Clec12a ublažava upalu dok ograničava širenje kolitogenog komensala

SAŽETAK

Regulacija mikrobiote je ključna za zdravlje crijeva, ali mehanizmi koje koristi urođeni imunitet ostaju nejasni. Ovdje pokazujemo da su miševi s nedostatkom receptora lektina C-tipa, Clec12a razvili teški kolitis, koji je ovisio o mikrobioti. Studije transplantacije fekalne mikrobiote (FMT) na miševima bez klica otkrile su kolitogenu mikrobiotu formiranu unutar Clec12a-/- miševa koji su bili obilježeni ekspanzijom gram-pozitivnog organizma, glodara Faecalibaculum. Tretman sa F. rodentium bio je dovoljan da pogorša kolitis kod miševa divljeg tipa. Makrofagi unutar crijeva izražavaju najviše razine Clec12a. Analiza citokina i sekvenciranja u Clec12a-/- makrofagima otkrila je pojačanu upalu, ali značajno smanjenje gena povezanih sa fagocitozom. Zaista, Clec12a-/- makrofagi su oštećeni u svojoj sposobnosti da usvoje F. rodentium. Prečišćeni Clec12a imao je veće vezivanje za gram-pozitivne organizme kao što je F. rodentium. Stoga, naši podaci identificiraju Clec12a kao urođeni mehanizam imunološkog nadzora za kontrolu širenja potencijalno štetnih komenzala bez očigledne upale.

cistanche koristi za muškarce - jača imuni sistem

UVOD

Sastav i funkcija mikrobiote mogu imati dubok utjecaj na zdravlje i bolest sisara (Fassarella et al., 2021). Ovo je dobro dokumentirano za inflamatornu bolest crijeva (IBD), gdje je većina mišjih modela IBD-a osjetljiva na promjene u sastavu mikrobiote (Gkouskou et al., 2014.). Razumijevanje faktora koji utječu i upućuju na stabilnost mikrobiote bit će važno kako se razvijaju terapije zasnovane na mikrobioti (Sharma et al., 2020; Sorbara i Pamer, 2022). Na mikrobiotu utiču višestruki parametri uključujući ishranu, lekove i imuni sistem. Posljednjih godina pokazalo se da adaptivne imunološke komponente, posebno IgA, utječu na sastav mikrobiote (Nakajima et al., 2018; Okai et al., 2016; Yang i Palm, 2020). Međutim, manje se zna o tome kako specifični urođeni imuni receptori utiču na sastav homeostatske mikrobiote.

Genetski polimorfizmi u genima koji reguliraju mikrobiološko prepoznavanje i imunitet sluzokože su značajni aleli rizika za IBD, uključujući protein autofagije ATG16L1 (Cadwell et al., 2008; Liu et al., 2015; Rioux et al., 2007; Control, Wellcome20 Trust Case ). U nedavnoj studiji koja je istraživala promjene ekspresije mijeloidnih gena kod osoba s polimorfizmom ATG16L1T300A, identificirano je da je inhibitorni lektinski receptor C-tipa (CLR), Clec12a, značajno potisnut u ovim stanicama (Begun et al., 2015). Ova ista studija je pokazala da Clec12a djeluje u obrani od patogene infekcije kroz povezanost s autofagijskim putem. Ovi podaci sugeriraju da smanjenje regulacije Clec12a kod osoba s IBD-om može utjecati na težinu i/ili razvoj bolesti. Uprkos ovim dokazima, malo se zna o mehanizmima imunološke regulacije koje Clec12a vrši tokom kolitisa.

Lektini C-tipa su raznolika grupa topivih ili membranski vezanih molekula sposobnih da vežu lipide, proteine ​​i ugljikohidrate porijeklom iz domaćina ili mikroba (Brown et al., 2018). Mincle (Clec4e) i Dectin{6}} (Clec7a) su dva CLR-a koji utiču na specifične članove mikrobiote da održavaju crijevnu homeostazu (Iliev et al., 2012; Martinez-Lopez et al., 2019). Međutim, s više od 1,000 različitih lektina C-tipa, još mnogo toga treba otkriti unutar ove porodice proteina. Clec12a pripada porodici receptora prirodnih ubica i jedan je od samo dva lektina C-tipa koji sadrže imuno-tirozinski inhibitorni motiv (ITIM) sposoban da ograniči upalne signalne puteve (Brown et al., 2018; Marshall et al., 2004) . Clec12a prepoznaje mokraćnu kiselinu koja je signal oštećenja ćelija (Neumann et al., 2014). Clec12a je najjače eksprimiran u urođenim imunološkim stanicama, a u neutrofilima djeluje na smanjenje aktivacije i smanjenje proizvodnje upalnih citokina nakon prepoznavanja mokraćne kiseline (Neumann et al., 2014.). Suprotno tome, Clec12a potiče upalu dozvoljavajući transmigraciju mononuklearnih fagocita (MNP) kroz krvno-moždanu barijeru tokom autoimunog modela multiple skleroze i potencira signalizaciju interferona tipa I kao odgovor na virusnu infekciju (Li et al., 2019; Sagar et al. ., 2017.). Clec12a je također sposoban prepoznati plazmodijalni proizvod, hemozoin, za koji se pokazalo da povećava CD8+ T ćelije u mozgu nakon infekcije plazmodijumom (Raulf et al., 2019). Dakle, Clec12a predstavlja promiskuitetni CLR sa različitim ulogama u imunitetu i jedinstvenim signalnim sposobnostima, ali njegova uloga u crijevima ostaje nepoznata.

cistanche tubulosa-poboljšava imuni sistem

Ranije smo pokazali da specifične crijevne gljivice pogoršavaju kolitis indukcijom metabolita purina, mokraćne kiseline (Chiaro et al., 2017). Štoviše, metabolizam purina je nedavno bio povezan s ljudskim crijevnim bolestima (Zhu et al., 2019). Ovi podaci zajedno sugeriraju da bi otkrivanje mokraćne kiseline moglo biti relevantno za IBD. Na osnovu toga, krenuli smo u istraživanje funkcije Clec12a u crijevima. Otkrili smo da su životinje s nedostatkom Clec12a vrlo osjetljive na kolitis koji ovisi o sastavu mikrobiote koji se formira u odsustvu Clec12a. FMT mikrobiote Clec12a-/- u WT životinja bez klica bio je dovoljan da pogorša kolitis i formiranje kolitogene mikrobiote kod Clec12a-/- životinja je neovisno o adaptivnom imunitetu. Da bi se identificirali relevantni mikrobi koji bi mogli pogoršati kolitis, Clec12a-/- životinje su tretirane raznim antibioticima, a oni koji su ciljali na gram-pozitivne bakterije su ublažili bolest. Sekvenciranjem 16S rDNA utvrđeno je da je Faecalibaculum rodentium značajno zastupljeniji kod Clec12a-/- životinja, a oralna gavaža F. rodentium je bila dovoljna da pogorša patologiju bolesti kod WT životinja. Imunsko profiliranje Clec12a-/- životinja otkrilo je značajno smanjenje homeostatskih mijeloidnih stanica u debelom crijevu. RNK sekvenciranje makrofaga tretiranih F. rodentium otkrilo je da Clec12a potiče fagocitozu. Kako se pokazalo da Clec12a veže više liganda, pitali smo da li bi se Clec12a vezao za različite članove mikrobiote. Koristeći Clec12a-Fc fuzioni protein identificiramo da se Clec12a najjače vezuje za gram-pozitivne članove mikrobiote. Zbirno ovi podaci sugeriraju model u kojem Clec12a kontrolira kolitogene članove mikrobiote putem direktnog vezivanja i fagocitoze, dok istovremeno sprječava upalne odgovore. U scenarijima u kojima je ekspresija Clec12a smanjena, gram-pozitivni patobioti se mogu proširiti i promovirati upalu. Stoga, naše studije identificiraju Clec12a kao važan supresor upale koji osigurava homeostazu i održavanje zdrave mikrobiote.

REZULTATI

Clec12a-/- životinje su vrlo osjetljive na kolitis neovisno o adaptivnom imunološkom sistemu

Smanjena ekspresija Clec12a je prijavljena kod osoba sa IBD i pokazali smo da blokiranje proizvodnje jednog od liganada za Clec12a, mokraćne kiseline, može poboljšati kolitis (Begun i sur., 2015; Chiaro et al., 2017; Liu et al. ., 2015.). Međutim, Clec12a još nije proučavan na životinjskim modelima kolitisa. U tu svrhu, WT i Clec12a-/- C57BL/6 miševi su bili izazvani akutnim DSS kolitisom. Clec12a-/- životinje su izgubile značajno više na težini, pokazale su kraće debelo crijevo i imale značajno povećanje inflamatornog markera LCN2 u izmetu u poređenju sa WT životinjama, što ukazuje na pogoršanu upalu i bolest (Slika 1A-C). U prilog tome, histološka analiza je otkrila povećano oštećenje epitela, gubitak kripta i priliv imunih ćelija kod Clec12a-/- životinja u poređenju sa WT (Slika 1D, E). U skladu sa rezultatima u DSS modelu kolitisa, transfer CD4+ CD45RBhi ćelija u TCRb-/-; Dvostruki nokaut miševi Clec12a-/- doveli su do manjeg povećanja telesne težine tokom vremena i kraćeg debelog creva u poređenju sa T ćelijama prebačenim u TCRb-/- miševe (Slika 1F, G). Zajedno, ovi rezultati pokazuju da gubitak Clec12a dovodi do pogoršanja crijevne bolesti.

Izvještava se da se Clec12a uglavnom eksprimira unutar urođenih imunih ćelija sa vrlo niskom ekspresijom u CD8+ T ćelijama. Stoga, da bi se utvrdilo da li je adaptivni imunitet uključen u pogoršanu bolest uočenu kod Clec12a-/- životinja, Clec12a-/- životinje su ukrštene sa Rag-/- životinjama kako bi se uklonile i T i B ćelije. Opet, Clec12a-/- životinje su razvile pogoršanu bolest u poređenju sa WT životinjama jer su izgubile više na težini i imale kraće debelo crijevo od WT kontrola (Slika 1H, I). Slično, Clec12a-/-; Rag-/- je razvio pogoršanu crijevnu bolest u poređenju sa Rag-/- kontrolnom skupinom i izgubio je isto toliko težine i imao kraća debelog crijeva od WT i Rag-/- kao Clec12a-/- (Slika 1H, I). Ranije smo izvijestili da oralno liječenje S. cerevisiae povećava nivoe mokraćne kiseline i pogoršava kolitis. Međutim, nisu primijećene razlike u nivoima mokraćne kiseline u serumu ili fecesu u WT u odnosu na Clec12a-/- životinje, što sugerira da pojačana bolest uočena kod Clec12A-/- nije rezultat povećane mokraćne kiseline (slika S1). Dakle, pogoršani razvoj kolitisa uočen kod Clec12a-/- životinja je nezavisan od adaptivnog imunog sistema.

cistanche tubulosa-poboljšava imuni sistem

Kliknite ovdje za pregled proizvoda Cistanche Enhance Immunity

【Zatražite više】 Email:cindy.xue@wecistanche.com / Whats App: 0086 18599088692 / Wechat: 18599088692

Pogoršanje kolitisa kod Clec12a-/- životinja zavisi od mikrobiote

Poznato je da je kolitis dijelom uzrokovan promjenama u sastavu mikrobiote (Kubinak et al., 2015; Ray i Dittel, 2015). Da bi se utvrdilo da li životinje Clec12a-/- imaju mikrobiotu koja potiče pogoršanje kolitisa, FMT su izvedeni od WT ili Clec12a-/- miševa na WT životinjama bez klica. Četiri sedmice nakon transplantacije, polovina životinja bila je smještena zajedno, dok je druga polovina ostala smještena odvojeno. Akutni DSS kolitis je zatim izazvan u svakoj grupi (slika 2A). Životinje koje su primile Clec12a-/- FMT i životinje u zajedničkom smještaju izgubile su znatno više težine (slika 2B) i imale su značajno kraće debelo crijevo (slika 2C) od životinja koje su primile FMT od WT miševa. Nadalje, histološka analiza je otkrila veće oštećenje epitela i upalni priliv nakon transplantacije sa Clec12a-/- mikrobiotom (Slika 2D, E). Uspostavljene mikrobne zajednice bile su različite među grupama kako je utvrđeno sekvenciranjem gena 16S rRNA koristeći Bray-Curtis (PERMANOVA, p=0.0001), neponderisane (PERMANOVA, p=0.0062) i ponderisane Unifrac udaljenosti (PERMANOVA, p=0.0001). Različitost mikrobiote unutar grupe bila je najveća kod životinja smještenih u zajedničkom smještaju prema istim metrikama koje ukazuju na stjecanje mikroba iz svakog FMT genotipa (Slika 2 FH). Ovi podaci ukazuju da je pogoršani kolitis kod Clec12a-/- životinja potaknut specifičnim mikrobima obogaćenim odsustvom Clec12a; i ovi mikrobi su postali dominantni pokretači kolitogenog fenotipa, čak i u prisustvu utvrđene WT mikrobiote.

