Kloniranje, funkcionalna identifikacija i analiza ekspresije halkon sintaze iz Cistanche Tubulosa

Apstrakt: Cilj

Za proučavanje funkcijehalkon sintaza iz Cistanche tubulosai obrazac ekspresije CtCHS gena u bijelim, crvenim i ljubičastim cvjetovima.

MetodeCtCHS gen je kloniran RT-PCR i izvršena je bioinformatička analiza. PET-28a-CtCHS plazmid je prebačen u Escherichia coli da indukuje ekspresiju proteina pomoću IPTG. CtCHS rekombinantni protein je inkubiran sa supstratima p-kumaroil CoA i malonil CoA, a proizvodi su detektovani HPLC i MS. PCAMBIA1300-35S-GFP-CtCHS plazmid je prebačen u protoplast Arabidopsis thaliana da bi se posmatrala subćelijska lokalizacija CtCHS proteina. Obrazac ekspresije CtCHS gena u cvjetovima C. tubulosa sa tri boje detektovan je qRT-PCR.

RezultatiCtCHS gen je kloniran. Dužina otvorenog okvira čitanja (ORF) bila je 1173 bp, kodirajući 390 aminokiselina, a molekularna težina proteina bila je 42 8000.

ORGANSKI EKSTRAKT CISTANCHE SA 30% EHINAKOZIDA I 12% AKTEOZIDA

CtCHS je sadržavao katalitičke ostatke Cys164, His303, Asn336, koji su konzervirani u halkon sintazi. CtCHS protein je eksprimiran u E. coli i pročišćen da bi se dobio rekombinantni protein. CtCHS protein mogao bi katalizirati p-kumaroil CoA i malonil CoA za proizvodnju naringenin halkona. CtCHS protein je uglavnom bio lokaliziran u citoplazmi. CtCHS gen je bio visoko eksprimiran u ljubičastim i crvenim cvjetovima, a relativni nivoi ekspresije su bili 8,44 odnosno 3,21 puta veći nego u bijelim cvjetovima.

Zaključak CtCHS gen je kloniran iz cvijeta C. tubulosa i eksprimiran je protein. CtCHS protein ima funkciju halkon sintaze, a ekspresija CtCHS gena je veća u tamnijim cvjetovima, što ukazuje da gen CtCHS može regulirati boju cvijeta C. tubulosa, što postavlja temelj za dalja istraživanja mehanizma regulacije boje cvijeta C. tubulosa.

Ključne riječi: Cistanche tubulosa (Schenk) Wight; halkon sintaza; analiza aktivnosti enzima; subcelularna lokalizacija; analiza izraza

Cistanche Tubulosa(SCHENK) WIGHT je biljka iz roda Pyreal, koja je prirodno rasprostranjena u južnom Xinjiangu [1] u oblasti Hetian u Xinjiangu [2]. Cvjetovi lule imaju visoku ljekovitu vrijednost. Njegove mesne stabljike su jedan od izvora verzije za 2020. "Kineska farmakopeja". [3] Istraživanja na cvjetovima lule stabljike mesa kordonusa su se povećala, ali postoji relativno malo bioloških istraživanja na njegovim cvjetovima. Period cvatnje cvjetova lule je od aprila do maja [4], uglavnom postoje tri boje bijele , crvena i ljubičasta cvjetovi su bogate boje, ali njihov mehanizam regulacije boje nije prijavljen i genetski faktori [5] Pigment u biljnom cvijeću uglavnom uključuje tri kategorije: flavonoide, karoten i beetin, najširi spektar boja [7]. kao tri varijante Paeonia Lactiflora Pall.

Javlja se kao bijela, a glavna boja boje sadrži boju crvene i lijepa kompetencija čini cvijeće prisutnim kao ljubičasto-crveno [8]. Boja cvijeta je važna karakteristika mnogih ukrasnih biljaka, a ujedno je i ključni faktor koji privlači ružičaste insekte [9]. Istraživanja su pokazala da se prenosi. Najveća učestalost posjeta insekata je biljka tamnoljubičaste cistanche [10]. Za biološka istraživanja o sintetičkim genetskim istraživanjima cistanoida u cvjetovima cvjetova cistanosaurusa, pogodno je za pojašnjavanje mehanizma kontrole bojenja kordona cvijeća cvijeća, pružajući teorijsku osnovu za poboljšanje boje tehnologije genetskog inženjeringa, promovirajući njene bogatije boje, povećavajući preglednost, proširenje obima aplikacija.

