost akteozida: kao feniletanoid diglikozid sa kofeoilnom ostatkom, može se podvrgnuti cijepanju estarske veze pod promjenama temperature zagrijavanja, vremena i pH kako bi se stvorila kafeinska kiselina i djelomično se izomerizira u izoakteozid. Uočeno smanjenje akteozida i povećanje izoakteozida u četiri obrađena proizvoda može biti povezano s parom na visokoj temperaturi, u skladu s obrascima prijavljenim za obradu Rehmanniae Radix [18].

Ehinakozid se povećao nakon parenja vina/vode i prerade crnog pasulja u ovoj studiji, što je suprotno Zhang Chao et al. [12]. Upoređujući preradu miješanjem s crnim grahom i preradom od crnog pasulja sa sokom, potonji je pokazao značajno veći sadržaj ehinakozida i cistanozida A i izraženiji trend konverzije iz akteozida u izoakteozid. Sve u svemu, ova studija otkriva promjene sastava i sadržaja nakon različitih metoda obrade i potvrđuje promjenu 规律 između akteozida i izoakteozida. HPLC otisci prstiju pružaju naučnu metodu za identifikaciju sirovih kriški i prerađenih proizvoda, i nude referencu za uspostavljanje standarda kontrole kvaliteta i za kvalitativne i kvantitativne analize.

 

Sukob interesa

Autori izjavljuju da nema sukoba interesa.

Prilozi autora

XU Xiaoqin: podrška projektu, dizajn studije, eksperimentalno određivanje i pisanje rukopisa;
QING Degang: ukupna koordinacija i prikupljanje medicinskog materijala;
ZHANG Juan i ZHAO Peng'an: određivanje sastavnih dijelova i analiza podataka;
WANG Guoping: autentikacija medicinskih materijala.

 

Tvornica uzoraka Cistanche:

https://www.xjcistanche.com/about-us

 

 

Reference

[1] Farmakopejska komisija Ministarstva zdravlja Narodne Republike Kine.Farmakopeja Narodne Republike Kine[M]. Peking: Chemical Industry Press, 2025.
[2] Jia Xiaoguang, Ni Hui, Zhang Juan, et al. Status istraživanja i industrijskog razvojaCistanche tubulosa [J]. Časopis Medicinskog univerziteta Xinjiang, 2012, 35(7): 876–880.
[3] Liu Yuewen. Napredak istraživanja feniletanoidnih glikozida uCistanche tubulosa [J]. Savremena poljoprivredna mehanizacija, 2020(11): 60–62.
[4] Tu Pengfei. Ponovno ispitivanje biljnih tekstualnih dokaza za Cistanches Herba [J].China Journal of Chinese Materia Medica, 2022, 47(20): 5670–5679.
[5] Zhu Su, Teng Shuo, Liu Chun.Puji Fang[M]. Peking: Narodna medicinska izdavačka kuća, 1959.
[6] Wang Huaiyin.Taiping Shenghui Fang[M]. Peking: Narodna medicinska izdavačka kuća, 1959.
[7] Tang Shenwei.Chongxiu Zhenghe Jingshi Zhenglei Beiyong Bencao[M]. Peking: Narodna medicinska izdavačka kuća, 1957.
[8] Zhang Yong, Wu Huan. Povijesna evolucija metoda obrade za Cistanches Herba [J].China Journal of Chinese Materia Medica, 1992, 17(4): 213–214.
[9] Cai Hong, Bao Zhong, Jiang Yong. Tehnologija prerade svježegCistanche tubulosa [J]. China Journal of Chinese Materia Medica, 2007, 32(13): 1289–1291.
[10] Tie Xiaoyan, Feng Yinping, Ma Dongni. Utjecaj obrade na pari u području porijekla na kvalitet pustinjskog Cistanches Herba [J].Časopis tradicionalne kineske veterinarske medicine, 2021, 40(2): 54–56.
[11] Chen Weijun, Jia Cuiyu, Li Lianjiang. Efekti različitih metoda obrade na sadržaj betaina u XinjianguCistanche tubulosa [J]. Medicina poljoprivredne melioracije, 2009, 31(5): 400–402.
[12] Zhang Chao, Hua Yue, Lian Jing, et al. Studija o varijaciji sadržaja feniletanoidnih glikozida tokom obrade Cistanches Herba [J].Kineski časopis informacija o tradicionalnoj kineskoj medicini, 2022, 29(4): 92–97.
[13] Wu Chunxing, Yang Yang, Meng Mei, et al. Status istraživanja i analiza trenda TCM otisaka prstiju u protekloj deceniji [J].Časopis Univerziteta Minzu u Kini (izdanje prirodnih nauka), 2024, 33(4): 63–72.
[14] Jiang Yong, Bao Zhong, Sun Yongqiang. Studija o tehnologiji obrade kriški Cistanches Herba [J].Chinese Pharmaceutical Journal, 2011, 46(14): 1074–1076.
[15] Zhang Leihong, Du Niansheng, Wang Qing. Određivanje feniletanoidnih glikozida u kapsulama ukupnih glikozida Cistanches Herba UV spektrofotometrijom [J].Časopis Medicinskog univerziteta Xinjiang, 2002, 25(4): 407–408.
[16] Ailadan·Maimaiti Aili, Yang Ting, Yuan Jie. Proces ekstrakcije i in vitro antioksidativna aktivnost polisaharida iz ostatakaCistanche tubulosa [J]. Chemical and Biochemical Engineering Quarterly(preveden naziv časopisa zasnovan na kineskom), 2020, 37(2): 36–41.
[17] Luo Yan. Optimizacija procesa ekstrakcije ukupnih flavonoida izCistanche tubulosa[D]. Shihezi: Univerzitet Shihezi, 2015.
[18] Shan Guoshun, Zhao Qimiao, Li Rui, et al. Dinamičko proučavanje sadržaja akteozida tokom obradeRehmannia glutinosa [J]. Azijsko-pacifička tradicionalna medicina, 2019, 15(3): 37–39.