Clr‑f ekspresija reguliše imunološku i metaboličku homeostazu bubrega Ⅲ

Diskusija

Upala i imune ćelije posredovaneoštećenja igraju vodeću ulogu u razvoju i napredovanju bubrežne ozljede i disfunkcije. U ovoj studiji izvještavamo o zahtjevu za Clr-f u održavanjuzdravlje bubregai funkcijukao intrinzična homeostatska kontrola protivimunološko i metabolički posredovano oštećenje bubrega. Naši nalazi pokazuju infiltraciju imunoloških stanica, te taloženje imunoglobulina i proteina komplementa u bubrezima miševa s nedostatkom Clr-f. Ove imunološke karakteristike miševa s nedostatkom Clr-f uparene su s pojavom tubularnih i glomerularnih lezija povezanih sa godinama, ektopičnom akumulacijom lipida i disregulacijom brojnih transkripcijskih procesa.

Click to cistanche herba za bolest bubrega

Clr proteini kodirani unutar NKC-a među njihovim genetski povezanim NKR-P1 receptorima bili su u fokusu proučavanja kao neredundantni medijatori nezavisne od MHC klase I u prepoznavanju nestalih od strane NKR-P1 koji eksprimiraju imune ćelije9,27–31. Izvještava se da povećana ekspresija odabranih Clr proteina kao odgovor na ćelijski stres funkcionalno ograničava imune odgovore imunoloških stanica koje žive u tkivu7,12,32. Shodno tome, pretpostavljalo se da intestinalni Clr-f doprinosi imunološkoj toleranciji unutar inače visoko imunogenog okruženja crijeva kroz svoju interakciju sa intraepitelijalnim limfocitima koji eksprimiraju inhibitorni NKR-P1G receptor7. Rad koji su uradili Leibelt et al. pokazalo je da miševi izazvani poli(I:C) pokazuju povećanu ekspresiju Clr-f i da Clr-f/NKR-P1G interakcije in vitro snažno inhibiraju ćelije koje eksprimiraju NKR-P1G. Zajedno, ovi nalazi se mogu tumačiti kao potencijalni mehanizam pomoću kojeg Clr-f može spriječiti reaktivnost intestinalnih intraepitelnih NKR-P1G pozitivnih podskupina prema epitelnoj barijeri koja je stalno izazvana mikrobnim stimulansima7.

Generacija miševa sa nedostatkom Clr-f pružila nam je prvu priliku da procijenimofunkcionalne implikacijeekspresije Clr-f in vivo i omogućio nam je da istražimo potencijalnu imunološku homeostatsku ulogu Clr-f u bubrezima. Oštećenje bubrega uočeno kod Clr-f−/− miševa je u skladu s modelom da smanjenje regulacije Clr-f služi kao indikator ćelijskog stresa i ozljede koje oslobađaju ograničenja na efektorske ćelije koje eksprimiraju NKR-P1G. Povećanje NKR-P1G na T ćelijama u bubrezima Clr-f−/− miševa ukazuje na to da je ili povećana ekspresija NKR-P1G među T ćelijama koje žive u bubrezima u odsustvu Clr-f, ili da je bubrezi Clr- f−/− miševi su podvrgnuti infiltraciji T ćelija koje eksprimiraju NKR-P1G. Odsustvo vidljive promjene u prisutnosti ili distribuciji ćelija koje eksprimiraju NKR-P1G u crijevima Clr-f−/− miševa može ukazivati ​​na to da su funkcionalne posljedice interakcije NKR-P1G: Clr-f u crijevima ograničene na kontrolu imunološke reaktivnosti u kontekstu infekcije, a ne na imunološku toleranciju. Alternativno, redundantne interakcije mogu također kontrolirati aktivnost stanica koje eksprimiraju NKR-P1G. Ovo je potkrijepljeno nalazima da se NKR-P1G vezuje ne samo za Clr-f već i za Clr-d i Clr-g33, od kojih je potonji umjereno eksprimiran u tkivima i bubrega i crijeva6. Dok naši nalazi otkrivaju potrebu za Clr-f za zaštitu od autoimunog oštećenja bubrega, uloga posredovana NKR-P1G u autoimunim patologijama bubrega kod Clr-f−/− miševa je nepotpuna. Primjetno, iako postoji povećanje T ćelija koje eksprimiraju NKR-P1G u bubrezima Clr-f−/− miševa, razlika je ogromna. Moguće je da alternativni receptor učestvuje u nadzoru Clr-f u bubregu. Da bi se u potpunosti odgovorilo na ovu os kontrole u homeostazi bubrega, potrebna su dalja istraživanja

