Eterična ulja koja sadrže citral kao potencijalni inhibitori tirozinaze: pristup bio-vođenog frakcioniranja

Kontakt: Audrey Hu Whatsapp/hp: 0086 13880143964 Email:audrey.hu@wecistanche.com

sažetak:

Prekomjerna proizvodnja melanina uzrokuje ozbiljna dermatološka stanja, kao i manje estetske probleme (npr. pjege i solarni lentigo). Smanjenje tirozinaze je široko rasprostranjen pristup u liječenju takvih poremećaja, a biljni ekstrakti su se često pokazali kao vrijedni izvoritirozinazainhibitori. Citral (mješavina nerala i geranijala) je važan mirisni sastojak koji je pokazao anti-tirozinazni potencijal. Visoko je koncentriran u eteričnim uljima (EO) Cymbopogon schoenanthus (L.) Spreng., Litsea cubeba (Lour.) Pers., Melissa officinalis L. i Verbenaofficinalis L. Međutim, samo je L. cubeba EO istražen za koristiti kao potencijalno sredstvo za izbjeljivanje kože. Ovaj rad procjenjuje in vitrotirozinazainhibitornu aktivnost ovih EO i studije, koristeći frakcionisanje orijentisano na bio-test, da li njihovi različiti hemijski sastavi utiču na ukupne inhibitorne aktivnosti EO putem mogućih sinergističkih, aditivnih i/ili kompetitivnih interakcija između komponenti EO. Inhibicijska aktivnost EO C. schoenanthus i EO M. officinalis, sa zanemarljivim ( plus )-citronelalnim količinama, bila je u skladu sa njihovim sadržajem citrala. S druge strane, L. cubeba i V. officinalis EO su inhibiranetirozinazau znatno većoj meri jer sadrže -mircen, koji je doprineo ukupnim aktivnostima EO. Slična zapažanja su napravljena za M. officinalis EO, koji ima visok ( plus )-citronelalni sadržaj koji je povećao citralnu aktivnost.

Ključne riječi:tirozinazainhibicija; esencijalna ulja; citral

cistanche ima funkciju izbjeljivanja

Uvod

tirozinazaje ključni enzim u biosintezi pigmenata melanina u nekoliko bakterija, gljiva, biljaka, životinja i ljudi. Kod ljudi, tirozinaza katalizira korake koji ograničavaju brzinu u biosintetskom putu melanina. Ovu biosintezu karakterizira nekoliko enzimskih i kemijskih reakcija koje dovode do stvaranja melanina iz aminokiseline L-tirozina, pri čemu tirozinaza katalizira njegovu hidroksilaciju u o-dopakinon putem aktivnosti mikofenolata i difenola. Iako postoje i drugi enzimi uključeni u melanogenezu, samo reakcije katalizirane tirozinazom ne mogu se dogoditi spontano, dok se preostali koraci mogu odvijati bez aktivnosti enzima pri fiziološkom pH [1]. Iz tog razloga, smanjenje tirozinaze je vrlo raširen pristup smanjenju prekomjernog melanina. proizvodnja, a upotreba inhibitora tirozinaze kao sredstava za izbjeljivanje kože pokazala je značajan klinički i kozmetički značaj [2].

Na tržištu EU,tirozinazainhibitori koji se koriste kao agensi za izbjeljivanje kože mogu se grupisati u dvije glavne kategorije: one koje su zabranjene prema kozmetičkoj regulativi EU1223/2009 (tj. hidrokinon i mono benzil eter hidrokinon) zbog njihovih ozbiljnih nuspojava, ali se i dalje koriste za liječenje hiperpigmentacije pod medicinskim nadzor;i inhibitori tirozinaze koji su dozvoljeni za upotrebu u kozmetičkim proizvodima (tj. arbutin, aloezin, kojična kiselina) [2,3]. Ovu drugu grupu, međutim, još uvijek karakteriziraju potencijalno značajne nuspojave; kliničke studije o kojičnoj kiselini su zaista istakle slučajeve eritema, osjećaja peckanja i kontaktnog ekcema nakon primjene. Slično, Evropski naučni odbor za sigurnost potrošača izrazio je zabrinutost u vezi sa upotrebom arbutina kao kozmetičkog sastojka [2], zbog potencijalne hidrolize njegove glikozidne veze koja oslobađa hidrokinon. Stoga postoji potreba za novim šablonima molekula i/ili mješavinama bioaktivnih spojeva za liječenje hiperpigmentacije.

Biljke su bile vrijedan izvor sredstava za izbjeljivanje kože, a tri od pet najčešće korištenih agenasa, kako medicinski tako i kozmetički, specijalizirani su metaboliti biljaka (tj. hidrokinon, -arbutin, aloezin). Do danas su fenolna jedinjenja uglavnom istražena kao potencijaltirozinazainhibitori, a oni uključuju flavonoide (npr. kvercetin [4]), stilbene (npr. resveratrol [1]), fenilpropanoide (npr. cinamaldehid [5] i eugenol [6]) i fenolne kiseline (npr. anisovu kiselinu i benzojeva kiselina [7]). Interes za forterpenoide je znatno manji i oni su relativno nedovoljno istraženi kao agensi protiv tirozinaze.

