Kloniranje, funkcionalna identifikacija i analiza ekspresije halkon sintaze iz Cistanche Tubulosa
Mar 25, 2024
Sažetak: Cilj Proučiti funkciju halkon sintaze iz Guanhuaroucongrong (Cistanche tubulosa) i obrazac ekspresije CtCHS gena u bijelim, crvenim i ljubičastim cvjetovima.
Metode CtCHS gen je kloniran RT-PCR i izvršena je bioinformatička analiza. PET-28a-CtCHS plazmid je prebačen u Escherichia coli da indukuje ekspresiju proteina putem IPTG-a. CtCHS rekombinantni protein je inkubiran sa supstratima p-kumaroil CoA i malonil CoA, a proizvodi su detektovani HPLC i MS. PCAMBIA1300-35S-GFP-CtCHS plazmid je prebačen u protoplast Arabidopsis thaliana da bi se posmatrala subcelularna lokalizacija CtCHS proteina. Obrazac ekspresije CtCHSgene u cvijećuC. tubulosasa tri boje detektovan je qRT-PCR.
Rezultati CtCHS gen je kloniran. Dužina otvorenog okvira čitanja (ORF) bila je 1173 bp, kodirajući 390 aminokiselina, a molekularna težina proteina je bila 42 8000. CtCHS je sadržavao katalitičke ostatke Cys164, His303, Asn336, koji su konzervirani u halkon sintazi. CtCHSprotein je eksprimiran u E. coli i pročišćen da bi se dobio rekombinantni protein. CtCHS protein mogao bi katalizirati p-kumaroil CoA i malonil CoA za proizvodnju naringenin halkona. CtCHS protein je uglavnom bio lokaliziran u citoplazmi. CtCHS gen je visoko eksprimiran u ljubičastim i crvenim cvjetovima, a relativni nivoi ekspresije bili su 8,44 i 3,21 puta veći nego u bijelim cvjetovima.
Zaključak CtCHS gen je kloniran iz cvijetaC. tubulosai protein je eksprimiran. CtCHSprotein ima funkciju halkon sintaze, a ekspresija gena CtCHS je veća u tamnijim cvjetovima, što ukazuje da CtCHSgene može regulirati boju cvijeta C. tubulosa, što postavlja temelj za dalja istraživanja omehanizam regulacije boje cvijeća C. tubulosa.
Ključne riječi:Cistanche tubulosa (Schenk) Wight; halkon sintaza; analiza aktivnosti enzima; subcelularna lokalizacija; Expressionanalysis
KLIKNITE OVDJE DA DOBIJETE PRIRODNI ORGANSKI EKSTRAKT CISTANCHE SA 30% EHINAKOZIDA I 12% AKTEOZIDA
Wecistanche usluga podrške - najveći izvoznik cistanchea u Kini:
Email:wallence.suen@wecistanche.com
Whatsapp/tel:+86 15292862950
Kupite za više detalja o specifikacijama:
https://www.xjcistanche.com/cistanche-shop
Biosintetičkiput flavonoidapočinje fenilpropanoidnim putem.fenilalaninse prvo pretvara u cimetnu kiselinu poddjelovanje fenilalanin amonijaliaze(PAL), a cimetna kiselina je 4-hidroksilirana cimetnom kiselinom. Enzim (cimetova kiselina-4-hidroksilaza, C4H) i 4-kumaratkoenzim A ligaza (4-kumaratkoenzim A ligaza, 4CL) kataliziraju reakciju za stvaranje 4-kumaroil-CoA [11 ]. Jedan molekul 4-kumaroil-CoA i tri molekula malonil-CoA katalizira halkon sintaza (CHS) da generira naringenin halkon, koji ima flavonoidna jedinjenja Osnovni kostur halkon izomeraze, flavanon{{12}, dihidroflavonol 4-reduktaza, itd. stvara različite flavonoide kao što su izoflavoni, flavonoli, antocijani, itd. [12]. Kao ključni enzim u putu biosinteze flavonoida, CHS reguliše sadržaj flavonoida u biljkama, a također igra važnu ulogu u regulaciji boje cvjetova biljaka [13]. Na primjer, post-transkripcijsko utišavanje gena Gentiana scabra Bunge CHS može inhibirati biosintezu antocijanina i uzrokovati specifično izbjeljivanje režnjeva vjenčića [14]. Utišavanje CHS gena Actinidia erianthaBenth. CHS smanjuje sadržaj antocijana u laticama i čini latice crvenim. Latice postaju svjetlije[15]. Stoga je u ovoj studiji kloniran CtCHS gen iz cvjetova Cistanche tubulosa, a na njemu su obavljena bioinformatička analiza, prokariotska ekspresija i pročišćavanje, analiza aktivnosti enzima, analiza subcelularne lokalizacije i analiza ekspresije u tri boje cvijeća kako bi se istražila funkcija CtCHS. protein i obrazac ekspresije CtCHS gena korišteni su za preliminarno istraživanje odnosa između CtCHS i boje cvijeta Cistanche tubulosa, što je postavilo temelje za proučavanje regulatornog mehanizmaCistanche tubulosa boja cvijeta.