Imunski posredovano oštećenje bubrega tipično je infiltracijom upalnih stanica u intersticijski prostor ili u glomerul34. Bubrežne akumulacije monocita, B i T ćelija, anti-glomerularnih antitela, povišenih IL-12 i IFN citokina i različitih glomerularnih patologija kod Clr-f−/− miševa veoma podsećaju na autoimuni pejzaž modela LN miševa ( tj. MRL-Faslpr)35–37. Iako Clr-f−/− bubrezi pokazuju IgA dominantne mezangijalne naslage sa povezanim taloženjem IgM i IgG, i grupiranjem transkripcionih profila Clr-f−/− i IgAN, verovatno je prerano sugerisati da ovi fenotipovi ukazuju na vrstu CKD sa IgAN38. Umjesto toga, ove ozljede, zajedno sa prisustvom mezangiolize, zadebljanja GBM i smrti podocita u Clr-f−/− bubrezima, kao i tubulointersticijske promjene, nakupljanje masti i značajna disregulacija u metaboličkim putevima, elementi su zajednički za različite patologije. proizilaze iz metaboličkih defekata koje pogoršava imuni sistem37,39,40. Bez obzira na osnovni uzrok ili tip bolesti disfunkcije bubrega kod Clr-f−/− miša, čini se da Clr-f igra ublažavajuću ulogu protiv razvoja autoimunosti sa jasnom patologijom povezanom s glomerulonefritisom.

Naše ispitivanje Rag1−/−Clr-f−/− miševa ukazuje na značajan doprinos medijatora nezavisnih od T i B ćelija autoimunim odgovorima Clr-f−/− miševa. Konkretno, akumulacija periglomerularnih CD11c+ ćelija, F4/80+ ćelija i NKp46+ ćelija bila je još izraženija u odsustvu T i B ćelija i bila je u korelaciji sa značajnim prisustvom oštećenja glomerula. Ovo sugerira da, iako T i B ćelije mogu doprinijeti upalama koje oštećuju bubrege i kompleksima autoantitijela, kod Clr-f−/− miševa oni možda nisu centralne determinante patologije, već sekundarni doprinose upalnoj aktivnosti drugih imunoloških ćelija ili potencijalno imaju imunoregulatornu ulogu kod miševa kojima nedostaje Clr-f. Ovo je u suprotnosti s dokazima iz ddY mišjeg modela IgAN-a koji pokazuje snažan T1 polarizirani odgovor, pri čemu se T ćelije koje proizvode IFN povećavaju s godinama i progresijom glomerularne ozljede41. Infiltracija bubrega B ćelijama kod miševa sa nedostatkom Clr-f takođe je prikazana na mišjim modelima SLE42. Do danas je nejasno da li B ćelije u bubregu doprinose štetnoj upali kod CKD ili imaju više regulatornih uloga43. Nedavni dokazi o CKD-u kod starijih pacijenata otkrili su da je smanjenje populacija B ćelija povezano s progresijom bolesti bubrega44. Pokazalo se da i T i B ćelije imaju imunosupresivnu aktivnost u autoimunim bubrežnim bolestima45,46, i stoga stepen u kojem one doprinose ili regulišu patologije Clr-f−/− miševa zahteva dalje istraživanje.

Naši nalazi zajedno pokazuju potrebu za ekspresijom Clr-f u tubularnom epitelu proksimalnih uvijenih tubula, podocita i/ili intestinalnog epitela. Gubitak ekspresije Clr-f dovodi do izražene autoimune i upalne kaskade koja dovodi do oštećenja bubrega i povezane adipoze. Čini se da su imunološki odgovori izazvani gubitkom Clr-f nezavisni od T i B-ćelija. Sve u svemu, funkcionalna uloga Clr-f u bubrezima može se zamisliti kao inhibitorni molekul za nadzorne efector imune ćelije u bubregu, kao što je postavljeno u crijevima, ili kaointrinzični regulator funkcije tubularnih ćelija.

Materijali i metode Miševi.