Citral je među ograničenim brojem proučavanih derivata terpenoida sa svojstvima antitirozinaze. To je mješavina dva izomera, cis- i trans-3,7-dimetil-2,6-oktadijenala (tj. neral i geranijal), za koje je dokazano da blokiraju in vitro enzimska aktivnost gljivatirozinaza[8]. Pored svog značaja kao mirisnog sastojka u napitcima, hrani i kozmetici, citral je pokazao obećavajuće in vitro biološke aktivnosti uključujući antigljivične, antibakterijske, antioksidativne i antiinflamatorne efekte [9–11]. Štaviše, nedavne studije su pokazale da je to bio slučaj. istaknuo je da citral ima potencijalno terapeutsko značenje kao relaksator glatkih mišića i lokalni anestetik, jer potiče opuštanje glatkih mišića traheje, maternice i aorte i inhibira ekscitabilnost živaca na životinjskim modelima [12-15].

Citral se dobija iz eteričnih ulja (EO) nekoliko botaničkih vrsta, uključujući Cymbopogon schoenanthus (L.) Spreng., Litsea cubeba (Lour.) Pers., Melissa officinalis L. i Verbena officinalis L. Prema najboljim autorima saznanja, samo je L. cubeba EO istražena zbog njegovogtirozinazainhibitorna aktivnost [16]. Stoga, ova studija ima za cilj procijeniti inhibitorne aktivnosti tirozinaze C. schoenanthus, L. cubeba, M. officinalis i V.officinalis EO, koristeći in vitro kolorimetrijski test, kako bi se procijenilo da li različiti hemijski sastavi utiču na ukupne aktivnosti EO inhibicije putem bilo kojeg moguće sinergističke, aditivne i/ili kompetitivne interakcije između njihovih komponenti. Ova studija koristi pristup frakcioniranja vođen abiotestom za sveobuhvatnu procjenu sastojaka EO i njihovih enantiomera, kada su hiralni, koji doprinose inhibitornoj aktivnosti EO protiv gljiva izvora tirozinaze, što je dobar modelni sistem za preliminarni skriningtirozinazainhibitori [17].

2. Rezultati i diskusija

2.1. Hemijski sastav i citralni sadržaj ispitivanog eteričnog ulja

U našem pokušaju da sveobuhvatno okarakterišemo sve potencijalne EO komponente koje doprinose razmatranoj biološkoj aktivnosti, ispitivani EO su analizirani GC, uz FID i MS detekciju. Utvrđene su normalizirane relativne procentualne zastupljenosti (izračunate iz apsolutnih površina normaliziranih na interni standard C13 korištenjem faktora odgovora [18,19]) svih otkrivenih spojeva i korišteni su za poređenje sastava EO. Slika 1 prikazuje GC-MS profil istraživanih EO analiziranih konvencionalnom kolonom. Tabela 1 navodi, za svaki ispitivani EO, jedinjenja koja su pokazala normalizirani postotak udjela iznad 0.1, dok su potpuni hemijski sastavi EO navedeni u Dodatnim materijalima (Tablice S1-S5).

Svi ispitivani EO su bogati neralom (cis{{0}},7-dimetil-2,6-oktadijenalom) i geranijalom (trans-3,{ {5}}dimetil-2,6-oktadijenal), koji su najzastupljenija jedinjenja. Tereralni/geranijalni odnos je bio vrlo sličan u svim istraživanim EO i odgovarao je 0.74 ± 0,05. C. schoenanthus i L. cubeba EO pokazuju najveći neral i geranijalni sadržaj, koji čini, u prosjeku, 60 posto njihovih cjelokupnih sastava EO, i koji je 1.5-put veći nego u V. officinalis EO i u tri EO M. officinalis (tj. Uzorak 1, 2 i 3). Dodatna jedinjenja sa kiseonikom koja su zajednička za sve EO su 6-metil-5-hepten-1-on, linalol i citronelal. Potonjeg je značajno više u M. officinalis EO 1 nego u drugim istraživanim EO, uključujući M. officinalis EO2 i 3.

Količina ugljovodonične frakcije značajno varira u različitim EO.M. officinalis EO 1 sadrži samo trans- -kariofilen i -humulen kao seskviterpeneugljovodonike, koji čine 2,7 posto i 0.13 posto ukupnog EO, respektivno. C.schoenanthus EO predstavlja nešto bogatiju ugljovodoničnu frakciju od M. officinalis EO 1 (tj. 7.0 posto), koji sadrži oba monoterpena (tj. kamfen, cis{{1{{20 }}}}ocimen, limonen, -pinen,trans- -ocimen, -thujene) i seskviterpeni (tj. trans- -kariofilen, -kadinen,δ-kadinen, germakren D, -elemen) u umjerenim količinama iznosi. U L. cubeba i V.officinalis EO, ugljikovodična frakcija čini 20 posto ukupnog EO, a limonen je najzastupljeniji spoj (tj. 15,0 odnosno 10,9 posto), a slijede -pinen, pinen , sabinen, trans- -kariofilen, -mircen, kamfen i -kopen. Konačno, M.officinalis EO 2 i 3 karakteriše najveći sadržaj ugljovodonične frakcije (38,8 procenata odnosno 31,8 procenata ukupnog EO). U oba uzorka frakcija ugljovodonika uglavnom sadrži seskviterpene, odnosno trans{33}}kariofilen (27,8 posto, odnosno 20,0 posto), i -humulen (3,0 posto i 2,6 posto), te smanjenu frakciju monoterpena koja je uglavnom karakterizirana limonenom ( 4,2 posto i 3,2 posto, respektivno).