1 Materijali i instrumenti
1.1 Materijali
Cvjetovi Cistanche tubulosa sakupljeni su iz okruga Yutian, prefektura Hotan, Xinjiang u svibnju 2018. godine. Prilikom uzorkovanja slijedio je nasumični princip i odabrani su cvjetovi Cistanche tubulosa dobrog fiziološkog statusa i dosljedne visine biljke. Tri soja Cistanche tubulosa sa tri boje cvijeta bijele, crvene i ljubičaste uzete su i identificirane kao Cistanche tubulosa (Schenk) Wight od strane profesora Tu Pengfeija sa Fakulteta farmacije Univerziteta u Pekingu. Brzo su zamrznuti u tečnom azotu, a zatim transportovani u Peking u skladište suvog leda. Hemijski kompetentne ćelije E. coli DH5 kupljene su od Nanjing Novezan Biotechnology Co., Ltd., a hemijski kompetentne ćelije E. coli BL21 (DE3) kupljene su od Beijing Quanshijin Biotechnology Co., Ltd.; pET-28a, pCAMBIA1300-35S-GFP Vektor je kupljen od Wuhan Transduction Biology Laboratory Co., Ltd. Malonyl-CoA je kupljen od kompanije Sigma, 4-kumaroil-CoA, naringenin -kalkon je kupljen od Shanghai Yuanye Biotechnology Co., Ltd., a naringenin je kupljen od Shanghai McLean Biochemical Technology Co., Ltd.
1.2 Instrumenti
Nanodrop 2000C spektrofotometar (Thermo Fisher Company, SAD); gradijent PCR instrument (Eppendorf Company, Njemačka); CFX 96 fluorescentni kvantitativni PCR instrument, UVP gel imager, instrument za gel elektroforezu, instrument za elektroforezu proteina (BioRad Company, SAD) ;EnSpire
Čitač mikropločica (PerkinElmer Company, SAD); inkubator konstantne temperature (Shanghai Jinghong Experimental Equipment Co., Ltd.); DHZ-D oscilator punog kapaciteta velikog kapaciteta (Taicang Experimental Equipment Factory); THZ-82Oscilator konstantne temperature vodenog kupatila (Jiangsu Kexi Instrument Co., Ltd.); AIRTECH ultra čist radni sto (Suzhou Antai Air Technology Co., Ltd.); parni sterilizator visokog pritiska (TOMY Company, Japan); Milli Q instrument za čistu vodu (Millipore, Sjedinjene Države); LC-20Hromatograf tečne faze visoke efikasnosti (Shimadzu Company, Japan); UPLC-Q-Exactive-Orbitrap masena spektrometrija visoke rezolucije (Thermo Fisher Company, SAD); FV1200 laserski konfokalni mikroskop (Olympus Company, Japan).
2 Eksperimentalne metode
2.1 Ekstrakcija RNK i sinteza cDNK.
Cvjetovi Cistanche tubulosa su mljeveni u tekućem dušiku, a zatim podvrgnuti testu ekstrakcije RNK.
Ukupna RNK je ekstrahovana pomoću kompleta (Norgen, Cat 17200), koncentracija i kvalitet RNK su detektovani pomoću NanoDrop 2000C, a uzorci RNK sa odnosom A260/A280 između 1,8 i 2,1 su odabrani za reverznu transkripciju radi sinteze cDNK. M-MLV reverzna transkriptaza (Promega, M170B) korištena je za reverznu transkripciju kvalifikovane ukupne RNK u cDNK. Eksperimentalne operacije izvedene su prema uputama.