Sastav mikrobiote formiran u Clec12a-/- životinjama je nezavisan od adaptivnog imuniteta

Imuni sistem je važan za diktiranje sastava mikrobiote. FMT eksperiment je pokazao da Clec12a-/- dovodi do promjene u sastavu mikrobiote koja potiče pogoršani razvoj kolitisa. Prvo smo željeli utvrditi da li je nedostatak Clec12a-/- unutar imunološkog odjeljka sposoban da preoblikuje crijevnu mikrobiotu. U tu svrhu, koštana srž WT ili Clec12a-/- miševa je prebačena u smrtonosno ozračene WT SPF miševe kako bi se standardizirala mikrobiota nakon čega je uslijedio 8-sedmični period imunološke rekonstitucije (Slika 3A). Za to vrijeme transplantirani imuni sistem ima vremena da se razvije unutar primaoca, različito oblikujući sastav mikrobiote. Da bismo utvrdili da li su prokolitogene promjene u mikrobioti rezultat ovog imunološkog oblikovanja, izveli smo FMT koristeći izmet bilo WT ili Clec12a-/- himernih miševa i inducirali DSS kolitis (Slika 3A). Iako nije bilo značajnih promjena u gubitku težine (Slika 3B), debelo crijevo životinja koje su primale FMT od Clec12a-/- himernih miševa bilo je značajno kraće u poređenju sa životinjama koje su primale FMT od WT miševa (Slika 3C), što ukazuje na pogoršanje bolesti. Štaviše, kada su primaoci WT i Clec12a-/- FMT bili zajedno smješteni, debelo crijevo je bilo značajno kraće u poređenju sa životinjama koje su primale WT FMT (Slika 3C). Dakle, nedostatak Clec12a-/- u hematopoetskom kompartmentu dovodi do stvaranja dominantne kolitogene mikrobiote.

Da bismo dodatno potvrdili da je adaptivni imuni sistem neophodan za formiranje kolitogene mikrobiote kod Clec12a-/- životinja, izvršili smo FMT koristeći izmet iz Rag-/- ili Rag- /-; Clec12a-/- - kao što je prethodno opisano. Životinje koje su dobile krpu-/-; Clec12a-/- FMT je izgubio više na težini i imao značajno kraće debelo crijevo od životinja koje su primile FMT od Rag-/- životinja, štoviše, životinje koje su zajedno smještene su također razvile pogoršanu bolest (Slika 3D, E). Ovi podaci pokazuju da je nedostatak Clec12a unutar urođenog imunološkog sistema dovoljan da dovede do stvaranja mikrobiote sposobne da pogorša kolitis.

Clec12a potiskuje ekspanziju Faecalibaculum rodentium

Koristili smo niz različitih antibiotika da identifikujemo relevantne organizme koji pokreću bolesti kod Clec12a-/- životinja. Prvo, tretman snažnim koktelom antibiotika širokog spektra koji uključuje eritromicin, ampicilin, neomicin i gentamicin, značajno je smanjio ozbiljnost bolesti i kod Clec12a-/- i kod WT životinja, sugerirajući da je bakterijska populacija mikrobiote relevantna za bolest ( Slika 4A; Slika S2). Zatim smo dodatno suzili koje su bakterijske populacije najrelevantnije za bolest korištenjem različitih antibiotika koji ciljaju jedinstvene bakterijske taksone. Konkretno, odabrali smo gentamicin, aminoglikozid koji cilja na gram-negativne bakterije, i cefalotin, cefalosporin koji prvenstveno cilja na gram-pozitivne bakterije. Ovi lijekovi su davani Clec12a-/- životinjama tokom DSS kolitisa. Dok liječenje gentamicinom nije napravilo razliku u težini bolesti, životinje koje su primale cefalotin zadržale su svoju težinu i imale znatno duže debelo crijevo od lažno tretiranih životinja (slika 4B, C), što ukazuje da se gram-pozitivni organizmi koji žive u Clec12a-/- mikrobioti igraju važnu ulogu u pogoršanju patologije bolesti.

Zatim smo izvršili sekvenciranje gena 16S rRNA SPF WT i Clec12a-/- fecesa kako bismo profilirali kompozicione promjene u mikrobioti. Životinje WT i Clec12a-/- grupisane su značajno drugačije prema nefilogenetskim i filogenetskim metrikama ponderisanom obiljem, Bray-Curtis i ponderisanim UniFrac, respektivno (Slika S3A-C). metrika alfa raznolikosti nije otkrila značajne razlike u bogatstvu (uočene karakteristike), što ukazuje da Clec12a-/- nije sadržavao više vrsta (slika 4D). Međutim, indeksi ujednačenosti i Shannon raznolikosti su povećani u odsustvu Clec12a, što ukazuje da je proporcionalna distribucija bakterija u Clec12a-/- miševima promijenjena (Slika 4E, F) i dalje podržavajući da je Clec12a važan za regulaciju strukture mikrobiote unutar crijeva.

Analiza sastava mikrobioma (ANCOM) otkrila je da je među ASV (varijantama sekvence amplikona) različito bogatim, ASV klasifikovan u rod Faecalibaculum (familija Erysipelotrichaceae), značajno proširen unutar Clec12a-/- fecesa u poređenju sa WT (Slika 4G, H). BLAST koristeći ASV reprezentativnu sekvencu iz naše analize ukazalo je na 100% identičnost sekvencama iz bakterije Faecalibaculum rodentium. Ovi podaci pružaju dokaz da su gram-pozitivne bakterije u Clec12a-/- životinji odgovorne za kolitogeni fenotip, a posebno impliciraju gram-pozitivan organizam, F. rodentium, u pogoršanu bolest.

Na osnovu toga, testirali smo hipotezu da F. rodentium može pogoršati kolitis. Prethodno smo tretirali WT SPF životinje sa 1 x 108 CFU bilo živog ili fiksnog F. rodentium oralnom gavažom i nastavili tretman svaki dan tokom akutnog modela DSS kako bismo osigurali visok nivo kolonizacije F. rodentium. Životinje koje su primale i živu i fiksnu F. rodentium izgubile su više na težini i imale su značajno kraće debelo crijevo od životinja koje su tretirane nosačem (Slika 4I, J), što ukazuje da povećani nivoi F. rodentium mogu pogoršati bolest.

Clec12a ograničava upalni odgovor makrofaga dok povećava fagocitozu

Da bismo definirali ćelijsku ekspresiju Clec12a u odsustvu bolesti, profilirali smo urođene i adaptivne imunološke stanice u lamina propria (LP) koristeći višebojnu protočnu citometriju. U skladu s prethodnim izvještajima, Clec12a je pretežno ograničen na mijeloičnu lozu sa malo ili nimalo ekspresije na limfocitima (Slika 5A) (Han et al., 2004; Pyz et al., 2008; Sobanov et al., 2001). Intestinalni neutrofili, makrofagi i dendritične ćelije su pokazale slične nivoe ekspresije Clec12a (slika S4A), dok su makrofagi imali najveći procenat ćelija unutar tkiva creva koje eksprimiraju Clec12a (slika 5A). S obzirom na dvostruku ulogu makrofaga u promicanju upale putem klasične aktivacije, ali i da iniciraju reparativne mehanizme kao odgovor na oštećenje tkiva, pitali smo kako Clec12a može utjecati na ovu dihotomiju tijekom kolitisa. Iako su makrofagi prilično raznoliki, mogu se široko podijeliti na M1 inflamatorne i M2 reparativne makrofage prema ekspresiji CD38 i EGR2 respektivno. Pokazali smo da životinje Clec12a-/- imaju povećane M1 makrofage i smanjene M2 makrofage u LP debelog crijeva tokom kolitisa (Slika 5 B, C, Slika S4B). Ovi podaci ukazuju da Clec12a reguliše odgovore makrofaga u crijevima.

Da bi se bolje razumjelo kako Clec12a utječe na biologiju makrofaga kao odgovor na mikrobne ligande, makrofagi izvedeni iz koštane srži (BMDM) izolirani iz WT ili Clec12a-/- životinja tretirani su raznim uobičajenim mikrobnim ligandima uključujući LPS, Pam3CysK i Flagellin. Na svim ovim uzorcima urađena je analiza citokina. Mnogi od testiranih citokina nisu inducirani pod ovim uslovima, međutim, MCP-1, IL-27, IFN-b, TNF-a i IL-6 su konzistentno otkriveni u ovim kulturama ( Slika 5D). Clec12a-/- BMDM-ovi su imali značajno veću ekspresiju ovih citokina kao odgovor na mnoge mikrobne ligande, a najveći diferencijalni odgovori su uočeni kao odgovor na TLR2 agonist Pam3CysK. Ovi podaci su u skladu sa poznatom ulogom Clec12a u ublažavanju upalnih odgovora tokom sterilne upale (Neumann et al., 2014).

cistanche biljka koja povećava imuni sistem

RNA-seq je izveden na BMDM-ovima iz WT ili Clec12a-/- tretiranim F. rodentium da bi se utvrdilo kako Clec12a reguliše odgovore ovih ćelija na ovaj specifični bakterijski organizam. Procijenili smo diferencijalni odgovor upoređujući Clec12a-/- BMDM-ove izložene F. rodentiumu u odnosu na kontrolu vozila sa odgovorom WT BMDM-a. Analiza obogaćivanja različito eksprimiranih gena pokazala je da makrofagi s nedostatkom Clec12a imaju značajno povećanje gena uključenih u kontrolu ćelijskog ciklusa kada su izazvani sa F. rodentium (Slika S5A). Ćelijski ciklus je suštinski povezan sa fagocitozom, a takođe je došlo do značajnog smanjenja gena povezanih sa fagocitozom i upalnim odgovorom (Slika 5E) (Luo et al., 2005). U skladu sa nedavnom studijom o Clec12a i salmoneli, ovi podaci sugeriraju da je fagocitoza defektna u odsustvu Clec12a kao odgovor na F. rodentium koji živi u normalnom crijevu (Begun et al., 2015). Da bi se ovo testiralo, peritonealni makrofagi su sakupljeni od WT i Clec12a-/- životinja i zajedno kultivisani sa Sybr®-green označenim F. rodentium. Clec12a-/- makrofagi su imali značajno manje mikroba po ćeliji (Slika 5F, G; Slika S5B), što ukazuje da nedostatak Clec12a dovodi do unosa manjeg broja organizama i u skladu je sa smanjenom fagocitozom u RNA-seq skupu podataka. Zajedno, ovi podaci pokazuju da Clec12a igra dvostruku ulogu ublažavanja otvorenih inflamatornih odgovora na uobičajene mikrobne ligande, istovremeno promovirajući unos makrofaga bakterijama.

Clec12a se prvenstveno vezuje za gram-pozitivne komensale

Kako je fagocitoza pokrenuta vezivanjem mikroba nakon čega slijedi internalizacija i ubijanje, pretpostavili smo da se Clec12a mogao vezati za specifične članove mikrobiote, kao što je F. rodentium. Da bi se odgovorilo na ovu mogućnost, stvoren je fuzioni protein koji sadrži ekstracelularnu vezujuću domenu mišjeg Clec12a i Fc dio humanog IgG1 (Clec12a-Fc) (Slika 6A) (Maglinao et al., 2014; Neumann et al., 2014; Raulf et al., 2019.). Protein je pročišćen i testiran na vezivanje za panel različitih gram-pozitivnih i gram-negativnih bakterija za koje se zna da su prisutne u homeostatskom crijevu, uključujući F. rodentium, Roseburia spp., Bifidobacteria animalis, Akkermansia muciniphila, Bacteriodes uniformis, i gljivična komenzalna Candida albicans, protočnom citometrijom. Salmonella enterica je također uključena jer su prethodne studije pokazale da se Clec12a može povezati s ulaskom S. enterica u ćeliju (Begun et al., 2015). Clec12a se u različitom stepenu vezuje za nekoliko filogenetski različitih bakterija, uključujući F. rodentium, ali ne i gljive, C. albicans (Slika 6B). Clec12a se najviše vezao za gram-pozitivne organizme F. rodentium i člana porodice Lachnospiraceae Roseburia sp., a najmanje je stupio u interakciju s B. animalis, B. uniformis i S. enterica (Slika 6B), što ukazuje na Clec12a može vežu se za određene članove mikrobiote sa sklonošću prema gram-pozitivnim organizmima. Uzeti zajedno, naši podaci identifikuju Clec12a kao mehanizam koji koristi imuni sistem za ispitivanje mikrobne zajednice crijeva i orezivanje mikrobiote putem direktnog vezivanja i fagocitoze, dok istovremeno sprječavaju otvorene upalne odgovore na obilne gram-pozitivne mikrobe koji su kritični za održavanje zdravlja crijeva.