Svi miševi su održavani u namjenskom okruženju bez patogena. C57BL/6 (WT) i B6.129S7- Rag1tm1Mom /J (Rag1−/−) miševi su nabavljeni iz Jackson Laboratory (Bar Harbor, ME, SAD). Miševi koji nose kombinovane nulte mutacije u Rag1 i Clr-f (Rag1−/−;Clr-f −/−) nastali su ukrštanjem Clr-f-deficijentnih (Clr f −/−) miševa sa (Rag1−/−) miševima . Sav uzgoj i manipulacije na životinjama bile su u skladu sa univerzitetskim smjernicama i odobrene od strane Odbora za etiku životinja Dalhousie Univerziteta i Institucionalne komisije za njegu i korištenje životinja (IACUC) Univerziteta Ottawa. Svi dizajni studija, eksperimenti i izvještaji na životinjama provedeni su u skladu sa smjernicama ARRIVE.

Generacija miševa sa nedostatkom Clr‑f‑a. Miševi s nedostatkom Clr-f (Clr-f −/−) nastali su homolognom rekombinacijom ciljanog konstrukta koji sadrži foksiranu fosfoglicerat kinazu (PGK)-neomicin kasetu i genomsku sekvencu koja se proteže kroz egzone 3, 4 i dio egzona 5. Clr-f gen. Kompletna ciljana konstrukcija je potvrđena sekvenciranjem u Ottawa Hospitals Research Institute (OHRI) prije elektroporacije u C57BL/6 Bruce{9}} embrionalne matične ćelije (ES). Selekciju ES klona pomoću G{{10}}rezistencije je izvršio IRCM (Montreal Clinical Research Institute) Transgenic Core Facility (Montreal, QC, Kanada). U međuvremenu, 5′ i 3′ Clr-f sonde su testirane u analizi polimorfizma dužine restrikcijskih fragmenata (RFLP) koristeći timusnu genomsku DNK iz WT B6 miša, koji je digestiran sa BamHI i PstI, respektivno. Digested DNK fragmenti su razdvojeni na 1% agaroznom gelu i prebačeni u mrlje od najlonske membrane. Clr-f cDNA sonde su označene radioaktivnim 32P-dCTP (Perkin Elmer, Guelph, ON, Kanada) korištenjem kompleta NEB serije (New England Biolabs, SAD). Blots su ispitani sa 32P-obilježenim Clr-f cDNA sondama u hibridizacijskom rastvoru (10% (w/v) dekstran sulfat; 1 M NaCl; 1% SDS). Hibridizacija je sprovedena preko noći na 65 stepeni, a ispiranja nakon hibridizacije su obavljena rastvorom koji sadrži 2× SSC i 1% SDS prethodno zagrejanim na 65 stepeni. Mrlje su bile izložene fotografskim filmovima kako bi se otkrili hibridizacijski signali (slike S1A, S3B). Membrane su skinute sa 0,2% SSC/0,2% SDS tokom 30 minuta na 85 stepeni između različitih hibridizacija. Klonovi otporni na neomicin su pregledani Southern blot analizom i uočena je efikasnost ciljanja od ~15%. Odabrani ES klonovi su mikroinjektirani u blastociste u IRCM Microinjection Service Facility kako bi se stvorili himerni miševi Clr-flox osnivači. Miševi su pregledani Southern blot analizom i potom su uzgajani sa ženkama B6 kako bi se proizveli Clr-fwt/lox heterozigotni miševi. Heterozigotni miševi su ukrštani da bi se dobili Clr-flox/lox miševi. Da bi se uklonila kaseta neomicina, Clr-flox/lox miševi su uzgajani sa homozigotnim CMV-cre transgenim miševima na pozadini B6 (Jackson Laboratory). Rezultirajući dvostruki heterozigotni CMV-CreTg/0; Clr-f−/+ miševi su ukrštani da bi se proizveli Clr-f−/− miševi kojima je nedostajao CMV-cre transgen. Miševi su genotipizirani upotrebom specifičnih prajmera (tabela 1, slika S1B,C i slika S3C,D). PCR amplifikacija je izvedena pomoću AccuStart II Taq DNK polimeraze (Quanta Biosciences, Gaithersburg, MD, SAD). PCR smjesa je pripremljena prema uputama proizvođača. DNK iz uha ekstrahirana fenolom/kloroformom je korištena kao šablon. Korišteni su sljedeći parametri ciklusa PCR-a: 30 ciklusa amplifikacije od 94 stepena za 40 s, 60 stepeni za 45 s, 72 stepena za 60 s. WT i Clr-f −/− legla su korišteni u svim eksperimentima osim ako nije drugačije naznačeno.

In situ hibridizacija.