2.2 Kloniranje CtCHS gena
Na osnovu podataka transkriptoma cvijeta Cistanche tubulosa naše istraživačke grupe [16], CtCHS sa kompletnim otvorenim okvirom čitanja je skriniran, a softver SnapGene je korišten za dizajniranje specifičnih prajmera na osnovu genske sekvence (Tabela 1). PCR amplifikacija je izvedena koristeći cDNK cvijeta Cistanche tubulosa kao šablon. Sistem amplifikacije je bio 2×Phanta Max pufer 25 μL, dNTPMix (10 mmol/L) 1 μL, uzvodni i nizvodni prajmeri (10 μmol/L) po 2 μL, cDNK 2 μL, Phanta Max Super-Fidelity DNK polimeraza 1 μL, ddH2O 17 μL. Reakcioni uslovi su bili: preddenaturacija na 95 stepeni tokom 3 min; 25 ciklusa denaturacije na 95 stepeni u trajanju od 15 s, žarenja na 55 stepeni u trajanju od 15 s i ekstenzije na 72 stepena u trajanju od 1 min; produžetak reakcije na 72 stepena 5 min. PCR proizvod je detektovan elektroforezom 1% agaroznog gela, a komplet za pročišćavanje DNK (Novizan, Cat DC301-01) je korišten za oporavak gela, a zatim je obnovljena DNK pročišćena kompletom za brzo kloniranje (Novizan, Cat C601-01). Fragment DNK je ligiran sa pCE2TA/Blunt-Zero vektorom, transformisan u Escherichia coli DH5 kompetentne ćelije, i nakon kultivisanja preko noći na 37 stepeni, odabrani su pojedinačni klonski sojevi i poslani u kompaniju na sekvencioniranje.
Tabela 1 Prajmer sekvence
2.3 Bioinformatička analiza
Koristite ProtParam online softver za analizu fizičkih i hemijskih svojstava proteina; koristite online alat Prot Scale za analizu hidrofilnosti/hidrofobnosti proteina; koristite online alat SOPMA za predviđanje sekundarne strukture proteina; koristiti softver za online analizu SWISS-MODEL za predviđanje tercijarne strukture proteina; koristite online softver TMHMM Predvidite transmembransku strukturu proteina; koristite DNAMAN softver da uporedite homologiju CtCHS sa CHS aminokiselinskim sekvencama drugih vrsta; koristite MEGA-X softver za izgradnju filogenetskog stabla, koristeći spajanje susjeda (NJ) i Poissonovu korekciju. Evolucijska udaljenost se izračunava korištenjem Bootstrap metode, a broj Bootstrap ponavljanja je 1000 puta.
2.4 CtCHS prokariotska ekspresija i pročišćavanje
Dizajnirajte prajmere sa restrikcijskim mestima BamHⅠ i XhoⅠ na osnovu CtCHS sekvence, i PCR amplificiraju odgovarajuće ciljne fragmente. Vektor pET-28a i ciljni fragment su digestirani korištenjem endonukleaza BamHI i Klonirani soj je sekvenciran, a plazmid je ekstrahiran nakon ispravnog sekvenciranja. PET-28a-CtCHS plazmid verifikovan sekvenciranjem je prebačen u ćelije kompetentne za Escherichia coli BL21 (DE3). Pogledajte metodu Ding Ninga et al. [17] sa izopropilom
-D-tiogalaktopiranozid (IPTG) je korišten za induciranje ekspresije proteina na niskoj temperaturi i pročišćen je kroz Ni2+ kolonu afinitetne hromatografije (Cytiva, Cat 17531901). Protein je koncentriran centrifugiranjem u ultrafiltracijskoj cijevi (Millipore, 30 000) i odsoljen. Čuvajte u puferu od 20 mmol/L KPB (pH 8,0, koji sadrži 1 mmol/LEDTA) i čuvajte u frižideru od -80 stepeni za dugotrajno skladištenje.
2.5 Analiza aktivnosti enzima CtCHS
CtCHS enzimski reakcioni sistem: 100 mmol/L KPB (pH 7,5) 468 μL, 1 mmol/L malonil-CoA 10 μL, 5 mmol/L 4-kumaroil-CoA 2 μL, CtCHS rekombinant proteina 20 μL, u Nakon reakcije u vodenom kupatilu na 37 stepeni tokom 12 sati, smeša je ekstrahovana tri puta sa 800 μL etil acetata, osušena protokom azota, a zatim rastvorena u 100 μL metanola. Koristite tečnu hromatografiju visokih performansi za detekciju proizvoda. Uslovi su Ultimate LP-C18 kolona (250 mm × 4,6 mm, 5 μm), temperatura kolone 30 stepeni, zapremina uzorka 10 μL i voda (A) i acetonitril (B) kao protok. Faza, gradijent eluiranja: 0~10
min, 30% B; 10~20 min, 30%~60% B; 20~25 min, 60%~70% B; 25~30 min, 70%~80% B; 30~35 min, 80%~100 % B; 35-40 min, 100% B; 40-46 min, 100%-30% B. Volumetrijski protok je 1 mL/min, a detekcija je na talasnoj dužini od 290 nm.