Istražena su tri uzorka L. cubeba, V. officinalis i C. schoenanthus Eos proizvedena u različitim godinama, kao i tri uzorka EO M. officinalis različitih proizvođača. GC-MS analize C. schoenanthus, L. cubeba, M. officinalis i V. officinalis nisu otkrile značajne kvalitativne i kvantitativne razlike u hemijskom sastavu tri uzorka različitih godina proizvodnje. Ovo se može pripisati optimalnim uslovima skladištenja, tj. u posudi od ćilibarnog stakla na 4 ◦C u mraku sa zanemarljivim prostorom za glavu. S druge strane, GC-MS analize su pokazale značajne razlike u obilju citronela i trans{{4 }}kariofilen u tri ispitivana EO M. officinalis. Citronella je iznosila 19,6 posto, 0,26 posto i 0,31 posto u M. officinalis EO 1, 2 i 3, respektivno. Naprotiv, kao što je prethodno opisano, trans{14}}kariofilena je znatno više u M. officinalis EO 2 i 3 nego u M. officinalis EO 1. Ovi rezultati se slažu sa nalazima koje su objavili Seidler-Lozykawska et al., koji su istakli značajne razlike u zastupljenosti citrala, citronela i trans{19}}kariofilena u EO dobijenim od 22 odabrana genotipa M. officinalis porijeklom iz evropskih botaničkih vrtova [20].

Prava kvantitacija izvršena je eksternom standardnom kalibracijom kako bi se precizno procijenilo obilje potencijalnih bioaktivnih specijalizovanih jedinjenja (tj. neral, geranijal, limonen, -mircen i citronelal. Tabele 2 i 3 prikazuju dijagnostičke jone (m/z) koji se koriste za SIM- MS kvantitacija jedinjenja markera koja se istražuje zajedno sa opsegom kalibracije, jednadžbom kalibracione krive, vrednostima korelacije i standardnom greškom regresije svakog analita i rezultatima kvantitacije, respektivno.

2.2. In vitro inhibiciona aktivnost ispitivanih eteričnih ulja protiv tirozinaze gljiva

Kao što je prethodno opisano, EO C. schoenanthus, M. officinalis, L. cubeba i V.officinalis predstavljaju visoke nivoe citrala, koji karakteriše nekonkurentna inhibitorna aktivnost protiv gljivičnog izvora tirozinaze [8,16,21] . Ova studija je imala za cilj ispitivanje in vitrotirozinazainhibitorne aktivnosti ovih EO kako bi se istražilo može li se njihova inhibitorna aktivnost pripisati samo njihovom citralnom sadržaju, ili postoje li drugi bioaktivni spojevi koji utiču na inhibitorne efekte EO.

Mushroomtirozinazaje ovdje usvojen zbog svoje visoke homologije sa humantirozinazom, relativno niske cijene i gotove dostupnosti, što ga čini dobrim model sistemom za preliminarni skrining inhibitora tirozinaze [17]. Preciznost in vitrotirozinazatest inhibicije je procijenjen u smislu ponovljivosti (izvođenjem testa enzimske inhibicije pet puta u istom danu) i srednje preciznosti (ponavljanjem testa enzimske inhibicije pet puta svake četiri sedmice u periodu od šest mjeseci). U tabeli 4 prikazan je koeficijent varijacije (CV) za testove inhibicije koji su sprovedeni sa kojičnom kiselinom, koja je korišćena kao pozitivna kontrola, i sa L. cubeba EO. Rezultati su bili zadovoljavajući jer CV nikada nije prelazio 7 posto za ponovljivost i 10 posto za srednju preciznost. U tabeli 4 prikazan je koeficijent varijacije za testove inhibicije sprovedene sa kojiičnom kiselinom, korišćenom kao pozitivna kontrola, i sa L. cubeba EO. Slične vrijednosti preciznosti dobivene su za sve testirane EO.

Krivulja koncentracija citral-odgovor proučavana je crtanjem uočene inhibitorne aktivnosti kao funkcije njegove koncentracije u reakcionoj smjesi. Svi EO su testirani u koncentraciji od 166,7 µg/mL, što je, bez obzira na EO, rezultiralo citralnom koncentracijom unutar njegovog raspona linearnosti krive koncentracija-odgovor (y=0.3956x plus 1,8094,R{{7} }.9951, greška regresije: 2,08448, raspon linearnosti: 6,7–166,7 µg/mL) i nije izazvalo probleme rastvorljivosti u reakcionoj smeši.