DISKUSIJA

Homeostaza unutar crijeva zahtijeva mehanizme za ograničavanje komenzalnih mikroba bez iniciranja štetne upale (Macpherson et al., 2000). IgA se posljednjih godina pojavio kao jedan od kritičnih načina na koji imunitet crijeva može vršiti kontrolu nad mikrobiotom (Pabst i Slack, 2020). Zaista, IgA se može direktno vezati za mikrobe i/ili njihove proizvode i eliminirati ih iz crijeva bez indukcije prototipične upale. Drugi imunološki molekuli koji posjeduju ova dvojna svojstva do danas nisu proučavani. Lektini C-tipa obuhvataju raznoliku klasu proteina koji mogu prepoznati različite molekule proteina, ugljikohidrata i lipida iz mikrobnih i domaćinskih proizvoda (Brown et al., 2018; Drouin et al., 2020). Međutim, malo ih je proučavano u kontekstu imuniteta crijeva i mikrobiote (Iliev et al., 2012; Martinez-Lopez et al., 2019). Prema tome, prema našim saznanjima, ovo je prva demonstracija da nedostatak Clec12a mijenja sastav mikrobiote koji uzrokuje ozbiljnost bolesti.

cistanche koristi - jača imuni sistem

Clec12a je uglavnom proučavan u kontekstu prepoznavanja mononatrijum urata (MSU) ili mokraćne kiseline, što je često indikacija ćelijske smrti (Kono et al., 2010; Neumann et al., 2014). Mokraćna kiselina je sposobna aktivirati inflamatorne odgovore preko inflamasoma NLRP3, tako da, kako bi se spriječilo uništavanje tkiva tokom ćelijske smrti, ova upala se mora kontrolisati (Martinon et al., 2006). Pokazalo se da Clec12a uravnotežuje ovaj inflamatorni odgovor kroz smanjenje Syk signalizacije (Marshall et al., 2004). U skladu s tim, delecija Clec12a u modelu sterilne upale i autoinflamatornom modelu artritisa uzrokuje pojačanu aktivaciju neutrofila i pogoršanje bolesti, što Clec12a čini važnom inflamatornom kočnicom (Redelinghuys et al., 2016.). Međutim, nedavno je dokazano da Clec12a pojačava signalizaciju interferona tipa I kao odgovor na virusnu infekciju i posreduje u preuzimanju salmonele putem antibakterijske autofagije (Begun et al., 2015; Li et al., 2019). Ovo pokazuje da Clec12a ne funkcionira samo da ograničava upalu, već može igrati različite uloge ovisno o kontekstu. Crijeva se razlikuje po tome što postoji veliki broj imunih stanica čak i u odsustvu bolesti. To je zbog prisustva mikrobiote, koja igra važnu ulogu u pokretanju imunološkog razvoja i sprječavanju kolonizacije patogenih organizama. Mikrobiota posjeduje iste površinske obrasce koje detektiraju TLR-i koji također prepoznaju patogene, pa stoga crijevni imunološki sistem mora imati stroge regulatorne mehanizme da obuzda upalu ovim stranim organizmima (Blander et al., 2017).

Prvobitno smo se zainteresirali za Clec12a jer smo identificirali da crijevne gljivice, Saccharomyces cerevisiae, izazivaju mokraćnu kiselinu da pogorša kolitis (Chiaro et al., 2017). Štoviše, druge studije su otkrile da mikrobiota može utjecati na crijevnu bolest kroz indukciju metabolizma purina, čiji je krajnji proizvod kod sisara mokraćna kiselina (Zhu et al., 2019). Ovi podaci sugeriraju da mehanizmi za otkrivanje mokraćne kiseline, kao što je Clec12a, mogu utjecati na crijevnu homeostazu. Međutim, nismo primijetili promjene u razinama mokraćne kiseline u serumu ili fecesu, što ukazuje da povećana ozbiljnost bolesti kod Clec12a-/- životinje nije uzrokovana povećanjem mokraćne kiseline. Međutim, povećana težina kolitisa kod Clec12a-/- je uzrokovana sastavom mikrobiote. Stoga, na osnovu naših podataka, smanjena ekspresija Clec12a-/- može uticati na sastav mikrobiote kod pacijenata sa IBD (Jason L. Kubinak, 2015; Rehman et al., 2011; Vijay Kumar et al., 2010). Zanimljivo je da smo otkrili da antibiotici koji ciljaju na gram-pozitivne organizme mogu ublažiti težinu kolitisa kod Clec12a-/- životinja. Ovo je u suprotnosti s nekoliko izvještaja koji su identificirali proširene gram-negativne Enterobacteriaceae tokom intestinalne upale, tako da je ovo jedna od rijetkih studija koja je identificirala ekspanziju gram-pozitivnih organizama koji su povezani s razvojem kolitisa. Iako, vjerovatno, nije jedini organizam koji utiče na težinu kolitisa u ovom modelu, dramatična ekspanzija F. rodentium je uočena kod Clec12a-/- životinja. F. rodentium je gram-pozitivan, oksidaza i katalaza negativan član Firmicutes (Bacillota) phyla (Chang et al., 2015). Svakodnevno uvođenje F. rodentium čak i kod WT miševa pojačava kolitis, podržavajući da su povećani nivoi F. rodentium u crijevima štetni i vjerovatno izazivaju ozbiljnost kolitisa u Clec12a-/-. Nedavni izvještaj je pokazao da F. rodentium može povećati promet epitela i potisnuti ekspresiju enzima unutar epitela koji smanjuju upalne odgovore i stoga je u skladu s pogoršanom bolešću koju vidimo kada se F. rodentium proširi u crijevima (Cao et al., 2022). Kako su ljudi kolonizirani organizmom sličnim F. rodentium (Zagato et al., 2020), daljnje studije trebale bi razjasniti utjecaj ovih bakterija sličnih F. rodentium na aspekte ljudske fiziologije povezane s kolitisom.

Podržavajući ulogu Clec12a među urođenim imunološkim stanicama, primijetili smo da se kolitogena mikrobiota još uvijek formira u Clec12a-/- životinjama kojima nedostaje adaptivni imuni sistem. Najveći postotak stanica u crijevima koje eksprimiraju Clec12a bili su makrofagi što nas je navelo da se fokusiramo na funkciju Clec12a u ovim stanicama. Prethodne studije su pokazale da je Clec12a važan medijator proizvodnje interferona tipa I kao odgovor na virusnu infekciju (Li et al., 2019). Međutim, nije procijenjeno kako Clec12a utječe na odgovore na široki spektar bakterijskih liganada; ovo je vrlo relevantno u crijevima gdje postoji obilje TLR liganada. Ovdje pokazujemo da Clec12a služi za ublažavanje reakcija makrofaga u crijevima i vjerovatno funkcionira da osigura homeostazu kao odgovor na mikrobiotu. RNA-sekvencija makrofaga inkubiranih sa F. rodentium naglašava da nedostatak Clec12a dovodi do defekta ćelijskog ciklusa i fagocitoze kao odgovora na ove komenzalne bakterije. Nedavna studija je pokazala da su Clec12a-/- makrofagi smanjili autofagiju kao odgovor na salmonelu (Begun et al., 2015). Naši podaci dopunjuju i proširuju ove nalaze uključivanjem da Clec12a također funkcionira za kontrolu neinvazivnih komenzalnih organizama. Drugi su pokazali da F. rodentium utiče na biologiju epitela, što sugeriše da se F. rodentium nalazi u neposrednoj blizini domaćina i stoga mora biti strogo kontrolisan od strane imunološkog sistema. Naši podaci potvrđuju da Clec12a kontroliše F. rodentium kroz regulaciju fagocitoze. Fagocitoza se pokreće fizičkim vezanjem liganda ili mikroba, a lektini C-tipa mogu se povezati s više liganda, što nas je navelo da testiramo može li se Clec12a direktno povezati s bakterijama koje žive u crijevima. Zanimljivo je da se Clec12a najviše vezao za gram-pozitivne organizme F. rodentium i Roseburia, a mnogo manje za gram-negativne organizme A. muciniphila i B. uniformis, a nikako za C. albicans. Ovi podaci pokazuju da Clec12a ima sklonost vezivanju određenih članova mikrobiote. Ovo nam omogućava da izgradimo model prema kojem angažman Clec12a i kasnija fagocitoza mogu kontrolirati određene članove mikrobiote i spriječiti potencijalno štetne efekte njihovog širenja. Ovo naglašava dvostruku funkciju Clec12a koja može obuzdati upalu protiv mikrobnih liganada, a istovremeno prepoznaje i kontrolira specifične članove mikrobiote. Stoga, Clec12a predstavlja jedinstven način na koji urođeni imuni sistem koristi da osigura homeostazu unutar gastrointestinalnog trakta.

FIGURE LEGENDS

Slika 1. Clec12a obuzdava crevne bolesti nezavisno od adaptivnog imunog sistema

(A) Da bi se procijenila težina kolitisa, miševi bez specifičnih patogena (SPF) WT ili Clec12a-/- C57BL/6 tretirani su 2,5% dekstran natrijum sulfata (DSS) ad libitum tokom 7 dana u vodi za piće. Procenat gubitka težine je procenjivan dnevno. Srednja vrijednost +/- SEM, podaci su prikupljeni iz tri nezavisna eksperimenta koristeći dvosmjernu ANOVA-u i Śídákov test višestrukog poređenja.

(B) Dužina debelog crijeva (cm) navedenih životinja mjerena je prilikom žrtvovanja. Dijagram raspršenja je srednja vrijednost +/- SEM, podaci su prikupljeni iz tri nezavisna eksperimenta korištenjem neuparenog t-testa. Svaka tačka predstavlja jednog miša

(C) Fekalni lipokalin-2 (ng/mL) naznačenih životinja mjeren je kao očitavanje upale. Stupasti grafikon je srednja vrijednost +/- SEM, podaci su prikupljeni iz dva nezavisna eksperimenta koristeći neupareni t-test. Svaka tačka predstavlja jednog miša

(D) Reprezentativni H&E obojeni dijelovi debelog crijeva od indiciranih životinja nakon DSS-induciranog kolitisa.

(E) Histološki rezultati za indicirane životinje generirani su iz dijelova debelog crijeva u

(D). Stupasti grafikon je srednja vrijednost +/- SEM, upoređena korištenjem neuparenog t-testa. Svaka tačka predstavlja jednog miša.

(F) Model prijenosa T stanica kolitisa urađen je za procjenu kroničnog kolitisa. Težina TCRb-/- i Clec12a-/- ;TCRb-/- životinja je mjerena sedmično. Grafikon prikazuje postotak gubitka težine indiciranih životinja tokom eksperimenta. Srednja vrijednost +/- SEM, u poređenju sa 2-način ANOVA.

(G) Dužina kolonije naznačenih životinja iz (I) mjerena je prilikom žrtvovanja. Stupasti grafikon je srednja vrijednost +/- SEM, upoređena korištenjem neuparenog t-testa. Svaka tačka predstavlja jednog miša.

(H) WT, Clec12a-/- , Rag-/- ili Rag-/- ;Clec12a-/- C57BL/6 SPF miševi su procijenjeni na akutni kolitis. Indiciranim životinjama je davan 2,5% DSS ad libitum tokom 7 dana. Procenat gubitka težine je procenjivan dnevno. Srednja vrijednost +/- SEM, podaci su reprezentativni za dva nezavisna eksperimenta. Dvosmjerna ANOVA i Śídákov test višestrukog poređenja.

(I) Dužina debelog crijeva (cm) naznačenih životinja mjerena je prilikom žrtvovanja. Stupasti grafikon je srednja vrijednost +/- SEM, podaci su reprezentativni za dva nezavisna eksperimenta koji koriste neuparene t-testove. Svaka tačka predstavlja jednog miša * p < 0.05; ** p < 0.01; *** p < 0,001; **** p < 0,0001

Slika 2. Mikrobiota formirana u Clec12a-/- životinja dovodi do pogoršanja kolitisa

A) Transplantacije fekalne mikrobiote (FMT) izvedene su prijenosom fekalnih supernatanata sa WT ili Clec12a životinja u WT miševe bez klica. Mikrobioti je ostavljeno da se homogenizira četiri sedmice, nakon čega su polovina WTFMT miševa i polovina Clec12a-/-FMT miševa zajedno smješteni i ostavljene su još četiri sedmice da se miješaju. Sve grupe su tada dobile 2,5% DSS ad libitum u svojoj vodi za piće i žrtvovane su 7. dana.