Za dalju detekciju je korišten UPLC-Q-Exactive-Orbitrap MS. Uslovi tečne faze su bili Waters Acquity UPLC BEH SheildRP18 kolona (100 mm × 3.0 mm, 1,7 μm), temperatura kolone 40 stepena, naringenin- kontrole halkona i naringenina. Volumen punjenja proizvoda je 4 μL, a volumen punjenja proizvoda enzimske reakcije je 7 μL. Kao mobilna faza koristi se voda (A)-acetonitril (B). Gradijent eluiranja je: 0 do 5 min, 30% B; 5 do 15 min, 30 %-60% B; 15-20 min, 60%-100% B; 20-25 min, 100% B; 25-31 min, 100%-30% B. Volumetrijski protok je 0,3 mL/min. Uslovi masene spektrometrije su elektrosprej jonski izvor, azot kao gas nosač, pritisak gasa u omotaču 3,5 MPa, pritisak pomoćnog gasa 1,0 MPa, pritisak raspršivanja 3500 V, temperatura kapilara 350 stepeni, temperatura zagrevanja pomoćnog gasa 200 stepeni, pozitivni i negativni jonski režimi, skeniranje opseg jona m/z je 100-1500, puna MS rezolucija je 35 000, dd-MS2 rezolucija je 17 500, (N)
CE/stepped nce postavljeno na 35, 60.
2.3 Bioinformatička analiza
Koristite ProtParam online softver za analizu fizičkih i hemijskih svojstava proteina; koristite online alat Prot Scale za analizu hidrofilnosti/hidrofobnosti proteina; koristite online alat SOPMA za predviđanje sekundarne strukture proteina; koristiti softver za online analizu SWISS-MODEL za predviđanje tercijarne strukture proteina; koristite online softver TMHMM Predvidite transmembransku strukturu proteina; koristite DNAMAN softver da uporedite homologiju CtCHS sa CHS aminokiselinskim sekvencama drugih vrsta; koristite MEGA-X softver za izgradnju filogenetskog stabla, koristeći spajanje susjeda (NJ) i Poissonovu korekciju. Evolucijska udaljenost se izračunava korištenjem Bootstrap metode, a broj Bootstrap ponavljanja je 1000 puta.
2.4 CtCHS prokariotska ekspresija i pročišćavanje
Dizajnirajte prajmere sa restrikcijskim mestima BamHⅠ i XhoⅠ na osnovu CtCHS sekvence, i PCR amplificiraju odgovarajuće ciljne fragmente. Vektor pET-28a i ciljni fragment su digestirani korištenjem endonukleaza BamHI i Klonirani soj je sekvenciran, a plazmid je ekstrahiran nakon ispravnog sekvenciranja. PET-28a-CtCHS plazmid verifikovan sekvenciranjem je prebačen u ćelije kompetentne za Escherichia coli BL21 (DE3). Pogledajte metodu Ding Ninga et al. [17] sa izopropilom
-D-tiogalaktopiranozid (IPTG) je korišten za induciranje ekspresije proteina na niskoj temperaturi i pročišćen je kroz Ni2+ kolonu afinitetne hromatografije (Cytiva, Cat 17531901). Protein je koncentriran centrifugiranjem u ultrafiltracijskoj cijevi (Millipore, 30 000) i odsoljen. Čuvajte u puferu od 20 mmol/L KPB (pH 8,0, koji sadrži 1 mmol/LEDTA) i čuvajte u frižideru od -80 stepeni za dugotrajno skladištenje.