In situ hibridizacijske analize Clr-f su postignute kloniranjem pune dužine osjetilnog lanca CDS i antisens lanca koji se proteže Clr-f u pGEM-T Easy vektor kao što je prethodno opisano. Digoxi genin-obeležene antisens i senzorne RNK sonde su transkribovane sa linearizovanih plazmida koji kodiraju Clr-f gen sa T7 polimerazom korišćenjem mešavine DIG RNA obeležavanja (Roche, Basel, Švajcarska). Tkiva su sakupljena od odraslih miševa B6 i fiksirana ili u 10% formalina na sobnoj temperaturi ili u 4% paraformaldehidu na 4 stepena uz lagano mućkanje do 24 h. Tkiva su zatim stavljena u parafin i sekcije od 4 µm su pripremljene na staklenim predmetima. Stakalca tkiva su dekarbonizovana tretmanom sa 0.2 N HCl tokom 15 minuta i 30 µg/mL proteinaze K na 37 stepeni tokom 20 min. Tkivo je fiksirano u 4% PFA u trajanju od 10 minuta nakon čega je uslijedio tretman sa 0,25% anhidridom sirćetne kiseline u 0,1 M trietanolaminu dva puta po 5 minuta. Stakalca su zatim prehibridizovana sa hibridizacionom otopinom (50% (v/v) formamid/5×SSC, pH 4,5; 2% (w/v) blokirajući prah (Roche); 0,05% (w/v) CHAPS; 5 mM EDTA; 50 µg/mL heparina; 1 µg/mL RNK kvasca) u pećnici na 58 stepeni najmanje 1 h, a zatim inkubirano sa hibridizacionim rastvorom koji sadrži 500 ng/mL digoksigeninom obeleženom sondom preko noći na 58 stepeni. Ispiranje nakon hibridizacije obavljeno je sa 50% formamidom/2× SSC, pH 4,5 na 55 stepeni 3× u trajanju od 20 minuta svako, a stakalca su obojena ovčjim anti-digoksigenin alkalnom fosfatazom konjugiranim antitelom u razblaženju 1:1000 u rastvoru za blokiranje ( Roche). Razvijanje boje je izvedeno dodavanjem supstrata nitro plavog tetrazolijuma/5-broma, 4-kloro i 3-indoilfosfata (NBT/BCIP, Roche) na stakalca. Slajdovi su držani u mraku na sobnoj temperaturi dok se ne pojave optimalni signali. Kontrolno obeležavanje je izvedeno korišćenjem sonde sa senzorskim lancima i kompetitivnim studijama vezivanja sa potvrđenom specifičnošću senzorne i antisens sonde. Stakalca su zatim obojena svijetlozelenom ili metil zelenom bojom i vizualizirana pod svjetlosnim mikroskopom.

RT‑PCR. Tkiva bubrega WT i Clr-f −/− miševa podudarnih po dobi i spolu su izrezana, isprana PBS-om i zamrznuta na -80 stepeni. RNK je izolirana iz smrznutih tkiva korištenjem RiboZol RNA reagensa za ekstrakciju (AMRESCO Inc., West Chester, PA, SAD) prema uputama proizvođača. Približno 1 ug RNK je transkribovan u cDNK pomoću Verso cDNA kompleta (Thermo Scientific, Waltham, MA, SAD). PCR amplifikacija je izvedena na 1 μL cDNK proizvoda upotrebom specifičnih prajmera (Tabela 1). Korišćeni PCR uslovi su bili 94 stepena za 30 s, 58 stepeni za 30 s, 72 stepena za 60 s i 35 ciklusa amplifikacije. PCR proizvodi su vizualizirani na 1% agaroznom gelu obojenom etidijum bromidom (slika 1C, slika S3A).

Imunohistohemija.