B) Procenat gubitka težine indiciranih životinja ocjenjivan je dnevno. Grafikon prikazuje srednju vrijednost +/- SEM, podaci su prikupljeni iz dva nezavisna eksperimenta koristeći dvosmjernu ANOVA-u i Śídákov test višestrukog poređenja.

C) Dužina debelog crijeva (cm) od navedenih životinja je mjerena prilikom žrtvovanja. Dijagram raspršenja je srednja vrijednost +/- SEM, upoređena korištenjem Ordinary One-Way ANOVA sa Dunnettovim testom višestrukih poređenja. Svaka tačka predstavlja jednog miša.

D) Reprezentativni H&E obojeni dijelovi debelog crijeva indiciranih životinja nakon kolitisa izazvanog FMT i DSS.

E) Histološki rezultati su generisani iz preseka debelog creva u (D). Stupasti grafikon je srednja vrijednost +/- SEM, upoređena korištenjem neuparenog t-testa. Svaka tačka predstavlja jednog miša.

F) Ponderirane Unifrac udaljenosti od sekvenciranja gena 16S rRNA WTFMT, Clec12a-/- FMT ili životinja koje su smještene zajedno. Dijagrami kutija i brkova koji prikazuju sve tačke (poređenje udaljenosti u parovima) i upoređuju pomoću Kruskal-Wallis testa.

G) Neponderisane udaljenosti Unifrac-a od sekvenciranja gena 16S rRNA WTFMT, Clec12a-/- FMT ili životinja koje se nalaze zajedno. Dijagrami kutija i brkova koji prikazuju sve tačke (poređenje udaljenosti u parovima) i upoređuju pomoću Kruskal-Wallis testa.

H) Bray-Curtisove udaljenosti od sekvenciranja gena 16S rRNA WTFMT, Clec12a-/- FMT ili životinja koje su smještene zajedno. Dijagrami kutija i brkova koji prikazuju sve tačke (poređenje udaljenosti u parovima) i upoređuju pomoću Kruskal-Wallis testa.

Slika 3: Sastav mikrobiote formiran u Clec12a-/- životinjama je nezavisan od adaptivnog imuniteta

A) Šematski dijagram koji prikazuje rekonstituciju koštane srži sa naknadnim FMT. C57Bl/6 WT miševi su smrtonosno ozračeni i rekonstituisani ili sa WT ili Clec12a-/- koštanom srži. Nakon 8 sedmica, izmet je uzet od ovih miševa i prebačen u WT miševe bez klica kao što je objašnjeno u (A). Prvobitno rekonstituisanim himernim životinjama je tada dato 2,5% DSS ad libitum u vodi za piće.

B) Procenat gubitka težine FMT miševa iz (F) procenjivan je dnevno. Srednja vrijednost +/- SEM, koristeći dvosmjernu ANOVA-u i Tukey test višestrukog poređenja.

C) Dužina debelog crijeva (cm) od navedenih životinja je mjerena prilikom žrtvovanja. Dijagram raspršenja je srednja vrijednost +/- SEM, neupareni t-test. Svaka tačka predstavlja jednog miša

D) FMT-ovi za procjenu uloge adaptivnog imunološkog sistema na mikrobiološko oblikovanje i težinu kolitisa izvedeni su prijenosom fekalnih supernatanata iz Rag-/- ili Rag-/-; Clec12a-/- SPF životinje u WT miševe bez klica kao što je opisano u (A). Miševi su tretirani sa 2,5% DSS tokom 7 dana. Procenat gubitka težine je procenjivan dnevno. Grafikon je srednja vrijednost +/- SEM, koristeći dvosmjernu ANOVA-u i Tukey test višestrukog poređenja.

E) Dužina debelog crijeva (cm) od navedenih životinja u (F) mjerena je prilikom žrtvovanja. Srednja vrijednost +/-, SEM upoređena korištenjem Obične jednosmjerne ANOVA i Dunnetovog testa višestrukog poređenja. Svaka tačka predstavlja jednog miša. * p < 0.05; ** p < 0.01; *** p < 0,001; **** p < 0,0001

Slika 4. Clec12a ograničava širenje glodara Faecalibaculum, mikroba koji pogoršava kolitis

A) WT ili Clec12a-/- C57BL/6 SPF miševima je dat koktel antibiotika (A) (neomicin, gentamicin, ampicilin, eritromicin), cefalotin ili gentamicin (B, C) u koncentraciji od 0. 5g/L tokom četrnaest dana. Nakon sedam dana životinjama je dato 2,5% DSS u vodi za piće do žrtvovanja. Dužina debelog crijeva (cm) od navedenih životinja mjerena je prilikom žrtvovanja. Dijagram raspršenja je srednja vrijednost +/- SEM, neupareni t-test. Svaka tačka predstavlja jednog miša.

B) Procenat gubitka težine indiciranih životinja ocjenjivan je dnevno. Grafikon je srednja vrijednost +/- SEM, koristeći dvosmjernu ANOVA-u i Tukey test višestrukog poređenja

C) Dužina debelog crijeva (cm) naznačenih životinja mjerena pri žrtvovanju. Dijagram raspršenja je srednja vrijednost +/- SEM, neupareni t-test. Svaka tačka predstavlja jednog miša.

D) Uočene karakteristike iz WT ili Clec12a-/- fecesa, 16S rRNA sekvencioniranje alfa raznolikosti. Srednja vrijednost +/- SEM, upoređena korištenjem Mann-Whitney testa.

E) Pielou ravnomjernost iz WT ili Clec12a-/- fecesa, 16S rRNA sekvenciranje alfa raznolikosti. Srednja vrijednost +/- SEM, upoređena korištenjem Mann-Whitney testa.

F) Shanon Entropy Mean +/- SEM, upoređen koristeći Mann-Whitney test.

G) ANCOM analiza iz WT i Clec12a-/- fecesa. Taksonomska imena su najbolja klasifikacija ASV-a koristeći Genome Taxonomy Database (GTDB).

H) Relativna brojnost Faecalibaculum rodentium ASV. U poređenju sa Mann Whitneyjem * p < {{0}}.05; ** p < 0.01; *** p < 0,001; **** p < 0,0001

I) C57Bl/6 WT SPF miševi su prethodno tretirani sa 1x108 CFU F. rodentium oralnom sondom tokom tri dana. Životinje su zatim dobijale 2,5% DSS u vodi za piće tokom 7 dana, dok su nastavile da primaju dnevnu gazu F. rodentium. Procenat gubitka težine je procenjivan dnevno. Srednja vrijednost +/- SEM, podaci su objedinjeni od četiri odvojena eksperimenta koristeći dvosmjernu ANOVA-u i Tukey test višestrukog poređenja.

J) Dužina debelog crijeva (cm) naznačenih životinja je mjerena prilikom žrtvovanja. Stupasti grafikon je srednja vrijednost +/- SEM, podaci su prikupljeni iz četiri odvojena eksperimenta upoređeni korištenjem obične jednosmjerne ANOVA sa Dunnet testom višestruke korekcije. Svaka tačka predstavlja jednog miša. * p < 0.05; ** p < 0.01; *** p < 0,001; **** p < 0,0001

Slika 5. Clec12a ograničava upalu i potiče fagocitozu u makrofagima.

A) Imunofenotipizacija je izvedena putem protočne citometrije na ćelijama izolovanim iz lamine proprie debelog creva (cLP) na WT i Clec12a-/- životinjama. Heatmap pokazuje učestalost ekspresije Clec12a na urođenim i adaptivnim imunološkim stanicama

B) Stupasti grafikon prikazuje učestalost pre-gate, CD38+ ćelija (M1 makrofaga) iz cLP-a naznačenih životinja. Srednja vrijednost +/- SEM, upoređena korištenjem neuparenog t-testa. Svaka tačka predstavlja jednog miša.

C) Stupasti grafikon prikazuje učestalost pre-gate, EGR2+ ćelija (M2 makrofaga) iz cLP-a naznačenih životinja. Srednja vrijednost +/- SEM, upoređena korištenjem neuparenog t-testa. Svaka tačka predstavlja jednog miša.

D) BMDM su sakupljeni iz WT i Clec12a-/- dugih kostiju i kultivisani u prisustvu M-CSF (20 ng/mL) tokom 7 dana. Osmog dana BMDM-ima su pulsirani LPS (100 ng/mL), MDP (10 mg/mL), Pam3cysk (1 mg/mL) ili Flagellin (1 mg/mL) tokom 24 sata. Podloga je sakupljena i ispitana na proizvodnju citokina. Toplotna mapa pokazuje Log2 puta promjenu indiciranih citokina iz Clec12a-/- preko WT.

E) BMDM iz WT i Clec12a-/- miševa su izolovani i kultivisani kao u (A), a zatim su kultivisani sa F. rodentium pri MOI od 10 tokom 24 sata. Nakon što su BMDM isprani, RNA je sakupljena i pripremljena za sekvenciranje RNK. Top 10 pojednostavljenih kategorija GO termina (biološki proces) obogaćenih među Clec12a-/- niže reguliranim

F) Peritonealni makrofagi su izolovani iz WT i Clec12a-/- miševa, a zatim su kultivisani sa Sybr zeleno obojenim F. rodentium da bi se procenila fagocitoza. Lijevo: WT makrofagi. Desno: Clec12a-/- makrofagi. Prikazane su reprezentativne slike iz svijetlog polja (lijeve kolone), fluorescencije (srednje kolone) i spojene (desne kolone). Žute strelice označavaju primjere ćelija F. rodentium koje su progutale makrofage. skala=20 µm. Slike su reprezentativne za dva odvojena eksperimenta.

G) Stupasti grafikon prikazuje organizme po ćeliji, kao što se vidi u (F). 250 WT ćelija i 269 Clec12a-/- ćelija je izbrojano da se kvantifikuje količina F. rodentium po ćeliji.

Slika 6: Clec12a se direktno vezuje za određene članove mikrobiote.

A) Šematski dijagram koji prikazuje Clec12a-humani IgG1-Fc fuzioni protein ili prazan vektor (samo Fc dio) B) Histogrami protočne citometrijske analize koji predstavljaju diferencijalno vezivanje Clec12a-Fc za različite bakterije ili C. albicans.

DODATNE LEGENDE O FIGURIMA

Dodatna slika 1. Odsustvo Clec12a ne remeti nivoe mokraćne kiseline.

A) Serumska mokraćna kiselina (µM) kod indiciranih životinja je izmjerena da bi se procijenio metabolizam purina između WT i Clec12a-/- C57Bl/6 miševa. Dijagram raspršenja je srednja vrijednost +/- SEM, podaci su prikupljeni iz tri nezavisna eksperimenta korištenjem neuparenog t-testa. Svaka tačka predstavlja jednog miša.

B) Izmjerena je fekalna mokraćna kiselina (µM) kod indiciranih životinja kako bi se procijenilo izlučivanje mokraćne kiseline u crijevima između miševa WT i Clec12a-/- C57Bl/6. Dijagram raspršenja je srednja vrijednost +/- SEM, podaci su prikupljeni iz tri nezavisna eksperimenta korištenjem neuparenog t-testa. Svaka tačka predstavlja jednog miša.

Dodatna slika 2. WT i Clec12a-/- mikrobiote pokreću diferencijalnu bolest

Procenat gubitka težine WT i Clec12a-/- životinja tretiranih antibiotskim koktelom koji se sastoji od neomicina, gentamicina, ampicilina i eritromicina.

Dodatna slika 3. Na sastav mikrobiote utiče Clec12a.

A) PCoA dijagrami prve 3 ose zasnovane na Bray-Curtisovim udaljenostima koje pokazuju ukupne odnose mikrobiote i odgovarajuće kutije i dijagrame brkova koji kvantifikuju različitost unutar svake grupe i upoređuju sa Mann-Whitney testom.

B) PCoA dijagrami zasnovani na ponderisanim udaljenostima Unifrac-a i odgovarajućim dijagramima kutija i brkova koji kvantifikuju različitost unutar grupe u poređenju korišćenjem neuparenog Mann-Whitney testa.

C) Tabela koja prikazuje rezultate PERMANOVA testa za WT u odnosu na Clec12a-/- fekalnu mikrobiotu sa Bray-Curtisovim i ponderisanim Unifrac udaljenostima.