Okvirni dijagram prikazan na slici 2 predstavlja procenat odtirozinazainhibicija za svaki EO. Za EO L. cubeba, V. officinalis i C. schoenanthus, rezultati prikazani na Slici 2 odgovaraju aktivnosti inhibicije tirozinaze gljiva EO od 2020, jer analiza varijanse nije otkrila statistički značajne razlike između EO različitih godine proizvodnje (p > 0,05). Što se tiče EO L. cubeba i C. schoenanthus, ovi rezultati se dobro slažu sa rezultatima dobijenim kvantitativnim GCMS analizama koje su otkrile skoro identičnu količinu citrala u EO različitih godina proizvodnje. Serija 2020. V. officinalis EO sadrži nešto veću citralnu količinu od serija 2019. i 2018. Međutim, prema krivulji citrala koncentracija-odgovor, višak citrala u seriji 2020. nije dovoljan da odredi statistički značajno veći postotak enzimske inhibicije s obzirom na greška povezana sa merenjima. Za dodatne detalje pogledajte sliku S1 u Dodatnom materijalu. S druge strane, analiza varijanse (ANOVA) praćena Tukey-Kramer post-hoctestom otkrila je da tri testirana EO M. officinalis, koje su obezbijedili različiti proizvođači, inhibiraju gljivetirozinazau različitoj mjeri, što će biti dalje opisano u sljedećim paragrafima. Najveće inhibitorne aktivnosti uočene su za EO L.cubeba, M. officinalis 1 i V. officinalis, koji su inhibirali 59 ± 6 procenata, 55 ± 7 procenata i 52 ± 6 procenatatirozinazaaktivnost, respektivno, kada se testira na koncentraciji od 166,7 µg/mL. Statistički značajne (p < 0.05)="" niže="" aktivnosti="" uočene="" su="" za="" eo="" c.="" schoenanthus="" i="" m.officinalis="" 2="" i="" 3="" čija="" je="" inhibitorna="" aktivnost="" enzima="" bila="" 42="" ±="" 5="" procenata,="" 40="" ±="" 5="" procenata="" i="" 38="" ±="" 6="" posto,="" respektivno.="" tabela="" 5="" daje="" koncentraciju="" inhibitora="" koja="" je="" prepolovila="" aktivnost="" enzima="" u="" datim="" eksperimentalnim="" uslovima="" (ic50)="" za="" svaki="" ispitivani="" inhibitor="" (tj.="" eo,="" pojedinačna="" jedinjenja="" i="" kojična="" kiselina).="" svi="" eo="" su="" efikasno="" inhibirali="" tirozinazu="" gljiva="" i="" pokazivali="" inhibitornu="" aktivnost="" koja="" je="" u="" prosjeku="" bila="" 100-puta="" niža="" od="" one="" kod="" kojicacida,="" koji="" je="" korišten="" kao="" pozitivna="">

2.3. Identifikacija dodatnih bioaktivnih komponenti, osim citrala, frakcioniranjem vođenim biološkim testom Histogram prikazan na slici 3 upoređuje postotak eksperimentalno izmjerenih enzimskih inhibicija sa vrijednostima koje bi se očekivale da su neral i geranial (smatrani kao zbir, tj. citral) samo aktivni spojevi u ispitivanim EO. Ove vrijednosti su izmjerene interpolacijom sa krive citralna koncentracija-odgovor. Kao što se može primijetiti, C. schoenanthus, M. officinalis 2 i M. officinalis 3 ispoljile su inhibitorne aktivnosti koje su bile u skladu sa njihovim sadržajem citrala, dok su L. cubeba, M. officinalis 1 i V. officinalis EO inhibirali gljive tirozinaze u većoj mjeri od očekivane. Bio-vođeni pristup je usvojen da se identifikuju dodatna jedinjenja koja doprinose citralnoj aktivnosti. Oksigenirane i ugljikovodične frakcije L. cubeba, M. officinalis 1 i V. officinalis EO izolovane su flash kromatografijom i pojedinačno testirane na njihovu gljivutirozinazainhibitorne aktivnosti. Frakcije su fitohemijski testirane na inhibiciju tirozinaze u gljivama. Fitohemijske frakcije su ispitane u istoj koncentraciji kao i njihova rezultujuća koncentracija kada se testira 166,7 µg/mL odgovarajućeg EO (pogledajte odjeljak Materijali i metode u odjeljku 3.2). Tabela 6 prikazuje koncentraciju nerala, geranijala, citronelala, limonena, i -mircen u oksigeniranim i ugljikovodičnim frakcijama frakcionisanih EO.

Što se tiče L. cubeba i V. officinalis EO, i oksigenirane i ugljikovodične frakcije inhibiraju tirozinazu gljiva, iako u različitoj mjeri. Aktivnosti teoksigeniranih frakcija (53 ± 3 posto i 44 ± 5, respektivno) čine većinu EOsanti-tirozinazapotencijal i bili su u skladu sa odgovarajućim sadržajem citrala, što sugeriše da jedinjenja koja doprinose citralnoj aktivnosti pripadaju frakcijama ugljovodonika. Ugljikovodične frakcije L. cubeba i V. officinalis EO imaju prilično sličan hemijski sastav. Limonen (68,4 odnosno 50,3 posto), trans{5}}kariofilen (12.0 i 7,8 posto, respektivno), -pinen (1,7 odnosno 7,5 posto), -pinen (2,5 i 12,9 posto, respektivno), sabinen (2,7 odnosno 3,8 posto), i -mircen (2,0 odnosno 2,4 posto, respektivno) su najzastupljenija jedinjenja u obje frakcije i prisutna su u prilično sličnim količinama, osim -pinen i -pinen, koji preovlađuju u frakciji ugljikovodika EO V. officinalis.