Tkiva bubrega WT i Clr-f −/− miševa podudarne starosti i spola deparafinizirana su tri 5-minutne inkubacije u ksilenu, dvije 5-minutne inkubacije u 100% etanolu, nakon čega slijedi 90 % etanola, zatim 80% etanola i na kraju 70% etanola. Stakalca su rehidrirana ispiranjem u destilovanoj vodi (20 urona), a uzimanje epitopa izazvano toplotom je izvedeno korišćenjem ekspres lonca u citratnom puferu (pH 6,0). Endogene peroksidaze su blokirane sa 3% vodikovog peroksida u sterilnoj vodi u trajanju od 10 minuta, a proteini su blokirani pomoću Background Sniper-a (Biocare Medical, Pacheco, Kalifornija, SAD). Sekcije su zatim inkubirane sa pacovskim antimišjim monoklonskim anti-Clr-f antitelima7 na 4 stepena preko noći. Sledećeg dana, stakalca su isprana sa 0,1 M PBS i inkubirana 1 h u sekundarnim antitelima. Bojenje je razvijeno korištenjem koze na glodarima HRP-Polymer kita (Biocare Medical) i Betazoid DAB pufera (Biocare Medical), nakon čega je uslijedilo kontra-bojenje hematoksilinom. Isti proces je korišćen za bojenje preseka bubrežnog tkiva za IHC obeležavanje NKp46+ i CD3+ ćelija, korišćenjem anti-NKp46 (eBioscience, Santa Clara, CA, SAD, klon 29A1.4, CAT# 48-3351-82) i anti-CD3 (BioLegend CAT#100,327) kao primarna antitijela. IHC obeležavanje F4/80 izvedeno je na zamrznutim presecima bubrega korišćenjem anti-F4/80 štakorskog monoklonskog BM8 antitela. Korišteno je sekundarno anti-pacovsko IgG H&L HRP-konjugirano antitijelo (Abcam, Cambridge, UK CAT#ab97057) i razvijeni su IHC, korišten je supstrat peroksidaze hrena (HRP) DAB supstrat Kit (Abcam, CAT# ab64238).

Imunofluorescencija.

Bubrežna i/ili crijevna tkiva WT i Clr-f −/− miševa podudarne starosti i spola kriokonzervirana su u 30% saharoze na -80 stepeni u jedinjenju optimalne temperature rezanja Tissue-Tek (Fisher Scientific, Pittsburgh, PA, SAD). Kriostatske sekcije od 20 μm fiksirane su acetonom u dimnoj komori na sobnoj temperaturi 16 minuta i sušene na zraku najmanje 30 minuta, nakon ispiranja u 0,01 M PBS, pH 7,4. Nespecifično vezivanje je blokirano sa 10% magarećeg seruma. Sekcije su inkubirane preko noći na 4 stepena sa primarnim antitelima: anti-Clr-f7, anti-NKR-P1G (monoklonsko anti-mišje monoklonsko antitelo štakora opisano ranije7), anti-IgA (kozji anti-mišji IgA alfa lanac (Abcam, Cambridge , UK CAT#ab97235), anti-IgG-PE (BioLegend, San Diego, CA, SAD CAT#405324, anti-IgM-FITC (Life Technologies, Carlsbad, CA, SAD CAT#A21042), Complement C3 Anti body (11H9 ) (Novus Biologicals, Littleton, CO, USA Cat# NB200-540), anti-IFN -PE (BD-Biosciences, Franklin Lakes, NJ, SAD CAT#554411), anti-IL-12-PE (BD-Pharmingen CAT# 554479), anti-CD45-FITC (BioLegend CAT#103108), anti-CD11c-FITC (eBioscience CAT#11-0114-85), anti-F4/80- APC (BioLegend CAT#123116) i anti-NKp46-eFluor 450 (eBioscience, CAT#48-3351-82) u koncentraciji 1:100 u 5% normalnog seruma u vlažnoj komori. Sekundarna oznaka antitijela anti -Clr-f i anti-NKR-P1G antitijela korištenjem FITC konjugiranih poliklonskih antitijela izvedena su na sobnoj temperaturi inkubacije od 1 h. Uzorci su DAPI nuklearno obojeni na sobnoj temperaturi 5 minuta, isprani PBS i montirani na staklena stakalca s jednom kapi VECTASHIELD-a PLUS antifade montažni medij (Vector Laboratories, San Francisco, CA, SAD) i prekriven staklenim pokrovnim stakalcem. Slajdovi su pregledani pomoću Zeiss LSM 510 laserskog skenirajućeg konfokalnog mikroskopa.

Histološko i patološko bodovanje.

Sekcije bubrega WT, Clr-f −/−, Rag1−/− i Rag1−/−Clr-f −/− miševa (3 μm) podudarne po dobi i spolu obojeni su periodičnom kiselinom-Schif-om (PAS). Bubrežno tkivo je procijenjeno na mezangijalnu celularnost (definirano kao 4 ili više jezgara po mezangijalnom području), endokapilarnu proliferaciju, polumjesece i glomerularnu sklerozu. Presjeci su također procijenjeni na prisustvo tubulopatije, intersticijske fibroze, tubularne atrofije i tubulointersticijskih infiltrata ćelija. Za bodovanje patologije glomerula korišten je semi-kvantitativni rezultat za procjenu stepena oštećenja glomerula. Ispitano je najmanje 50 glomerula u svakoj grupi i težina lezije je ocijenjena od 0 do +3: +1 lezija predstavlja zahvaćenost manje od ili jednako 30% glomerula,+2 od 30-60%, dok+3 lezija ukazuje da je zahvaćeno više od ili jednako 60% glomerula. Mjerenje debljine GBM izvršeno je na glomerularnim elektronskim mikrografijama WT i Clr-f −/− pomoću slike J V1.53a47. PAS obojeno bubrežno tkivo dva Rag1−/− i dva Rag1−/−Clr-f −/− miša dodatno je slepo ocenjeno za prisustvo gore navedenih patoloških karakteristika, a kvantifikovane karakteristike su izračunate iz prosečnih četiri preseka bubrega po miš.