Dodatna slika 4: Clec12a u makrofagima ograničava upalu.

A) Violinski dijagrami prikazuju srednji geometrijski intenzitet fluorescentnog intenziteta (MFI) imunih ćelija prikazanih u (A). Srednja vrijednost +/- SEM, Kruskal-Wallisov test sa Dunnovom korekcijom za višestruka poređenja. Slova označavaju grupe koje se značajno razlikuju.

B) Reprezentativni dijagrami protočne citometrije M1 i M2 makrofaga iz cLP-a WT ili Clec12a-/- miševa nakon DSS kolitisa. Ćelije su unaprijed zatvorene na live, CD45+, Ly6C-, CD11b+, MHCII+ i CD64+. Sa slike 5A

Dodatna slika 5. Clec12a stabilizuje kontrolu ćelijskog ciklusa i reguliše fagocitozu u makrofagima.

A) Top 10 pojednostavljenih GO termina (biološki proces) kategorija obogaćenih među Clec12a-/- up-reguliranim genima u poređenju sa WT kao odgovor na F. rodentium. BMDM miševa WT i Clec12a-/- koji su kultivisani zajedno sa F. rodentium su izolovani i analizirani kao na slici 7A.

B) Peritoneal macrophages were prepared as described and co-cultured with Sybr®-green stained F. rodentium. Bacteria cells were counted inside macrophages. >Izbrojano je 200 makrofaga. Stupasti grafikon prikazuje prosječan broj F. rodentium iz 4 pojedinačne jažice kako bi se prikazala konzistentnost brojanja i efekta na jažice. Srednja vrijednost +/- SEM upoređena korištenjem neuparenog t-testa.

ZAHVALNICA

Željeli bismo zahvaliti Gordonu Brownu što je obezbijedio životinje Clec12a-/- za ovaj projekat. Ovaj rad je podržala Fondacija Helen Hay Whitney (KSO), NRSA NRSA Microbial Pathogenesis T32 Grant za obuku (KSO), CCFA Senior Research Award (JLR), NIDDK R01DK124336, NIDDK R01124317 i NCCAM R023AT Jr. Foundation (JLR), NSF CAREER nagrada (IOS-1253278) (JLR), Packard Fellowship in Science and Engineering (JLR), Burroughs Welcome Investigator in Pathogenesis Award (JLR), American Asthma Foundation (JLR), Margolis Fondacija (JLR), grant MS Society Center (JLR) i Fondacija WM Keck (JLR) NIH New Innovator Award DP2GM111099-01 (RMO), NHLBI R00HL102228-05 ( RMO), grant Američkog društva za istraživanje raka (RMO), Kimmel Scholar Award (RMO), R01AG047956 (RMO) i NIAID R01AI141202 (ASI). Ovaj rad je podržan od strane Ustanove za protočnu citometriju Univerziteta u Utahu, uz Nacionalni institut za rak, kroz nagradu broj 5P30CA042014-24. Podrška i resursi Centra za računarstvo visokih performansi na Univerzitetu Utah su zahvalni.

DOPRINOSI AUTORA

TRC je pomogao u osmišljavanju studije, izveo većinu eksperimenata s miševima i imunolokom, spojio podatke u brojke i pomogao u pisanju rukopisa. RB je postavio eksperimente bez klica i održavao sve životinje bez klica. ESV je pomogao u imunološkim eksperimentima crijeva lamina propria. KSO je pomogao u sakupljanju miševa i pružio uvid i smjer. KMB je pomogao u sakupljanju miševa i protočnoj citometriji. MCN je pomogao u sakupljanju miševa. WV je pružio pomoć u izgradnji konstrukta za fuzioni protein i prečišćavanju. TJ je pružio pomoć u testovima fagocitoze. JH je analizirao mikroskopska stakalca fagocitoze. MH je pružio pomoć u pročišćavanju i korištenju fuzionog proteina. KAK obezbjeđuje izolate bakterija. ROC je pružio imunološku ekspertizu i uvid. WZS je pomogao u osmišljavanju studije, izvršio je bioinformatičke analize, pomogao u pripremi figura i statistike i pomogao u pisanju rukopisa. JLR je pomogao u osmišljavanju i usmjeravanju studije, nadgledao eksperimentalni dizajn i rezultate, organizirao saradnike i reagense, prikupio sredstva za studiju i pomogao u pisanju rukopisa.

METODE

Sojevi miševa

Sve linije miša korištene ovdje bile su na pozadini C57BL/6. Clec12a-/- miševe je ljubazno obezbijedio Gordon Brown (Medical Research Council Center for Medical Mycology, University of Exeter) i bili su genotipizirani prema njihovom prethodno opisanom protokolu (Redelinghuys, et al. 2016). Rag2-/- i TCRb-/- (Jackson Laboratories, 002118) su nabavljeni od Jackson Laboratories i održavani u našoj koloniji miševa nekoliko generacija. Za sve eksperimente s kolitisom in vivo korišteno je 8 do 12-nedjelja starih miševa podudarnog spola. Korišteni su i mužjaci i ženke miševa. Miševi su održavani u specifičnim uslovima bez patogena.

Sojevi bakterija i gljivica

Sljedeći organizmi su nabavljeni iz DSMZ-Njemačke zbirke mikroorganizama i ćelijskih kultura GmbH: Faecalibaculum rodentium (DSM# 103405); Akkermansia mucinophilia DSMZ (DSM# 26127); Bifidobacterium animalis DSMZ (DSM# 26074). Bacteroides uniformis je nabavljen iz Američke kolekcije tipskih kultura (ATCC® 8492™). Roseburia sp (oznaka soja JLR.KK002) izolovan je na Schaedlerovom agaru od C57BL/6 miševa koji su imali mikrobiotu obogaćenu sporama. Obogaćivanje spora je izvedeno kao što je prethodno opisano i miševi su održavani više generacija s ovom mikrobiotom u našem gnotobiotičkom objektu prije nego što je JLR.KK002 izoliran iz fecesa (Browne et al., 2016). Mi smo PCR-amplifikovali i Sanger je sekvencirao 16S rRNA gen, a zatim ga klasifikovao uslugom SILVA ACT i bazom podataka SILVA (Pruesse et al., 2012). Korišten je soj Salmonella typhimurimum ST2. Korišten je soj Candida albicans sc5314. Bakterijski sojevi koji se koriste u sintetičkoj zajednici PhyLo11b opisani su u nastavku.

Eksperimentalni kolitis izazvan DSS-om

Kolitis je izazvan dodatkom 2,5% ili 3% (w/v) 36,000-50,000MW dekstran natrijum sulfata (DSS) (MP Biomedicals) u vodu za piće tokom 7 dana. Težina kolitisa je praćena svakodnevno kroz promjene tjelesne težine, konzistencije stolice i krvi izmeta. Za eksperiment spašavanja monocita svi miševi su primali 2,5% DSS tokom 5 dana, nakon čega je davana redovna voda; praćenje težine je nastavljeno do 10. dana kada su životinje požnjevene. Ograničenja težine veće od 20% gubitka težine su nametnuta kao prag težine. Na eksperimentalnim krajnjim tačkama, MLN i debelo crijevo su uklonjeni. Debelo crijevo je mjereno od cekuma do rektuma da bi se odredila dužina. Tkiva su zatim obrađena za histologiju, ekstrakciju RNK ili protočnu citometrijsku analizu.

Histologija debelog crijeva i bodovanje

Colons were fixed within histology cassettes O/N at RT in 10% buffered formalin phosphate solution after removal of fecal contents and then transferred to 70% EtOH at 4 C until staining. Sectioning and H&E staining were done at the HCI Biorepository and Molecular Pathology Resource core in the ARUP-operated Research Histology division. Colon scoring was done in a blinded manner with the following rubric scales: percentage of colon crypt loss (0.5 (5%) - 7 (>75%)), crypt loss severity (1 (partial loss) – 5 (full loss)) and inflammatory aggregates (1 (1-3) – 3 (>7)).

Lipocalin-2 (LCN-2) ELISA

Protokol je obavljen prema protokolu proizvođača (Fischer Scientific DY1857-05). Ukratko, izmet je sakupljen, izvagan i zgnječen u HBSS 1X u koncentraciji od 100 mg/mL. Uzorci su zatim centrifugirani na 50 xg tokom 5 minuta kako bi se uklonili veliki ostaci. Supernatant je zatim uklonjen i stavljen u novu epruvetu i centrifugiran na 8000 xg 5 minuta da bi se bakterije taložile. Ovaj supernatant je zatim razrijeđen prema bolesti životinja, ali općenito se kretao od 1:100- 500 (zdravo) – 1:500-1000 (liječeno DSS-om). Mjerenje mokraćne kiseline Koncentracija mokraćne kiseline obavljena je prema uputama proizvođača (Invitrogen™ Amplex™Red test aktivnosti mokraćne/urikaze, kat. br. A22181). Ukratko, krv je sakupljena od WT ili Clec12a-/- miševa srčanom punkcijom u zlatne gornje epruvete za odvajanje seruma. Epruvete su ostavljene da se zgrušaju 30 minuta, a zatim su centrifugirani na 1300 xg 10 minuta. Serum je uklonjen i stavljen u Eppendorf epruvete od 1,5 ml, brzo zamrznut i pohranjen na -80 stepeni Celzijusa do testiranja. Fekalna mokraćna kiselina je izvedena dobijanjem svježih fekalnih peleta od WT i Clec{22}}/- miševa. Pelete su izvagane i snimljene, a zatim izgnječene u 1 mL 1x reakcijskog pufera. Nakon fizičkog gnječenja, epruvete su centrifugirane na 50 xg 5 minuta kako bi se uklonili veliki ostaci. Preostala fekalna kaša je analizirana na mokraćnu kiselinu.

Eksperimentalni kolitis prijenosa T-ćelija

WT slezine su izolirane i izgnječene u RPMI koji sadrži 10% fetalnog goveđeg seruma, penicilina i streptomicina. Ćelije su centrifugirane na 367 xg da bi se izolovale ćelije. Dobiveni pelet je zatim suspendiran u 1x puferu za lizu RBC 5 min, u mraku, na sobnoj temperaturi. Dobijene bijele krvne ćelije su zatim propuštene kroz Miltenyi CD4+ MACS kolonu da se izoluju CD4+ T-ćelije. T-ćelije su zatim obojene sa CD4 i CDRB i sortirane na FACS Aria Fusion (BD Biosciences). CD4+ CDRBhi ćelije su sakupljene i primijenjene na TCRb-/- ili TCRb-/-; Clec12a-/- miševi intraperitonealno (IP). Svaki miš je dobio 5 x 105 ćelija. Težina i razvoj kolitisa praćeni su sedmično procjenom gubitka težine. Na eksperimentalnoj krajnjoj točki, MLN i debelo crijevo su uklonjeni, a debelo crijevo je izmjereno od cekuma do rektuma kako bi se procijenila težina bolesti.

Izolacija leukocita iz lamine propria debelog crijeva

Mišja debelo crijevo sa spojenim cecama je sakupljeno i stavljeno u 1X PBS u 6-ploče na ledu. Bilo koja vidljiva zaostala masnoća i vezivno tkivo je uklonjeno, a cekum je odsječen iz debelog crijeva. Debela crijeva su otvorena i sluz i izmet su pažljivo uklonjeni iz debelog crijeva prije nego što su stavljeni nazad u 6-ploču. Nakon što su sva crijeva bila raspršena i ostrugana, svako debelo crijevo je isječeno na kockice na poklopcu Petrijeve posude pomoću žileta i stavljeno u posebnu epruvetu od 50 mL. Dodan je 10 mL prethodno zagrijanog rastvora za disocijaciju (1X HBSS bez Ca+ i Mg+, 1,5 mM DTT, 10 mM HEPES i 30 mM EDTA) i epruvete su kratko vorteksirane. Debelo crevo je inkubirano oko 25 minuta. na 37 stepeni uz mućkanje na 150 o/min dok rastvori ne postanu mutni od IEC odvajanja. Uzorci su protreseni 3X i vorteksirani 15 sekundi, a zatim izliveni preko 100 mM filtera na 50 ml konus da se uklone neimune ćelije kao što su IEC, a filteri su nakratko isprani sa 2 mL ledeno hladnog 1X PBS. Preostalo tkivo je sakupljeno na filter pincetom i prebačeno u novi konusni od 50 mL. 15 mL prethodno zagrijanog rastvora za varenje (1X HBSS sa Ca+ i Mg, 5% FBS, 50 U/ml Dispase II [Millipore-Sigma, kat. br. 4942078001], 0,5 mg/ml DNAse I [Worthington Biochemical, cat # LS9]002 i 0,5 mg/mL kolagenaze D [Millipore-Sigma, kat. br. 11088866001]) je dodano, uzorci su kratko vorteksirani, a zatim inkubirani 45 min. na 37 stepeni uz mućkanje na 150 o/min, ili dok se rastvor ne zamuti. Uzorci su zatim protreseni 3x i vorteksirani 15 sekundi. Da bi se prikupile preostale imune cLP ćelije, digestirano tkivo je zatim preliveno preko 40 mM filtera na 50 mL konusnoj epruveti koja sadrži 10 mL 1X PBS. Uzorci se zatim ispiru i filtriraju sa 2 mL ledeno hladnog 1X PBS i centrifugiraju na 800 xg 10 minuta na 4 stepena. Zatim je supernatant uklonjen i odbačen vakuumom. Ćelije su zatim resuspendovane u 500 ml kompletnog RPMI-a i prebrojane uz pomoć bojanja za isključenje Trypan plavo.