Biosintetski put odflavonoidipočinje safenilpropanoidni put. Fenilalanin se prvo pretvara u cimetnu kiselinu pod djelovanjem fenilalanin amonijaliaze (PAL), a cimetna kiselina se 4-hidroksilira cimetnom kiselinom. Enzim (cimetna kiselina-4-hidroksilaza, C4H) i 4-kumarat koenzim A ligaza (4-kumarat koenzim A ligaza, 4CL) katalizuju reakciju za stvaranje 4-kumaroil-CoA [11]. Jedan molekul 4-kumaroil-CoA i tri molekula malonil-CoA katalizira halkon sintaza (CHS) kako bi se stvorio naringenin halkon, koji imajedinjenja flavonoida.Osnovni kostur halkon izomeraze, flavanon{0}}hidroksilaze, dihidroflavonol 4-reduktaze, itd. stvara niz flavonoida kao što su izoflavoni, flavonoli, antocijani, itd. [12]. Kao ključni enzim u putu biosinteze flavonoida, CHS reguliše sadržaj flavonoida u biljkama, a također igra važnu ulogu u regulaciji boje cvjetova biljaka [13]. Na primjer, post-transkripcijsko utišavanje gena Gentiana scabra Bunge CHS može inhibirati biosintezu antocijanina i uzrokovati specifično izbjeljivanje režnjeva vjenčića [14]. Utišavanje CHS gena Actinidia eriantha Benth. CHS smanjuje sadržaj antocijana u laticama i uzrokuje da crvene latice postaju svjetlije [15]. Stoga je u ovoj studiji kloniran CtCHS gen iz cvijeća Cistanche deserticola, a na njemu su obavljena bioinformatička analiza, prokariotska ekspresija i pročišćavanje, analiza aktivnosti enzima, analiza subcelularne lokalizacije i analiza ekspresije u tri boje cvijeća kako bi se istražila funkcija CtCHS. protein i obrazac ekspresije CtCHS gena korišteni su za preliminarno istraživanje odnosa između CtCHS i boje cvijeta Cistanche deserticola, što je postavilo temelje za proučavanje regulatornog mehanizma boje cvijeta Cistanche deserticola.

1 Materijali i instrumenti

1.1 Materijali

Cvjetovi Cistanche tuberosa prikupljeni su iz okruga Yutian, prefektura Hotan, Xinjiang u svibnju 2018. Prilikom uzorkovanja slijedio je nasumični princip i odabrani su cvjetovi Cistanche tuberosa dobrog fiziološkog statusa i dosljedne visine biljke. Profesor Tu Pengfei sa Farmaceutskog fakulteta Univerziteta u Pekingu uzeo je tri soja Cistanche deserticola sa tri boje cvijeta bijele, crvene i ljubičaste i identificirane kao Cistanche tubulosa (Schenk) Wight. Brzo su zamrznuti u tečnom azotu, pohranjeni na suvom ledu i transportovani u Peking. Hemijski kompetentne ćelije E. coli DH5 kupljene su od Nanjing Novezan Biotechnology Co., Ltd., a hemijski kompetentne ćelije E. coli BL21 (DE3) kupljene su od Beijing Quanshijin Biotechnology Co., Ltd.; pET-28a, pCAMBIA1300-35S-GFP Vektor je kupljen od Wuhan Transduction Biology Laboratory Co., Ltd. Malonyl-CoA je kupljen od kompanije Sigma, 4-kumaroil-CoA, naringenin -kalkon je kupljen od Shanghai Yuanye Biotechnology Co., Ltd., a naringenin je kupljen od Shanghai McLean Biochemical Technology Co., Ltd.