Elektronska mikroskopija.

Obrada tkiva za transmisijsku elektronsku mikroskopiju slijedila je objavljeni protokol48. Ukratko, mali komadi bubrežnog tkiva 12-nedeljnih miševa WT i Clr-f −/− fiksirani su u 2,5% rastvoru glutaraldehida i zatim obrađeni metodom 1% osmijum tetroksid/uranil acetat. Uzorci su ugrađeni u Epon Araldite smolu prije rezanja korištenjem Reichert-Jung ultra cut E ultramikrotoma. Uzorci su vizualizirani na transmisionom elektronskom mikroskopu JEOL JEM 1230, a slike su snimljene pomoću Hamamatsu ORCA-HR digitalne kamere.

Merenje hemikalija i elektrolita urina i plazme.

Približno 150 μL urina dnevno je sakupljeno od 12-nedeljnih mužjaka WT i Clr-f −/− miševa u isto doba dana tokom 5 uzastopnih dana. Urin je centrifugiran na 10,000 o/min da bi se uklonili ostaci, a zatim pohranjen na -80 stepeni. Krv iz vena lica sakupljena je od istih miševa u heparinizirane epruvete i izolovana centrifugiranjem na 3000 g tokom 5 minuta i pohranjena na -80 stepeni. Uzorci urina i plazme poslani su u Idexx Laboratories (Markham, Ontario) radi mjerenja koncentracije proteina, kreatinina i elektrolita.

Mjerenja krvnog pritiska na miševima starim 12 i 24 sedmice. Sistolni i dijastolički krvni pritisak (BP) izmjeren je pletizmografijom repne manžete na 12 i 24-nedjeljnih mužjaka WT i Clr-f −/− miševa u stabilnom stanju korištenjem BP2000 Visitech modela. BP je mjeren svakodnevno u istoj prostoriji iu istom satu dana 5 uzastopnih dana. Vrijednosti krvnog tlaka u posljednja 3 uzastopna mjerenja korištene su za izračunavanje srednje vrijednosti krvnog tlaka jer su prva 2 dana smatrana bitnim za adaptaciju miševa.

Kidney RNA sequencing. For kidney RNA-seq, total RNA was isolated from freshly frozen kidneys of three age- and sex-matched WT and Clr-f −/− mice at 7, 13, and 24 weeks of age using TRIzol (Thermo Fisher Scientific) and RNA Clean & Concentrator-5 kit (Zymo Research, Irvine, CA, USA). RNA samples were sent to Genome Quebec Innovation Centre, McGill University, Montreal, QC for library preparation and RNA-seq. RNA-seq was performed on the Illumina HiSeq 4000 platform, with paired-end reads, at>30×106 dubina čitanja po uzorku.

RNA‑seq analysis. Te quality of the sequencing reads was inspected using FastQC tool V0.11.5 (http:// www.bioinformatics.babraham.ac.uk/projects/fastqc/) and reads with a Phred quality score of 30 over 90% of the reads were retained utilizing the Fastx-toolkit V0.0.13 (http://hannonlab.cshl.edu/). Next, the high-quality reads were mapped to the mouse GENCODE M25 annotation database (GRCm38.p6)49 using the STAR aligner V2.7.5a50. STAR aligner was then used to remove duplicates, create transcriptome hits count tables, and generate wiggle fles. Subsequently, DESeq2 package V1.28.151 was used to remove hits with CPM values less than 1 and calculate differentially expressed genes with FDR-transformed P-value>{{0}}.05 i odsječak promjene bilježenja od 1,5. Date su FPKM vrijednosti za sve vremenske tačke i uzorke (Dopunski skup podataka 1). Analiza funkcionalnog obogaćivanja. Ontologija gena i analiza funkcionalnog obogaćivanja izvršena je pomoću g: Profilera (verzija e102_npr49_p15_7a9b4d6) sa g: SCS metodom korekcije višestrukog testiranja primjenom praga značajnosti od 0,05 (https: //biit.cs.ut.ee/gprofiler/gost) 52 i PANTHER klasifikacijski sistem s Fisherovim egzaktnim testiranjem i FDR pragom od<0.05 (http://pantherdb.org/citePanther.jsp) 53. 