Protočna citometrija

Leukociti izolovani iz cLP-a su obojeni radi održivosti upotrebom zombi boje 510 (AmCyan) 10 minuta na sobnoj temperaturi u mraku. Uzorci su zatim blokirani Fc receptorom sa CD-16/32 20 minuta na 4 stepena u mraku. Nakon centrifugiranja na 367 xg tokom 5 minuta, dekantirane ćelije su obojene 30 minuta u mraku na 4 stepena. Sva antitela su korišćena u razblaženju od 1:250 osim ako nije drugačije naznačeno. Myleloid panel se sastojao od CD45-BV421, CD11b-PerCpCy5.5, MHCII-BV605, CD64-BV711, CX3CR1-BV785, Ly6C-FITC, CD38-PE- Cy7, Ly6G-CF-594, Clec12a-PE (1:500), EGR2-APC (intracelularno, 1:50). T ćelije su se razlikovale po: Zombie dye 510 (AmCyan), CD45-BV421, CD3e-BV711, CD4-FITC, Foxp3-APC (intracelularno 1:50), IL{{ 50}}PE (intracelularno 1:50), IFN-g (BV605) (intracelularno 1:50), RORgt-PE610 (intracelularno 1:50), IL-17A-BV785 (intracelularno 1:50). Nakon bojenja, ćelije su isprane 2 puta po 5 minuta puferom za kolonu (1X HBSS bez Ca2+, Mg2+ i HEPES, EDTA, FBS). Ćelije su fiksirane O/N sa 2% PFA ako nije bilo potrebno intracelularno bojenje, a zatim isprane u puferu kolone 2X prije rada na protočnom citometru. Ako je bilo potrebno intracelularno bojenje, slijedili su se FoxP3 / komplet pufera za bojenje transkripcionog faktora (Tonbo Biosciences) i protokol. Svi uzorci su zatim resuspendirani u 300 ul pufera za kolonu i rađeni na BD LSR Fortessa nakon kompenzacije sa UltraComp eBeads (ThermoFisher Scientific) i korištenjem kontrola za jednu mrlju.

Bakterije koje boje IgA

Bakterije su izolovane iz fekalnih peleta gnječenjem u HBSS sa Ca2+ i Mg2+, u koncentraciji od 100 mg fecesa po mL HBSS. Zgnječeni izmet je zatim centrifugiran na 50 xg tokom 5 minuta kako bi se uklonili veliki ostaci. Supernatant je uklonjen i stavljen u novu epruvetu. Ovo je zatim centrifugirano na 8000 xg 5 minuta da bi se taložile bakterije. Supernatant je uklonjen i pelete su isprane u HBSS sa Ca2+ i Mg2+. Konačno, pelete su resuspendirane u HBSS-u u koncentraciji od 100 mg/mL, a 10 uL od toga je stavljeno u 96-ploču i blokirano sa HBSS w/ Ca2+ i Mg2+ koji sadrži 10% FBS za 20 min na sobnoj temperaturi. Zatim je direktno u uzorak dodano 100 uL anti-IgA (PE) i inkubirano 30 minuta na 4 C u mraku. Ćelije su zatim isprane u rastvoru HBSS+FBS 2x i na kraju resuspendovane u HBSS+1x Sybr®-green i ostavljene da se inkubiraju 20 minuta u mraku na sobnoj temperaturi. Uzorci su zatim direktno očitani na protočnom citometru.

Izolacija koštane srži

Koštana srž je izolirana kao što je prethodno opisano. Ukratko, duge kosti iz C57Bl/6 divljeg tipa ili Clec12a-/- životinja su izvađene i očišćene papirnim ubrusom blagim trljanjem. Čiste kosti su držane na ledu dok su životinje obrađivane. Krajevi kostiju su bili malo ošišani kako bi se otkrila srž. Kost je umetnuta (otvoreni kraj okrenut prema dolje) u 0.5mL Eppendorf epruvetu koja je bila probušena iglom od 18g. Ova 0.5mL Eppendorf epruveta je zatim stavljena u Eppendorf epruvetu od 1.5mL i okretana na 13,000 x g 1min. Provučena kroz koštanu srž je zatim lizirana eritrocitom, koristeći pufer za lizu eritrocita (Biolegend) prema preporukama proizvođača. Nakon lize eritrocita, ćelije su resuspendirane u kompletnom Dulbecco-ovom modificiranom mediju Eagle (DMEM) koji sadrži: 10% FBS, 1mg/mL Pen/Strep, HEPES 10mM, 1x neesencijalne aminokiseline, natrijum piruvat 1mM. Ćelije su zatim centrifugirane na 367 xg pet minuta da bi se taložile ćelije. Izolirane ćelije su zatim korištene za razvoj BMDM-a ili za daljnju izolaciju monocita.

Makrofagi izvedeni iz koštane srži

Leukociti su izolovani iz izolacije koštane srži, suspendovani u kompletnom DMEM-u i prebrojani pomoću tripan plavog bojenja na hemocitometru. Ćelije su postavljene na posude od 10 cm tretirane kulturom tkiva u koncentraciji od 5-8 x 106 ćelija/ploči u 10 mL kompletne podloge + M-CSF (20 ng/mL). Svježi medij, uključujući M-CSF, dodan je postojećim medijima 4. i 7. dana. Potpuno diferencirani BMDM-i su korišteni za eksperimentalnu upotrebu između dana 7-9.

Izolacija monocita

Koštana srž je sakupljena od WT i Clec12a-/- životinja kao što je prethodno opisano. Monociti su izolovani sa kompletom za izolaciju monocita (BM), mišem (Miltenyi Biotec) i LS MACS kolonom prema uputstvima proizvođača.

F. rodentium BMDM ko-kultura i RNAseq

Kulture F. rodentium su kvantificirane pomoću OD 600nm (koristeći 1 OD 600nm=1 x 10^8 ćelija/mL), isprane 2x u sterilnom PBS-u i zajedno kultivirane sa 1 x 106 ćelija/mL potpuno diferenciranih BMDM na MOI od 10 u 6-pločama za kulturu tkiva. Nakon 24 sata ko-kulture, podloga je sakupljena i pohranjena na -20 C do daljnje upotrebe. BMDM su isprani hladnim, sterilnim PBS, 2x. Qiazol (Qiagen cat# 79306) RNA-stabilizacijski reagens, zatim je dodan direktno u svaku jažicu. Jažice su strugane sa strugačem za ćelije sakupljene u 1,5 Eppendorf epruvete i zamrznute na -20 stepeni do ekstrakcije RNK. Ekstrakcija RNK je izvedena korišćenjem Direct-zol RNA miniprep kita (Zymo Research cat# R2070) prema uputstvima proizvođača, a biblioteke sekvenciranja su pripremljene od strane Huntsman Cancer Institute High-throughput Genomics jezgre. Ukupna RNA je prvo hibridizirana sa NEBNext rRNA Depletion kitom v2 (NEB, cat# E7400) da bi se smanjila rRNA iz uzoraka. Biblioteke sekvencioniranja lančanih RNA pripremljene su upotrebom NEBNext Ultra II Directional RNA Library Prep Kit za Illumina (NEB, kat.# E7760L). Pročišćene biblioteke su kvalificirane na Agilent Technologies 4150 TapeStation pomoću D1000 ScreenTape testa (Agilent, cat# 5067-5582 i 5067-5583). Molarnost molekula modificiranih adapterom definirana je kvantitativnim PCR-om korištenjem Kapa Biosystems Kapa Library Quant Kit (Roche, cat#07960140001). Pojedinačne biblioteke su normalizovane na 5 nM u pripremi za analizu Illumina sekvence i sekvencionirane na NovaSeq 6000 sa uparenim krajem 150-ciklusa sekvenciranja.

Analiza citokina

BMDM su izolovani i uzgajani kako je prethodno opisano. Potpuno diferencirani BMDM su postavljeni na 1 x 105 ćelija/jažici u 12-ploče za kulturu tkiva. BMDM su stimulisani sa 100ng/mL LPS; 1 ug/mL Pam3Cysk; ili 1 ug/mL flagelina. Ćelije su stimulirane 24 sata, medijum je sakupljen i sačuvan na -20 C za analizu. Citokini su analizirani pomoću LEGENDplex™ Mouse Inflammation Panel (13-plex) (Biolegend, kat. br. 740150). Podaci su analizirani pomoću softvera za analizu podataka LEGENDplex™.

Sekvenciranje gena 16s rRNA

Fekalne pelete ili ilealni sadržaj sakupljeni su od pojedinačnih miševa i odmah zamrznuti na {{0}} stepeni u epruvetama sa navojnim poklopcem od 2 mL koje sadrže 250 mg zrna granata od 0,15 mm (MoBio, kat. br. {{5 }}). DNK je ekstrahovan korišćenjem Power Fecal DNA Isolation Kit (MoBio ili QIAGEN), prema uputstvima za komplet, i uključivao je 2 ciklusa po 1 minutu udaranja kuglica na 4 stepena na Mini-Bead-Beater 16 (BioSpec proizvodi). V3 i V4 regije gena 16S rRNA su amplificirane jednom rundom PCR-a korištenjem prajmera koji su sadržavali (opisano 3' do 5') V3/4 regiju 16S rRNA gena za ciljanje sekvence, nakon čega je slijedio 2-nukleotidni jastučić sekvencama prajmera Illumina, sekvencom nukleotidnog indeksa 8- i preostalom sekvencom Illumina adaptera. V3/4 16S-ciljne sekvence su preuzete od Takahashija (Takahashi et al., 2014), a indeksi su preuzeti od Kozicha (Kozich et al., 2013). Potpune oligonukleotidne sekvence koje su korištene su (indeksi označeni sa Xs): Prok16SV34_Za: AATGATACGGCGACCACCGAGATCTACACXXXXXXXXACACTCTTTCCCTACACGACGCTC TTCCGATCTTGCCTACGGGNBGCASCAG; Prok16SV34_Rev: CAAGCAGAAGACGGCATACGAGATXXXXXXXXGTGACTGGAGTTCAGACGTGTGCTCTTCC GATCTGCGACTACNVGGGTATCTAATCC. Uslovi PCR ciklusa bili su sledeći: početna denaturacija od 98 stepeni tokom 2 minuta; 26 ciklusa od 20 sekundi 98 stepeni denaturacije, 20 sekundi 51,5 stepeni žarenja, 20 sekundi 72 stepena ekstenzije; i jedno konačno produženje od 72 stepena u trajanju od 2 minuta. Svaki PCR (izveden u tri primjerka za svaki uzorak) je urađen u zapremini od 25 ul koristeći Q5 High-Fidelity 2X Master Mix (NEB, kat. br. M0492L), 5 pmol svakog prajmera i 50 ng šablonske DNK. Nakon amplifikacije, triplikati PCR-a iz svakog uzorka su spojeni, 5 ul je stavljeno na agarozni gel da se potvrdi amplifikacija, a preostali volumen je očišćen korištenjem Axygen AxyPrep MAG PCR perli za čišćenje (Corning, kat. br. MAG-PCR-CL{{53 }}) razrijeđen do 62,5% u vodi kako bi se efikasno uklonio bilo koji dimer prajmera koji bi se preferencijalno sekvencirao. Razrijeđene kuglice su dodane pri 1,8X volumena PCR reakcija, očišćene prema uputama proizvođača, a očišćeni amplikoni eluirani sa 25 ul 10 mM Tris-Cl, pH 8,0. Amplikoni su zatim kvantificirani piko zelenim dsDNA testom (ThermoFisher, kat. #P11495) na čitaču mikroploče, a zatim su očišćene i indeksirane pojedinačne biblioteke sekvencioniranja ravnomjerno multipleksirane (pomoću ng DNK) i sekvencionirane na Illumina MiSeq instrumentu u uparenom kraju. Režim 300 ciklusa u zajedničkom resursnom objektu Huntsman Cancer Institute High-Throughput Genomics.