The chiral recognition revealed high enantiomeric purities in favor of the (-)-configured enantiomers for trans-β-caryophyllene (>99 posto u oba EO), limonen (97 i 94 posto u L. cubeba i V. officinalis EO, respektivno) i sabinen (87 posto u oba EO), dok su različiti enantiomerni ekscesi uočeni za -pinen ((-)- enantiomer: 38 posto u L. cubebaEO i 73 posto u V. officinalis EO) i -pinen ((-)-enantiomer: 67 posto u L. cubeba EO i 88 posto u V. officinalis EO). U oba EO, (-)-limonen čini više od 50 posto cjelokupne frakcije. Međutim, iako su prethodne studije izvijestile o inhibitornoj aktivnosti protiv tirozinaze gljiva zbog njene velike količine [22,23], (-)-limonen ovdje nije pokazao inhibitornu aktivnost tirozinaze. Slični rezultati su dobijeni za ( plus )-limonen, racemsku smjesu i jedinjenja (-)-trans- -kariofilen, (±)- -pinen i (±)- -pinen . Sabinene nije testiran jer je već dokazano da ima zanemarivu gljivutirozinazainhibitorni efekti [8]. U skladu s prethodnim nalazima [8], mircen je smanjio aktivnost tirozinaze gljiva. Kada je testiran pri koncentraciji uočenoj u 166,7 µg/mL L. cubeba i V. officinalis EO, aktivnost -mircena je premostila jaz između očekivanih inhibitornih efekata EO ako je citral bio jedini aktivni spoj i eksperimentalnih rezultata. Suprotno zapažanjima Matsuure et al. [8], -mircen se pokazao snažnijim inhibitorom tirozinaze gljiva od citrala, jer je njegov IC50 bio skoro deset puta niži (13,3 µg/mL naspram 121,8 µg/mL). Ova razlika se može pripisati različitim korišćenim supstratima; Matsuura et al. istraživali samo difenolaseaktivnost tirozinaze gljiva, jer su kao supstrat koristili L-DOPA, dok je u ovoj studiji korišten L-tirozin. Trenutni nalazi ukazuju na to da -mircen može biti efikasniji u inhibiciji aktivnosti tirozinaze monofenolaze gljiva nego difenolaze.

M. officinalis EO 1 pokazuje malu frakciju ugljovodonika koja čini manje od 3 procenta ukupnog broja i nema inhibitornu aktivnost tirozinaze. Međutim, oksigenirana frakcija M. officinalisEO 1 inhibirala je tirozinazu gljive u većoj mjeri nego što bi se očekivalo na osnovu njenog citralnog sadržaja (Slika 3). Ova frakcija sadrži značajne količine citronelala pored nerala i geranijala, a kiralna analiza je otkrila visoku enantiomernu čistoću citronelala u korist (plus) enantiomera (98,3 posto). Kada se testira nezavisno, u koncentraciji od 166,7 µg/mL, (plus )-citronelal inhibira gljivatirozinazu u zanemarljivoj meri, iako je njena aktivnost značajno povećana kada je testirana u kombinaciji sa citralom. Ovi rezultati mogu objasniti razlike uočene u procentima gljivatirozinazainhibicija u različitim M. officinalis EO. M. officinalis EO 2 i 3 imaju vrlo nizak sadržaj citronela, što može biti razlog zašto su njihove inhibitorne aktivnosti znatno niže od M. officinalis EO 1.

3. Materijali i metode

3.1. Reagensi

Dimetil sulfoksid (DMSO), tirozinaza pečuraka iz Agaricus bisporus (JE Lange)Imbach, L-tirozin, kojična kiselina, citral, citronelal, -mircen, ( plus )-limonen, (-)-limonen,(±)-limonen, ( ±)- , i pinen su kupljeni od Merck Life Science Srl (Milano, Italija). Litsea cubeba, Verbena officinalis i Cymbopogon schoenanthus EO su isporučene od strane Erboristeria Magentina Srl (Poirino, Italija). Za svaku su testirane tri serije različitih godina (tj. 2020, 2019, 2018). Istražena su tri uzorka Melissa officinalis EO; jedan je obezbijedila Agronatura (Spigno Monferrato, Alessandria), jedan od ErboristeriaMagentina Srl, dok je posljednji kupljen u lokalnoj trgovini i bio je od SpecchiasolS.rl (Bussolengo, Italija). U tekstu, autori navode različite EO Melissaofficinalis kao M. officinalis EO 1, 2 i 3, respektivno. Dostavljeni EO su dobijeni slijedeći procedure opisane u Evropskoj farmakopeji [24]. Melissa officinalis i Verbena officinalis EO proizvedeni su hidrodestilacijom iz listova i nadzemnih dijelova biljaka; Slično, Litsea cubeba i Cymbopogon schoenanthus EO su dobijeni parnom destilacijom svježeg voća, odnosno svježih nadzemnih dijelova. Svaki EO je pojedinačno analiziran pomoću GC-MS čim ga je kupio/dostavio odgovarajući proizvođač, svake godine skladištenja i neposredno prije proučavanja njegove inhibitorne aktivnosti gljiva tirozinaze.