Mreže za funkcionalno obogaćivanje kreirane su korištenjem genskih skupova GO bioloških procesa (GO: BP) za Mus Musculus (GRCm38. p6) BioMart izdanje: 2020-12-08 preuzeto sa g: Profiler (https://biit.cs.ut.ee /gprofiler/gost). Analiza obogaćivanja skupa gena (GSEA) izvedena je pomoću GSEA V4.0354,55 koristeći obogaćivanje mreže na osnovu FDR-a<0.05. Networks were assembled, curated, and visualized using Cytoscape V3.7.156. Heatmaps were generated and clustered by Euclidian distance using Morpheus (https://sofware.broadinstitute.org/morpheus).

Abdominalna i ektopična analiza lipida. Akumulacija masti određivana je težinom abdominalne masti izdvojene iz pojedinačnih miševa. Mjerenja tjelesne težine vršena su prije ekstrakcije masti. Za bojenje Oil Red O (ORO), zamrznuti delovi bubrega su isečeni na 10 μm pomoću kriostata i zatim sušeni na vazduhu 30 minuta. ORO bojenje je izvedeno fiksiranjem rezova sa 3 ispiranja 60% izopropanola, inkubiranjem sa radnom koncentracijom (66%) ORO rastvora (Sigma-Aldrich, St. Louis, MO, USA) bojenjem u trajanju od 15 minuta. Stakalca su zatim brzo isprana sa 60% izopropanola, brzo obojena Mayerovim hematoksilinom da bi se istakla jezgra, a zatim montirana pomoću VectaMount AQ vodenog medija za montažu (Vector Laboratories).

Analiza patotipa. Analiza patotipa je izvršena korišćenjem Diferencijalno izraženih gena (DEG) sa q<0.05 identified from RNA-seq of WT and Clr-f −/− 13-week-old mouse kidneys. Signifcant Clr-f −/− DEGs with identifiable ENSEMBL human orthologs were compared with DEGs of 15 human kidney disease expression sets (disease versus healthy kidney)57–64 downloaded from Nephroseq database at (http://www.nephroseq.org) (Supplementary Dataset File 2)65. Clr-f −/− mouse and human kidney disease DEG sets were hierarchically clustered by Euclidean distance and graphed in a similarity matrix using the Morpheus software (https://sofware.broad institute.org/morpheus). Functional enrichment using g: Profler, (using parameters described above) was performed on four groups of expression clusters with corresponding increased and decreased DEGs and non-corresponding DEGs from the compared expression profiles of Clr-f −/− and IgA nephropathy (IgAN) kidney disease. Flow cytometry. Kidneys from age- and sex-matched WT and Clr-f −/− mice were harvested, homogenized in a Petri dish on ice with RPMI media containing collagenase type 4 (2 mg/mL) (Fisher), and incubated at 37 °C for 30 min with gentle agitation. 

Probavljeno tkivo je propušteno kroz 70- μm najlonski filter, ispran PBS, a preostale crvene ćelije su lizirane ACK puferom za lizu 5 minuta na ledu. Imune ćelije bubrega izolovane su RT centrifugiranjem na 2000 rpm tokom 30 minuta u 40% Percoll. Ćelijska peleta je resuspendovana u PBS-u, a broj ćelija je dobijen hemocitometrom. Korištena su različita mAb za provjeru ekspresije proteina na površini ćelije, ćelije su obojene za analizu fow citometrije sa mišjim antitijelima označenim fluorohromom: anti-CD45 (eBioscience, klon 30-F11), anti-TCR (eBioscience, klon H{ {12}}), anti-NK1.1 (eBioscience, klon PK136), anti-CD19 (BioLegend, klon 1D3/CD19), anti-CD11b (BioLegend, klon M1/70), anti-F4/80 (BioLegend, klon BM8), anti-MHCII(IA/IE) (BioLegend, klon M5/114.15.2), anti-Ly6G (BioLegend, klon 1A8), anti-NKp46 (eBioscience, klon 29A1.4) i kontrole izotipa. Vijabilnost ćelije je određena upotrebom boje za fiksiranje (eBioscience, Cat# 65-0865-14). Za identifikaciju i kvantificiranje populacija imunoloških ćelija u WT i Clr-f −/− bubrezima, korištene su multiparametarske analize fow citometrije korištenjem antitijela protiv ćelijsko-specifičnih markera za identifikaciju neutrofila (CD11b+Ly6G+), makrofaga (CD11b+Ly6G−F4 {57}}MHCII+), NK ćelije (CD11bloLy6G-TCR -NK1.1+) i NKp46+ ćelije (CD11bloLy6G-TCR-NKp46+), T ćelije (Ly6G-NK1 .1−TCR +) i B ćelije (CD11b−Ly6G−TCR −CD19+). Svi uzorci su uzeti na BD-Fortessa fow citometru.