Bioinformatička obrada sekvencijskih podataka

Sirova očitanja gena 16S rRNA su demultipleksirana omogućavajući 0 nepodudarnosti u indeksima, a zatim obrađene i analizirane u okviru QIIME2 (Bolyen et al., 2019.) kao što smo prethodno opisali (Stephens et al., 2021.). Ukratko, demultipleksirane i kvalitetno filtrirane sekvence prvo su izrezane od sekvenci prajmera i linkera pomoću dodatka Cutadapt, a zatim su denoizirane pomoću DADA2 (Callahan et al., 2016; Martin, 2011). Taksonomije su zatim dodijeljene ASV-ovima pomoću metode classifysklearn u dodatku za klasifikator obilježja, u odnosu na GTDB referentni skup (release89) koji je skraćen na pojačanu V3/4 regiju i obučen metodom fit-classifier-naive-bayes (Bokulich et al. , 2018; Parks et al., 2018; Pedregosa et al., 2011). metrika raznolikosti, udaljenosti i statistička značajnost grupisanja beta raznolikosti prema permanovi izračunati su u okviru QIIME2 (Anderson, 2001).

Za RNA-sekve BMDM-ova, neobrađena očitanja su bila prvog kvaliteta i isječena pomoću adaptera korištenjem trim galore, a zatim je broj transkripata kvantificiran korištenjem Salmon u odnosu na transkriptom iz skupa GRCm38 (mm10) (Patro et al., 2{{ 16}}17). Kvantifikacije nivoa transkripta su pročitane u R pomoću vremenskog paketa i sažete do broja gena prije analize diferencijalne ekspresije sa DESeq2 koristeći formulu dizajna '~ Genotip + Tretman + Genotip: Tretman' (Love et al., 2014; Love et al., 2020). Diferencijalni odgovori na F. rodentium predstavljali su razliku između odgovora svakog genotipa na tretman sa živim F. rodentium u odnosu na ćelije koje su tretirane kontrolno sredstvom. Geni sa značajno različitom ekspresijom definisani su kao oni sa prilagođenom p-vrednošću < 0,05 i log2 puta promenom > |0,58| (promena 1,5 puta). Liste gena sa značajno smanjenom i povećanom regulacijom su zatim korištene za testiranje obogaćivanja termina genske ontologije (GO) koristeći clusterProfiler paket uključujući funkciju pojednostavljenja za smanjenje redundanse GO termina i identifikaciju ključnih bioloških procesa (S, 2020; Wu et al. ., 2021.).

F. rodentium DSS izazov

F. rodentium je uzgajan kako je prethodno opisano i kvantificiran na 1 x 109 CFU/mL u sterilnom PBS-u. F. rodentium je fiksiran prvo pranjem 2x u sterilnom PBS-u, a zatim resuspendiranjem u 1 mL 10% Fomalin-PBS tokom 10 minuta. Ćelije su zatim isprane još dva puta u 10 mL sterilnog PBS-a da bi se pripremile za oralnu sondu. Nefiksirani su isprani kao fiksne ćelije i držani na ledu do sonde. WT C57BL/6 SPF miševi su oralno izmjereni sa 100 uL otopine koja je sadržavala ili sam PBS (nosilac), F. rodentium (živi) ili F. rodentium (fiksiran) od dana -3 do 10. Životinjama je dato 3,0% DSS u danima 0-7; svježa DSS voda se mijenjala svaki drugi dan. Ograničenja težine veće od 20% gubitka težine su nametnuta kao prag težine. Na eksperimentalnim krajnjim tačkama, MLN i debelo crijevo su uklonjeni. Debelo crijevo je mjereno od cekuma do rektuma da bi se odredila dužina. Tkiva su zatim obrađena za histologiju, ekstrakciju RNK ili protočnu citometrijsku analizu.

Test fagocitoze

Peritonealni makrofagi su izolovani ubrizgavanjem 5 mL sterilnog PBS-a u peritonealnu šupljinu. PBS je lagano miješan dok je bio u šupljini svakih nekoliko sekundi. Nakon 2 minute, PBS je izvučen pomoću igle 28 gauge i dodijeljen u hladan kompletan DMEM. Ćelije su centrifugirane na 367 xg i isprane u kompletnom mediju. Ćelije su zatim izbrojane hemocitometrom i postavljene u 12-ploče za kulturu tkiva u koncentraciji od 2,5 x 105 ćelija/mL. Ćelije su ostavljene da prianjaju preko noći. Sljedećeg dana, bunari su lagano pomiješani vrtložnim miješanjem i medij je aspiriran. Adherentne ćelije su zatim dva puta isprane sa 500 uL hladnog, sterilnog, PBS. Prethodno zagrejani kompletni DMEM koji sadrži F. rodentium pri MOI od 10 je zatim dodat adherentnom (makrofagu). Ploče su zatim lagano centrifugirane na 200 xg, na sobnoj temperaturi tri minuta, a zatim inkubirane u standardnim uslovima ćelijske kulture (37 C, 5% CO2) 90 minuta. F. rodentium je pripremljen kako je opisano za ko-kulturu BMDM-a samo za sekvenciranje RNK, nakon ispiranja, ćelije su resuspendirane u 1x Sybr® zelenom (Sigma-Aldrich CAS: 163795-75-3), na sobnoj temperaturi 20 minuta. Bakterijske ćelije su zatim peletirane na 4000 rpm tokom 5 minuta, resuspendirane sa kompletnim DMEM-om i prethodno zagrijane za peritonealne makrofage. Nakon 90 minuta ko-kulture, medij je aspiriran, a ćelije su dva puta isprane hladnim, sterilnim, PBS. Adherentne ćelije koje sadrže Sybr® zeleno obojenu F. rodentium su fiksirane sa 2% paraformaldehida (PFA) tokom 10 minuta. PFA je aspiriran i sterilni PBS je stavljen na ćelije. Ćelije su zatim snimljene za fagocitozu F. rodentium

Analiza slike makrofaga

Brightfield i fluorescentne slike kultura makrofaga tretiranih F. rodentium su snimljene korišćenjem EVOS m7000 Imaging System (Thermo Fisher Scientific, Waltham, MA). Za svaku kulturu snimljeno je tri do pet odvojenih randomiziranih slika, koje su izvedene u tri primjerka.

Images were blinded and quantified using the software Fiji (Schindelin et al., 2012). Individual bacteria and macrophages were easily distinguished based on size. The total number of bacteria that were associated with (touching or overlapping with) single macrophages was quantified for a randomized subset of cells within the image. Equal numbers of cells were quantified between genotypes (n>200).

CLEC12A-Fc konstrukcija fuzionog proteina and purification

cDNK koje kodiraju ekstracelularne domene mišjeg Clec12a amplificirane su PCR-om iz bijelih krvnih stanica izoliranih iz C57Bl/6 WT SPF koštane srži i potvrđene sekvenciranjem. cDNK su fuzionisane na C-terminus humanog IgG1-Fc u ekspresijskom vektoru pFuse-hIgG1- Fc2 (InvivoGen). Konstrukti koji sadrže Clec12a ili prazan vektor su transficirani u Lx293 ćelije uzgajane sa DMEM +10% FBS i Pen/strep (1mg/mL). Izlučeni fuzioni proteini su sakupljeni iz medija 24-48 nakon transfekcije. Mediji su centrifugirani na 367 xg tokom 5 minuta da se uklone ostaci/mrtve ćelije, a supernatant je zamrznut na -20 C do upotrebe. Clec12a-Fc ili Fc-only fuzioni proteini izolovani su sa Pierce™ Classic Magnetic IP/Co-IP kompletom (Thermo Fisher Scientific, kataloški broj: 88804), kvantifikovani sa Pierce™ BCA Protein Assay Kit (Thermo Fisher Scientific kataloški broj: 23322) i potvrđeno Western blot-om korištenjem antiClec12a antitijela (Novus Biologicals NBP2-27346SS).

Clec12a-Fc-vezujući test

Pročišćeni konstrukti su razrijeđeni do 0.4 mg/mL u HBSS sa Ca2+ i Mg2+. Bakterije su uzgajane u odgovarajućim medijima i aerobnim uslovima i normalizovane za OD 600nm. Bakterije su isprane sa HBSS w/ Ca2+ i Mg2+ i blokirane sa HBSS w/ Ca2+ i Mg2+ +10% FBS tokom 20 minuta na sobnoj temperaturi. Svi postupci bojenja su se odvijali u atmosferskim uslovima. 1 x 107 bakterijskih ćelija stavljeno je u 96-ploču sa okruglim dnom, centrifugirano na 3,000 xg i dekantirano. 50 uL konstrukta je stavljeno na bakterijske ćelije, lagano pomiješano i inkubirano na 4°C 1 sat. Ćelije bakterija su isprane sa HBSS sa Ca2+ i Mg2+ + 10% FBS, 2x. 50 uL kozjeg anti-humanog Fc (PE) (Ebioscience Catalog # 12-4998-82) je dodano ćelijama i inkubirano na 4 C 1 sat, u mraku. Ćelije su zatim isprane kao i ranije i stavljene u HBSS sa Ca2+ i Mg2+ koji sadrži 1x Sybr® green (Sigma-Aldrich CAS: 163795-75-3). Ćelije su inkubirane na sobnoj temperaturi 20 minuta u mraku i odmah očitane na BD LSR Fortessa protočnom citometru.

Ozračenje i rekonstitucija koštane srži

Koštana srž je sakupljena od WT i Clec12a-/- životinja kao što je prethodno opisano. Primljeni miševi su smrtonosno zračeni sa 500 Rads na dan -1, nakon čega slijedi 400 Rads na dan 0. Četiri sata nakon posljednjeg ozračivanja, miševi primatelji su stavljeni pod anesteziju izofluranom i 100 uL izolovanog ćelije koštane srži suspendovane u sterilnom PBS-u (1 x 108 ćelija/mL) isporučene su preko igle 28,5 gauge u retro-orbitalni prostor. Zanimala nas je mikrobiota tako da životinje nisu stavljene na antibiotike, te su nakon 8 sedmica sakupljene fekalne pelete za prijenos mikrobiote u GF životinje.

REFERENCE

Anderson, MJ (2001). Nova metoda za neparametarsku multivarijantnu analizu varijanse. Austral Ecol. 26, 32-46. DOI 10.1111/j.1442-9993.2001.01070.pp.x.

Begun, J., Lassen, KG, Jijon, HB, Baxt, LA, Goel, G., Heath, RJ, Ng, A., Tam, JM, Kuo, SY, Villablanca, EJ, et al. (2015). Integrirana genomika varijante rizika Crohnove bolesti

identificira ulogu CLEC12A u antibakterijskoj autofagiji. Rep. ćelije 11, 1905-1918. 10.1016/j.celrep.2015.05.045.

Blander, JM, Longman, RS, Iliev, ID, Sonnenberg, GF, i Artis, D. (2017). Regulacija upale interakcijama mikrobiote s domaćinom. Nat. Immunol. 18, 851-860. 10.1038/ni.3780.

Bokulich, NA, Kaehler, BD, Rideout, JR, Dillon, M., Bolyen, E., Knight, R., Huttley, GA, i Caporaso, JG (2018). Optimiziranje taksonomske klasifikacije sekvenci amplikona marker-gena sa QIIME 2 ''sq2-dodatkom za klasifikaciju karakteristika. Mikrobiom 6. ARTN 90 10.1186/s40168-018-0470-z.

Bolyen, E., Rideout, JR, Dillon, MR, Bokulich, N., Abnet, CC, Al-Ghalith, GA, Alexander, H., Alm, EJ, Arumugam, M., Asnicar, F., et al. (2019). Ponovljiva, interaktivna, skalabilna i proširiva nauka o mikrobiomskim podacima koristeći QIIME 2. Nat. Biotechnol. 37, 852-857. 10.1038/s41587-019-0209-9.

Brown, GD, Willment, JA, i Whitehead, L. (2018). Lektini C-tipa u imunitetu i homeostazi. Nat. Rev. Immunol. 18, 374-389. 10.1038/s41577-018-0004-8.

Browne, HP, Forster, SC, Anonye, ​​BO, Kumar, N., Neville, BA, Stares, MD, Goulding, D., i Lawley, TD (2016). Uzgoj 'nekulturne' ljudske mikrobiote otkriva nove taksone i ekstenzivnu sporulaciju. Priroda 533, 543-+. 10.1038/nature17645.