3.2. In vitro test inhibicije tirozinaze

Thetirozinazainhibitorne aktivnosti EO i izolovanih jedinjenja ispitane su in vitro korišćenjem enzimskog testa zasnovanog na kolorimetrijskom očitavanju optimizovanog od strane Zengh et al. [25], sa malim modifikacijama. Inhibiciona aktivnost EO-a na tirozinazu, kao i njihove odgovarajuće ugljovodonične i oksigenirane frakcije i čista jedinjenja istražena su in vitro primjenom enzimskog testa zasnovanog na kolorimetrijskom očitavanju koji su optimizirali Zengh et al. [25], uz male modifikacije: test je izveden na sobnoj temperaturi itirozinazainhibicija je mjerena uzimajući u obzir kontrolu i apsorpciju uzorka nakon 6 minuta inkubacije, a ne nakon 20 minuta, tako da djeluje pod linearnim dijelom enzimske reakcije, što daje preciznije rezultate inhibicije [26,27]. Gljiva tirozinaza iz Agaricus bisporus (JE Lange) Imbach je odabrana za ovo istraživanje. L-Tirozin je korišćen kao supstrat, što znači da je ispitana ukupna inhibitorna aktivnost tirozinaze bez razlikovanja između aktivnosti tirozinaze monofenolaze i difenolaze. Fotometrijska merenja na 475 nm su izvršena na Thermo spectronic Genesys6, a kojična kiselina je korišćena kao inhibitor pozitivne kontrole. Rastvori ispitivanih potencijalnih inhibitora (EO, izolovane frakcije EO, pojedinačna jedinjenja EO i kojikacid) pripremljeni su u DMSO. Tabela 7 prikazuje testirane koncentracije za svaki ispitivani potencijalni inhibitor. Pečurkatirozinazarastvor 200 U/mL (27,9 µg/mL) je pripremljen u natrijum-fosfatnom puferu (pH 6,8) i alikvoti od 9 mL su pohranjeni na -18 ◦C i odmrznuti neposredno pre eksperimenata. Rastvor tirozina 0.1 mg/mL je pripremljen u natrijum-fosfatnom puferu (pH 6,8) i obnavljan svakodnevno. Komponente reakcione smeše su stavljene u bočicu sledećim redosledom: 1 mL rastvora tirozine pečurke 200 U/mL; 1 mL puferske otopine natrijum fosfata; 10 µL rastvora EO/jednostrukog spoja/kojične kiseline; i na kraju 1 mL rastvora tirozina 0,1 mg/mL. Konačni procenat DMSO u reakcionoj smeši bio je 0,3 procenta. Test je izveden u zatvorenoj bočici od 4 mL kako bi se izbjegao gubitak bilo koje komponente EO u okolno okruženje i da bi se minimiziralo njihovo oslobađanje u prostor glave iznad reakcione smjese. Reakciona smjesa je inkubirana u termostatskom vodenom kupatilu na 25 ◦C 6 min. Nakon toga, registrovana je apsorpcija na 475 nm, jer ova talasna dužina omogućava identifikaciju dopahroma. Apsorbancija koja odgovara 100 posto aktivnosti tirozinaze izmjerena je zamjenom otopine EO/pojedinačnog jedinjenja/kojične kiseline sa 10 µL čistog DMSO. Prazni rastvori su pripremljeni na sljedeći način: 2 mL puferske otopine natrijum fosfata, 10 µL EO/pojedinac /kojična kiselina/DMSO rastvor i 1 mL rastvora tirozina 0,1 mg/mL. Postotak inhibicije tirozinaze mjeren je prema donjoj jednačini: postotak inhibicije=∆A (kontrola) − ∆A (uzorak) / ∆A (kontrola) × 100, ∆A (kontrola) ili (uzorak) {{ 33}} A475 (Kontrola) ili (Uzorak) − A475 (Kontrola Prazan) ili (Uzorak Prazan).

3.3. Flash kolonska hromatografija

EO frakcionisanje je izvedeno na sistemu fleš kolonske hromatografije PuriFlash450 kompanije Sepachrom (Rho, Milano, Italija), opremljenom sa UV i ELSD detektorima. Količina frakcionisanog EO: 900,0 mg. Stacionarna faza: sferične čestice silika gela, 50 µm, 25 mg (Purezza®-Sphera Cartridge Stacionary) je iz Sepachroma; mobilna faza: petroeter (A) i etil acetat (B); protok 25 mL/min. Linearni gradijent eluiranja je usvojen od 100 posto A do 80 posto A i 20 posto B tokom 20 minuta.

3.4. Uslovi analize

Rastvori EOs i oni njihovih odgovarajućih frakcija pripremljeni su u cikloheksanu u koncentraciji od 50 mg/mL i analizirani GC-MS. Citral, citronelal, -mircen i limonen su kvantificirani u svakom EO i odgovarajućim izoliranim frakcijama korištenjem metode eksterne standardne kalibracije. Odgovarajući nivoi kalibracije su pripremljeni incikloheksanom i analizirani GC-MS. Tridekan (C13) 1.0 mg/mL je korišten kao interni standard za normalizaciju signala analita. Tabela 2 sumira razmatrani raspon koncentracija za svako kvantificirano jedinjenje.