Reference

1. Hato, T. & Dagher, PC Kako urođeni imuni sistem osjeća probleme i uzrokuje nevolje.Clin. J. Am. Soc. Nefrol.10, 1459–1469 (2015).

2. Krüger, T.et al.Identifikacija i funkcionalna karakterizacija dendritskih stanica u zdravom mišjem bubregu iu eksperimentalnomglomerulonefritis.J. Am. Soc. Nefrol.15, 613–621 (2004). 

3. Weisheit, CK, Engel, DR & Kurts, C. Dendritske ćelije i makrofagi: Sentineli u bubrezima.Clin. J. Am. Soc. Nefrol.10, 1841–1851 (2015).

4. Woltman, AMet al.Kvantifikacija podskupova dendritskih ćelija u ljudskom bubrežnom tkivu u normalnim i patološkim uslovima.Kidney Int.71, 1001–1008 (2007). 5. Gottschalk, C.et al.Dendritične ćelije zavisne od Batf3-u bubrežnom limfnom čvoru indukuju toleranciju na cirkulišuće ​​antigene.J. Am.Soc. Nefrol.24, 543–549 (2013).

6. Zhang, Q.et al.Sekvencija klastera gena Nkrp1-Clr i analize ekspresije otkrivaju očuvanje tkivno specifičnog MHC-anezavisni imunološki nadzor.PLoS One7, e50561 (2012).

7. Leibelt, S.et al.Namjensko imunosenzivanje crijevnog epitela miša uz pomoć para genetski spregnutih lektinskihreceptori.Mucosal Immunol.

8, 232–242 (2015). 8. Rahim, MMAet al.Miš NKR-P1B: Clr-b sistem prepoznavanja je negativan regulator urođenih imunoloških odgovora.Krv125, 2217–2227 (2015). 

9. Carlyle, JRet al.Nedostaje samoprepoznavanje Ocil/Clr-b od strane inhibitornih NKR-P1 prirodnih receptora ćelija ubica.Proc. Natl. Akad. Sci.U.S.A. 101, 3527–3532 (2004). 

10. Rutkowski, E.et al.Clr-a: Nova molekula slična lektinu C-tipa povezana sa imunitetom isključivo eksprimirana u epitelu crijeva miša.J. Immunol.198, 916–926 (2017).

11. Balaji, GRet al.Prepoznavanje domaćina Clr-b od strane inhibitornog NKR-P1B receptora pruža osnovu za prepoznavanje nestalog sebe.Nat.Commun.9, 4623 (2018)

12. Friede, ME, Leibelt, S., Dudziak, D. & Steinle, A. Odabir ekspresije Clr-g na aktiviranim dendritskim stanicama olakšava srodnu interakcijusa manjim podskupom NK ćelija slezene koje eksprimiraju inhibitorni Nkrp1g receptor.J. Immunol.200, 983–996 (2018). 

13. Abou-Samra, E.et al.Ekspresija NKR-P1B u urođenim limfoidnim stanicama povezanim s crijevima potrebna je za kontrolu gastrointestinalnog traktainfekcije trakta.Cell. Mol. Immunol.16, 868–877 (2019).

14. Germain, C.et al.Karakterizacija alternativno spojenih varijanti transkripta CLEC2D gena.J. Biol. Chem.285, 36207–36215 (2010).

Wecistanche usluga podrške - najveći izvoznik cistanchea u Kini:

Email:wallence.suen@wecistanche.com

Whatsapp/tel:+86 15292862950

Kupite za više detalja o specifikacijama:

https://www.xjcistanche.com/cistanche-shop

NABAVITE PRIRODNI ORGANSKI EKSTRAKT CISTANCHE SA 25% EHINAKOZIDA I 9% AKTEOZIDA ZA INFEKCIJU BUBREGA