1.2 Instrumenti

Nanodrop 2000C spektrofotometar (Thermo Fisher Company, SAD); gradijent PCR instrument (Eppendorf Company, Njemačka); CFX 96 fluorescentni kvantitativni PCR instrument, UVP gel imager, instrument za gel elektroforezu, instrument za elektroforezu proteina (BioRad Company, SAD) ;EnSpire

Čitač mikropločica (PerkinElmer Company, SAD); inkubator konstantne temperature (Shanghai Jinghong Experimental Equipment Co., Ltd.); DHZ-D oscilator punog kapaciteta velikog kapaciteta (Taicang Experimental Equipment Factory); THZ-82Oscilator konstantne temperature vodenog kupatila (Jiangsu Kexi Instrument Co., Ltd.); AIRTECH ultra čist radni sto (Suzhou Antai Air Technology Co., Ltd.); parni sterilizator visokog pritiska (TOMY Company, Japan); Milli Q instrument za čistu vodu (Millipore, Sjedinjene Države); LC-20Hromatograf tečne faze visoke efikasnosti (Shimadzu Company, Japan); UPLC-Q-Exactive-Orbitrap masena spektrometrija visoke rezolucije (Thermo Fisher Company, SAD); FV1200 laserski konfokalni mikroskop (Olympus Company, Japan).

2 Eksperimentalne metode

2.1 Ekstrakcija RNK i sinteza cDNK. Cvjetovi Cistanche deserticola su mljeveni u tekućem dušiku, a zatim podvrgnuti testu ekstrakcije RNK.

Ukupna RNK je ekstrahovana pomoću kompleta (Norgen, Cat 17200), koncentracija i kvalitet RNK su detektovani pomoću NanoDrop 2000C, a uzorci RNK sa odnosom A260/A280 između 1,8 i 2,1 odabrani su za sintezu cDNK reverzne transkripcije. M-MLV reverzna transkriptaza (Promega, M170B) korištena je za reverznu transkripciju kvalifikovane ukupne RNK u cDNK. Eksperimentalne operacije izvedene su prema uputama.

2.2 Kloniranje CtCHS gena

Na osnovu podataka transkriptoma cvijeta Cistanche deserticola naše istraživačke grupe [16], CtCHS sa kompletnim otvorenim okvirom čitanja je skriniran, a softver SnapGene je korišten za dizajniranje specifičnih prajmera na osnovu sekvence gena (Tabela 1). PCR amplifikacija je izvedena korištenjem cDNK cvijeta Cistanche deserticola kao šablona. Sistem amplifikacije je bio 2×Phanta Max pufer 25 μL, dNTP Mix (10 mmol/L) 1 μL, uzvodni i nizvodni prajmeri (10 μmol/L) po 2 μL, cDNK 2 μL, Phanta Max Super-Fidelity

DNK polimeraza 1 μL, ddH2O 17 μL. Reakcioni uslovi su bili: preddenaturacija na 95 stepeni tokom 3 min; 25 ciklusa denaturacije na 95 stepeni u trajanju od 15 s, žarenja na 55 stepeni u trajanju od 15 s i ekstenzije na 72 stepena u trajanju od 1 min; i produžetak reakcije na 72 stepena 5 min. PCR proizvod je detektovan elektroforezom 1% agaroznog gela, a komplet za pročišćavanje DNK (Novizan, Cat DC301-01) je korišten za oporavak gela, a zatim je obnovljena DNK pročišćena kompletom za brzo kloniranje (Novizan, Cat C601-01). Fragment DNK je ligiran sa pCE2 TA/Blunt-Zero vektorom, transformisan u Escherichia coli DH5 kompetentne ćelije, i nakon kultivisanja preko noći na 37 stepeni, odabrani su pojedinačni klonski sojevi i poslani u kompaniju na sekvencioniranje.

Tabela 1 Prajmer sekvence

2.3 Bioinformatička analiza

Koristite ProtParam online softver za analizu fizičkih i hemijskih svojstava proteina; koristite online alat Prot Scale za analizu hidrofilnosti/hidrofobnosti proteina; koristiti online alat SOPMA za predviđanje sekundarne strukture proteina; koristiti softver za online analizu SWISS-MODEL za predviđanje tercijarne strukture proteina; koristite online softver TMHMM Predvidite transmembransku strukturu proteina; koristite DNAMAN softver da uporedite homologiju CtCHS sa sekvencama aminokiselina CHS drugih vrsta; koristite MEGA-X softver za izgradnju filogenetskog stabla, koristeći spajanje susjeda (NJ) i Poissonovu korekciju. Evolucijska udaljenost se izračunava korištenjem Bootstrap metode, a broj Bootstrap ponavljanja je 1000 puta.