GC-MS analize su provedene korištenjem višenamjenskog uzorkivača Gerstel MPS-2 (Mülheim an der Ruhr, Njemačka) instaliranog na Agilent 6890 N GC spojenom na 5975 MSD i opremljen ChemStation verzijom E. 02.02.1431 sistem za obradu podataka (AgilentTechnologies, Santa Clara, CA, SAD). Uslovi GC: temperatura injektora: 250 ◦C; način ubrizgavanja: split; odnos: 1/20; gas nosač: helijum; konstantan protok: 1 mL/min; kolone: ​​Mega5 (95 posto polidimetilsiloksan, 5 posto fenil) df 0,25 µm, dc 0,25 mm, dužina 25 m, iz MEGA (Legnano, Italija). Temperaturni program: 50 ◦C//3 ◦C/min//180 ◦C//10 ◦C/min//250 ◦C (5 min). MSD uslovi: MS radi u EI modu (70 eV); opseg skeniranja: 35 do 350 amu; vrijeme zadržavanja 40 ms; temperatura izvora jona: 230 ◦C; temperatura kvadrupola: 150 ◦C; temperatura prenosnog voda: 280 ◦C. EO markeri su identificirani upoređivanjem njihovih indeksa linearne retencije (IT), izračunatih u odnosu na smjesu ugljovodonika C9-C25, i njihovih masenih spektra ili sa onima autentičnih uzoraka, ili iz komercijalno dostupnih biblioteka masenog spektra (Adams, 2007). EO kiralne analize su obavljene usvajanjem istih uslova analize na 2,3-di-O-metil-6-Ot-butildimetilsilil- -CD (2,3DM6TBDMS -CD) df 0,25 µm, dc 0,25 mm, dužina 25 m od MEGA. Temperaturni programi: 40 ◦C (1 min)//2 ◦C/min//220 ◦C (5 min).

GC-FID analize su rađene na istom instrumentu. Uslovi GC: temperatura injektora: 250 ◦C; način ubrizgavanja: split; odnos: 1/20; gas nosač: vodonik; brzina protoka: 1 mL/min. Temperaturni programi: 40 ◦C (1 min)//2 ◦C/min//220 ◦C (5 min).

4. Zaključak

Svrha ovog istraživanja bila je (1) da se sveobuhvatno ispita in vitrogljivatirozinazainhibitorne aktivnosti Cymbopogon schoenanthus, Litsea cubeba, Melissa officinalis i Verbena officinalis EO i (2) da se utvrdi da li se njihova biološka aktivnost pripisuje samo njihovom citralnom sadržaju ili postoje dodatni bioaktivni monoterpeni koji doprinose ispitivanoj biološkoj aktivnosti upotrebom pristup frakcioniranju vođen biotestom. Ova studija je identifikovala da u L. cubeba i V. officinalis EO, -mircen doprinosi inhibicijskim aktivnostima EO uprkos svojoj maloj količini i pokazalo se da ima veću inhibitornu moć na citral. Drugi veliki nalaz bio je da ( plus )-citronela poboljšana citralna gljivatirozinazainhibitorna moć, potencijalno preko sinergističke interakcije jer nije pokazivala nikakvu aktivnost sama po sebi. Potonji nalaz objašnjava zašto su kod M. officinalis EO koje sadrže zanemarljive (plus)-citronelalne količine, inhibitorne aktivnosti bile u skladu s njihovim sadržajem citrala, dok je suprotno bilo istinito za M. officinalis EO sa relativno visokim (plus)-citronelanim obiljem. iako su daljnje studije još uvijek potrebne da bi se precizno definirale vrste interakcija koje se javljaju između -mircena i citrala i između citronelala i citrala, te da bi se procijenile inhibitorne aktivnosti ovih EO i pojedinačnih jedinjenja na ljudetirozinaza, rezultati ove studije mogu pomoći da se racionalno dizajniraju mješavine EO ili obogaćenih EO koje poboljšavaju njihovu biološku efikasnost i povećavaju njihov potencijal kao pomoćnih sredstava u liječenju hiperpigmentacije.

Reference

1. Pillaiyar, T.; Manickam, M.; Namasivayam, V. Sredstva za izbjeljivanje kože: perspektiva medicinske hemije inhibitora tirozinaze.J. Enzim. Inhib. Med. Chem. 2017, 32, 403–425. [CrossRef]

2. Desmedt, B.; Courselle, P.; De Beer, JO; Rogiers, V.; Grosber, M.; Deconinck, E.; De Paepe, K. Pregled sredstava za izbjeljivanje kože s uvidom u ilegalno kozmetičko tržište u Europi. J. Eur. Akad. Dermatol. Venereol. 2016, 30, 943–950. [CrossRef] [PubMed]

3. Desmedt, B.; Van Hoeck, E.; Rogiers, V.; Courselle, P.; De Beer, JO; De Paepe, K.; Deconinck, E. Karakterizacija sumnjive ilegalne kozmetike za izbjeljivanje kože. J. Pharm. Biomed. Anal. 2014, 90, 85–91. [CrossRef] [PubMed]

4. Kubo, I.; Ikuyo, KH Flavonoli iz cvijeta šafrana: inhibitorna aktivnost tirozinaze i mehanizam inhibicije. J. Agric. Food Chem.1999, 47, 4121–4125. [CrossRef]