Cadwell, K., Liu, JY, Brown, SL, Miyoshi, H., Loh, J., Lennerz, JK, Kishi, C., Kc, W., Carrero, JA, Hunt, S., et al. (2008). Ključna uloga autofagije i gena autofagije Atg16l1 u Paneth stanicama crijeva miša i čovjeka. Priroda 456, 259-263. 10.1038/nature07416.

Callahan, BJ, McMurdie, PJ, Rosen, MJ, Han, AW, Johnson, AJA, and Holmes, SP (2016). DADA2: Zaključak uzorka visoke rezolucije iz podataka amplikona Illumina. Nat. Metode 13, 581-+. 10.1038/Nmeth.3869.

Cao, YG, Bae, S., Villarreal, J., Moy, M., Chun, E., Michaud, M., Lang, JK, Glickman, JN, Lobel, L., and Garrett, WS (2022). Faecalibaculum rodentium remodelira signalizaciju retinoične kiseline za upravljanje homeostazom crijevnog epitela ovisnom o eozinofilima. Ćelijski domaćin i mikrob 30, 1295- 1310 e1298. 10.1016/j.chom.2022.07.015.

Chang, DH, Rhee, MS, Ahn, S., Bang, BH, Oh, JE, Lee, HK, i Kim, BC (2015). Faecalibaculum rodentium gen. nov., sp. nov., izolovan iz fecesa laboratorijskog miša. Antonie Van Leeuwenhoek 108, 1309-1318. 10.1007/s10482-015-0583-3.

Chiaro, TR, Soto, R., Stephens, WZ, Kubinak, JL, Petersen, C., Gogokhia, L., Bell, R., Delgado, JC, Cox, J., Voth, W., et al. (2017). Član mikobiote crijeva modulira metabolizam purina domaćina što pogoršava kolitis kod miševa. Sci. Transl. Med. 9, .

Drouin, M., Saenz, J., i Chiffoleau, E. (2020). C-tip receptora nalik lektinu: glava ili rep u imunitetu na smrt ćelije. Front. Immunol. 11. ARTN 251 10.3389/fimmu.2020.00251.

Fassarella, M., Blaak, EE, Penders, J., Nauta, A., Smidt, H., i Zoetendal, EG (2021). Stabilnost i otpornost crijevnog mikrobioma: razjašnjavanje odgovora na perturbacije kako bi se moduliralo zdravlje crijeva. Gut 70, 595-605. 10.1136/gutjnl-2020-321747.

Gkouskou, KK, Deligianni, C., Tsatsanis, C., i Eliopoulos, AG (2014). Mikrobiota crijeva u mišjim modelima upalne bolesti crijeva. Granice u ćelijskoj i infektivnoj mikrobiologiji 4. ARTN 28 10.3389/fcimb.2014.00028.

Han, YM, Zhang, MH, Li, N., Chen, TY, Zhang, Y., Wan, T., i Cao, XT (2004). KLRL1, novi receptor nalik lektinu ćelije ubice, inhibira citotoksičnost prirodnih ćelija ubica. Krv 104, 2858-2866. DOI 10.1182/krv-2004-03-0878.

Iliev, ID, Funari, VA, Taylor, KD, Nguyen, Q., Reyes, CN, Strom, SP, Brown, J., Becker, CA, Fleshner, PR, Dubinsky, M., et al. (2012). Interakcije između komenzalnih gljiva i lektinskog receptora C-tipa Dectin{2}} utiču na kolitis. Nauka 336, 1314-1317. 10.1126/science.1221789.

Jason L. Kubinak, WZS, Ray Soto, Charisse Petersen, Tyson Chiaro, Lasha Gogokhia, Rickesha Bel1, Nadim J. Ajami, Joseph F. Petrosino, Linda Morrison4, Wayne K. Potts, Peter E. Jensen, Ryan M. O' Connell & June L. runda (2015). MHC varijacija oblikuje individualizirane mikrobne zajednice koje kontroliraju osjetljivost na enterične infekcije. Komunikacija u prirodi. 0,1038/ncomms9642.

Kono, H., Chen, CJ, Ontiveros, F., i Rock, KL (2010). Mokraćna kiselina potiče akutni upalni odgovor na sterilnu ćelijsku smrt kod miševa. J. Clin. Invest. 120, 1939-1949. 10.1172/Jci40124.

Kozich, JJ, Westcott, SL, Baxter, NT, Highlander, SK, i Schloss, PD (2013). Razvoj strategije sekvenciranja sa dvostrukim indeksom i kurira za analizu podataka o sekvenci amplikona na MiSeq Illumina platformi za sekvenciranje. Primijenjena mikrobiologija i okolišna mikrobiologija 79, 5112-5120. 10.1128/Aem.{6}}.

Kubinak, JL, Petersen, C., Stephens, WZ, Soto, R., Bake, E., O'Connell, RM, i Round, JL (2015). MyD88 signalizacija u T ćelijama usmjerava IgA posredovanu kontrolu mikrobiote kako bi promovirala zdravlje. Cell Host Microbe 17, 153-163. 10.1016/j.chom.2014.12.009.

Li, K., Neumann, K., Duhan, V., Namineni, S., Hansen, AL, Wartewig, T., Kurgyis, Z., Holm, CK, Heikenwalder, M., Lang, KS, i Ruland, J. (2019). Receptor kristala mokraćne kiseline Clec12A potencira odgovore na interferon tipa I. Proc Natl Acad Sci USA 116, 18544-18549. 10.1073/pnas.1821351116.

Liu, JZ, van Sommeren, S., Huang, H., Ng, SC, Alberts, R., Takahashi, A., Ripke, S., Lee, JC, Jostins, L., Shah, T., et al . (2015). Analize asocijacije identificiraju 38 lokusa osjetljivosti na upalne bolesti crijeva i ističu zajednički genetski rizik među populacijama. Nat. Genet. 47, 979-986. 10.1038/ng.3359.

Love, MI, Huber, W. i Anders, S. (2014). Umjerena procjena promjene nabora i disperzije za RNA-seq podatke sa DESeq2. Genome Biol. 15. ARTN 550 10.1186/s13059-014-0550-8.

Love, MI, Soneson, C., Hickey, PF, Johnson, LK, Pierce, NT, Shepherd, L., Morgan, M., i Patro, R. (2020). Tximeta: Kontrolne sume referentne sekvence za identifikaciju porijekla u RNA-sekv. Plos Computational Biology 16. ARTN e1007664 10.1371/journal.pcbi.1007664.

Luo, Y., Tucker, SC, i Casadevall, A. (2005). Aktivacija Fc- i komplementa-receptora stimuliše progresiju ćelijskog ciklusa ćelija makrofaga od G1 do SJ Immunol. 174, 7226- 7233. 10.4049/jimmunol.174.11.7226.

Macpherson, AJ, Gatto, D., Sainsbury, E., Harriman, GR, Hengartner, H., i Zinkernagel, RM (2000). Primitivni mehanizam neovisan o T stanicama IgA odgovora crijevne sluznice na komenzalne bakterije. Nauka 288, 2222-+. DOI 10.1126/science.288.5474.2222.

Maglinao, M., Eriksson, M., Schlegel, MK, Zimmermann, S., Johannssen, T., Gotze, S., Seeberger, PH, i Lepenies, B. (2014). Platforma za skrining na ugljikohidrate koji se vezuju za lektinski receptor C-tipa i njihov potencijal za ćelijsko specifično ciljanje i imunološku modulaciju. Journal of Controlled Release 175, 36-42. 10.1016/j.jconrel.2013.12.011.

Marshall, ASJ, Willment, JA, Lin, HH, Williams, DL, Gordon, S., i Brown, GD (2004). Identifikacija i karakterizacija novog humanog mijeloidnog inhibitornog c-tipa lektinskog receptora (MICL) koji je pretežno eksprimiran na granulocitima i monocitima. J. Biol. Chem. 279, 14792-14802. 10.1074/jbc.M313127200.

Martin, M. (2011). Cutadapt uklanja sekvence adaptera iz sekvencijskih čitanja visoke propusnosti. EMBNet.journal 17. Martinez-Lopez, M., Iborra, S., Conde-Garrosa, R., Mastrangelo, A., Danne, C., Mann, ER, Reid, DM, Gaboriau-Routhiau, V., Chaparro , M., Lorenzo, MP, et al. (2019). Senzor mikrobiote od strane Mincle-Syk osi u dendritskim ćelijama reguliše proizvodnju interleukina-17 i -22 i promoviše integritet crijevne barijere. Imunitet 50, 446-461 e449. 10.1016/j.immuni.2018.12.020.

Martinon, F., Petrilli, V., Mayor, A., Tardivel, A., i Tschopp, J. (2006). Kristali mokraćne kiseline povezani sa gihtom aktiviraju NALP3 inflamasom. Priroda 440, 237-241. 10.1038/nature04516.

Nakajima, A., Vogelzang, A., Maruya, M., Miyajima, M., Murata, M., Son, A., Kuwahara, T., Tsuruyama, T., Yamada, S., Matsuura, M., et al. (2018). IgA regulira sastav i metaboličku funkciju crijevne mikrobiote promicanjem simbioze između bakterija. J. Exp. Med. 215, 2019-2034. 10.1084/jem.20180427.

Neumann, K., Castineiras-Vilarino, M., Hockendorf, U., Hannesschlager, N., Lemeer, S., Kupka, D., Meyermann, S., Lech, M., Anders, HJ, Kuster, B. , et al. (2014). Clec12a je inhibitorni receptor za kristale mokraćne kiseline koji reguliše upalu kao odgovor na smrt ćelije. Imunitet 40, 389-399. 10.1016/j.immuni.2013.12.015.

Okai, S., Usui, F., Yokota, S., Hori, IY, Hasegawa, M., Nakamura, T., Kurosawa, M., Okada, S., Yamamoto, K., Nishiyama, E., et. al. (2016). Monoklonski IgA visokog afiniteta reguliše mikrobiotu crijeva i sprječava kolitis kod miševa. Nat Microbiol 1, 16103. 10.1038/nmicrobiol.2016.103.

Pabst, O., i Slack, E. (2020). IgA i crijevna mikrobiota: važnost specifičnosti. Mucosal Immunol. 13, 12-21. 10.1038/s41385-019-0227-4.

Parks, DH, Chuvochina, M., Waite, DW, Rinke, C., Skarshewski, A., Chaumeil, PA, i Hugenholtz, P. (2018). Standardizirana bakterijska taksonomija zasnovana na filogeniji genoma značajno revidira stablo života. Nat. Biotechnol. 36, 996-+. 10.1038/nbt.4229.

Patro, R., Duggal, G., Love, MI, Irizarry, RA, i Kingsford, C. (2017). Losos omogućava brzu kvantifikaciju ekspresije transkripta sa svesnom pristrasnošću. Nat. Metode 14, 417-+. 10.1038/nmeth.4197.

Pedregosa, F., Varoquaux, G., Gramfort, A., Michel, V., Thirion, B., Grisel, O., Blondel, M., Prettenhofer, P., Weiss, R., Dubourg, V., et al. (2011). Scikit-learn: Mašinsko učenje u Pythonu. J Mach Learn Res 12, 2825-2830.

Pyz, E., Huysamen, C., Marshall, AS, Gordon, S., Taylor, PR, i Brown, GD (2008). Karakterizacija mišjeg MICL (CLEC12A) i dokaz o endogenom ligandu. EUR. J. Immunol. 38, 1157-1163. 10.1002/eji.200738057.

Raulf, MK, Johannsen, T., Matthiesen, S., Neumann, K., Hachenberg, S., Mayer-Lambertz, S., Steinbeis, F., Hegermann, J., Seeberger, PH, Baumgartner, W., et al. (2019). Lektinski receptor C-tipa CLEC12A prepoznaje plazmodijalni hemozoin i doprinosi razvoju cerebralne malarije. Rep. ćelije 28, 30-38 e35. 10.1016/j.celrep.2019.06.015.

Ray, A. i Dittel, BN (2015). Međusobna povezanost između disbioze u crijevnoj mikrobioti zbog imunodeficijencije i penetracije bolesti kolitisa. Imunologija 146, 359-368. 10.1111/imm.12511.

Redelinghuys, P., Whitehead, L., Augello, A., Drummond, RA, Levesque, JM, Vautier, S., Reid, DM, Kerscher, B., Taylor, JA, Nigrović, PA, et al. (2016). MICL kontrolira upalu kod reumatoidnog artritisa. Ann. Rheum. Dis. 75, 1386-1391. 10.1136/annrheumdis-2014-206644.