Za dalju detekciju je korišten UPLC-Q-Exactive-Orbitrap MS. Uslovi tečne faze su bili Waters Acquity UPLC BEH Sheild RP18 kolona (100 mm × 3.0 mm, 1,7 μm), temperatura kolone 40 stepena, naringenin , halkon i naringenin. Volumen punjenja kontrolne supstance je 4 μL, a volumen punjenja produkta enzimske reakcije je 7 μL. Kao mobilna faza koristi se voda (A)-acetonitril (B). Gradijent eluiranja je: 0 do 5 min, 30% B; 5 do 15 min. , 30%~60% B; 15~20 min, 60%~100% B; 20~25 min, 100% B; 25~31 min, 100%~30% B. Volumetrijski protok je 0,3 mL/min. Uslovi masene spektrometrije su elektrosprej jonski izvor, azot kao gas nosač, pritisak gasa u omotaču 3,5 MPa, pritisak pomoćnog gasa 1,0 MPa, pritisak raspršivanja 3500 V, temperatura kapilara 350 stepeni, temperatura zagrevanja pomoćnog gasa 200 stepeni, pozitivni i negativni jonski režimi, skeniranje opseg jona m/z je 100-1500, puna MS rezolucija je 35 000, dd-MS2 rezolucija je 17 500, (N)

CE/stepped nce postavljeno na 35, 60.

2.6 Subcelularna lokalizacija CtCHS proteina

Na osnovu CtCHS sekvence i principa bešavnog kloniranja, dizajnirani su prajmeri sa mestima za rezanje enzima Kpn Ⅰ i BamH Ⅰ, a odgovarajući ciljni fragmenti su amplificirani PCR-om. PCAMBIA1300-35S-GFP plazmid je digestiran restrikcijskim endonukleazama Kpn Ⅰ i BamH Ⅰ, a ciljni fragment i vektor su povezani preko kompleta za bešavno kloniranje (Novizan, Cat C115-01), a zatim prebačeni u E. coli DH5 kompetentne ćelije. , odabrati pojedinačne klonske sojeve za sekvenciranje i izdvojiti plazmide iz ispravnih sojeva. Plazmidi pCAMBIA1300-35S-GFP-CtCHS i pCAMBIA 1300-35S-GFP transformirani su u protoplaste Arabidopsis thaliana korištenjem PEG4000 i kultivirani pri slabom svjetlu 8 do 10 sati. Subcelularna lokalizacija CtCHS proteina uočena je pod laserskim konfokalnim mikroskopom.

2.7 Analiza uzorka ekspresije CtCHS

Na osnovu CtCHS sekvence, DNAMAN je korišten za dizajniranje kvantitativnih prajmera za fluorescenciju u realnom vremenu, sa F-boxom kao internim referentnim genom. Sekvence prajmera su prikazane u Tabeli 1. Relativna ekspresija CtCHS u cvjetovima Cistanche deserticola različitih boja detektirana je kvantitativnim PCR-om fluorescencije u realnom vremenu. Koristite TransStart Green qPCR SuperMix (puno zlato, AQ101-02) za mjerenje metodom SYBR Green fluorescentne boje, reakcijski sistem: 2×TransStart Green qPCR SuperMix 5 μL, uzvodno i nizvodno prajmera (10

μmol/L) {{0}}.2 μL svaki, cDNK šablon 0,5 μL, voda bez nukleotidaze 4,1 μL, za reakciju je korištena metoda u dva koraka, a postupak reakcije je zasnovan na metodi od Dong Xianjuan et al. [18]. Svaki uzorak je sadržavao 3 biološke replike, a eksperiment je ponovljen tri puta. Eksperimentalni podaci analizirani su pomoću programa Excel do 2

Relativna ekspresija CtCHS je izračunata korištenjem −ΔΔCt metode, a GraphPad Prism 8 je korišten za analizu značajnosti i crtanje histograma.