2.5 Analiza aktivnosti enzima CtCHS
CtCHS enzimski reakcioni sistem: 100 mmol/L KPB (pH 7,5) 468 μL, 1 mmol/L malonil-CoA 10 μL, 5 mmol/L 4-kumaroil-CoA 2 μL, CtCHS rekombinant proteina 20 μL, u Nakon reakcije u vodenom kupatilu na 37 stepeni tokom 12 sati, smeša je ekstrahovana tri puta sa 800 μL etil acetata, osušena protokom azota, a zatim rastvorena u 100 μL metanola. Koristite tečnu hromatografiju visokih performansi za detekciju proizvoda. Uslovi su Ultimate LP-C18 kolona (250 mm × 4,6 mm, 5 μm), temperatura kolone 30 stepeni, zapremina uzorka 10 μL i voda (A) i acetonitril (B) kao protok. Faza, gradijent eluiranja: 0~10
min, 30% B; 10~20 min, 30%~60% B; 20~25 min, 60%~70% B; 25~30 min, 70%~80% B; 30~35 min, 80%~100 % B; 35-40 min, 100% B; 40-46 min, 100%-30% B. Volumetrijski protok je 1 mL/min, a detekcija je na talasnoj dužini od 290 nm.
Za dalju detekciju je korišten UPLC-Q-Exactive-Orbitrap MS. Uslovi tečne faze su bili Waters Acquity UPLC BEH SheildRP18 kolona (100 mm × 3.0 mm, 1,7 μm), temperatura kolone 40 stepena, naringenin- kontrole halkona i naringenina. Volumen punjenja proizvoda je 4 μL, a volumen punjenja proizvoda enzimske reakcije je 7 μL. Kao mobilna faza koristi se voda (A)-acetonitril (B). Gradijent eluiranja je: 0 do 5 min, 30% B; 5 do 15 min, 30 %-60% B; 15-20 min, 60%-100% B; 20-25 min, 100% B; 25-31 min, 100%-30% B. Volumetrijski protok je 0,3 mL/min. Uslovi masene spektrometrije su elektrosprej jonski izvor, azot kao gas nosač, pritisak gasa u omotaču 3,5 MPa, pritisak pomoćnog gasa 1,0 MPa, pritisak raspršivanja 3500 V, temperatura kapilara 350 stepeni, temperatura zagrevanja pomoćnog gasa 200 stepeni, pozitivni i negativni jonski režimi, skeniranje opseg jona m/z je 100-1500, puna MS rezolucija je 35 000, dd-MS2 rezolucija je 17 500, (N)
CE/stepped nce postavljeno na 35, 60.
2.6 Subcelularna lokalizacija CtCHS proteina
Na osnovu CtCHS sekvence i principa bešavnog kloniranja, dizajnirani su prajmeri sa mestima za rezanje enzima Kpn Ⅰ i BamH Ⅰ, a odgovarajući ciljni fragmenti su amplificirani PCR-om. PCAMBIA1300-35S-GFP plazmid je digestiran restrikcijskim endonukleazama Kpn Ⅰ i BamH Ⅰ, a ciljni fragment i vektor su povezani preko kompleta za bešavno kloniranje (Novizan, Cat C115-01), a zatim prebačeni u E. coli DH5 kompetentne ćelije. , odabrati pojedinačne klonske sojeve za sekvenciranje i izdvojiti plazmide iz ispravnih sojeva. Plazmidi pCAMBIA1300-35S-GFP-CtCHS i pCAMBIA 1300-35S-GFP transformirani su u protoplaste Arabidopsis thaliana korištenjem PEG4000 i kultivirani pri slabom svjetlu 8 do 10 sati. Subcelularna lokalizacija CtCHS proteina uočena je pod laserskim konfokalnim mikroskopom.
2.7 Analiza uzorka ekspresije CtCHS
Fluorescentni kvantitativni prajmeri u realnom vremenu dizajnirani su koristeći DNAMAN baziran na CtCHS sekvenci, sa F-box kao internim referentnim genom. Sekvence prajmera su prikazane u Tabeli 1. Relativna ekspresija CtCHS u cvjetovima Cistanche tubulosa različitih boja detektirana je fluorescentnim kvantitativnim PCR-om u realnom vremenu. Koristite TransStart Green qPCR SuperMix (puno zlato, AQ101-02) za mjerenje SYBRGreen metodom fluorescentne boje. Reakcioni sistem: 2×TransStartGreen qPCR SuperMix 5 μL, uzvodni i nizvodni prajmeri (10 μmol/L) 0.2 μL svaki, cDNK šablon 0,5 μL, korišćeno je 4,1 μL vode bez nukleotidaze za reakciju metodom u dva koraka. Reakciona procedura je zasnovana na metodi Dong Xianjuan et al. [18]. Svaki uzorak je sadržavao 3 biološke replike, a eksperiment je ponovljen tri puta. Eksperimentalni podaci su analizirani pomoću Excela, relativna ekspresija CtCHS je izračunata metodom 2−ΔΔCt, a GraphPadPrism 8 je korišten za analizu značajnosti i crtanje histograma.