5. Chang, C.-TT; Chang, W.-LL; Hsu, J.-CC; Shih, Y.; Chou, S.-TT Hemijski sastav i inhibitorna aktivnost tirozinaze eteričnog ulja Cinnamomum cassia. Bot. Stud. 2013, 54, 2–8. [CrossRef]

6. Garcia-Molina, MDM; Muñoz-Muñoz, JL; Garcia-Molina, F.; García-Ruiz, PA; Garcia-Canovas, F. Djelovanje tirozinazom onortosupstituiranih fenola: Mogući utjecaj na smeđe boje i melanogenezu. J. Agric. Food Chem. 2012, 60, 6447–6453. [CrossRef]

7. Kubo, I.; Kinst-Hori, I. Inhibitori tirozinaze iz kumina. J. Agric. Food Chem. 1998, 46, 5338–5341. [CrossRef]

8. Matsuura, R.; Ukeda, H.; Sawamura, M. Tirozinaza inhibitorna aktivnost eteričnih ulja citrusa. J. Agric. Food Chem. 2006, 54, 2309–2313. [CrossRef]

9. Lertsatitthanakorn, P.; Taweechaisupapong, S.; Aromdee, C.; Khunkitti, W. In vitro bioaktivnost eteričnih ulja koja se koriste za kontrolu akni. Int. J. Aromather. 2006, 16, 43–49. [CrossRef]

10. Bouzenna, H.; Hfaiedh, N.; Giroux-Metges, M.-A.; Elfeki, A.; Talarmin, H. Biološka svojstva citrala i njegovi potencijalni zaštitni efekti protiv citotoksičnosti uzrokovane aspirinom u IEC-6 ćelijama. Biomed. Pharmacother. 2017, 87, 653–660. [CrossRef]

11. Lee, HJ; Jeong, HS; Kim, DJ; Ne, YH; Yuk, DY; Hong, JT Inhibicijski efekat citrala na proizvodnju NO supresijom ekspresije iNOS i aktivacijom NF-κB u ćelijama RAW264.7. Arch. Pharm. Res. 2008, 31, 342–349. [CrossRef]

12. Carvalho, PMM; Macêdo, CAF; Ribeiro, TF; Silva, AA; Da Silva, RER; de Morais, LP; Kerntopf, MR; Menezes, IRA; Barbosa, R. Efekat esencijalnog ulja Lippia alba (Mill.) NE smeđe boje i njegovih glavnih sastojaka, citral i limonena, na glatke mišiće traheje pacova. Biotechnol. Rep. 2018, 17, 31–34. [CrossRef] [PubMed]

13. Pereira-de-Morais, L.; Silva, AdA; da Silva, RER; Costa, RHSd; Monteiro, Á.B.; Barbosa, CRdS; Amorim, TdS; deMenezes, IRA; Kerntopf, MR; Barbosa, R. Tokolitička aktivnost eteričnog ulja Lippia alba i njegovih glavnih sastojaka, citrala i limonena, na izoliranoj maternici pacova. Chem. Biol. Interakcija. 2019, 297, 155–159. [CrossRef]

14. Da Silva, RER; de Morais, LP; Silva, AA; Bastos, CMS; Pereira-Gonçalves, Á.; Kerntopf, MR; Menezes, IRA; Leal-Cardoso, JH; Barbosa, R. Vasorelaksantno djelovanje eteričnog ulja Lippia alba i njegovog glavnog sastojka, citral, na kontraktilnost izolirane aorte. Biomed. Pharmacother. 2018, 108, 792–798. [CrossRef] [PubMed]

15. Sousa, DG; Sousa, SDG; Silva, RER; Silva-Alves, KS; Ferreira-da-Silva, FW; Kerntopf, MR; Menezes, IRA; Leal-Cardoso, JH; Barbosa, R. Eterično ulje Lippia alba i njegov glavni sastojak citral blokiraju ekscitabilnost išijadičnog živca štakora. Braz. J. Med.Biol. Res. 2015, 48, 697–702. [CrossRef] [PubMed]

16. Huang, X.-W.; Feng, Y.-C.; Huang, Y.; Li, H.-L. Potencijalna kozmetička primjena eteričnog ulja ekstrahiranog iz plodova Litsea cubeba iz Kine. J. Essent. Oil Res. 2013, 25, 112–119. [CrossRef]

17. Zolghadri, S.; Bahrami, A.; Hassan Khan, MT; Munoz-Munoz, J.; Garcia-Molina, F.; Garcia-Canovas, F.; Saboury, AA Sveobuhvatan pregled inhibitora tirozinaze. J. Enzym. Inhib. Med. Chem. 2019, 34, 279–309. [CrossRef]

18. Bicchi, C.; Liberto, E.; Matteodo, M.; Sgorbini, B.; Mondello, L.; Zellner, Bd; Costa, R.; Rubiolo, P. Kvantitativna analiza eteričnih ulja: složen zadatak. Flavor Fragr. J. 2008, 23, 382–391. [CrossRef]

19. Rubiolo, P.; Sgorbini, B.; Liberto, E.; Cordero, C.; Bicchi, C. Eterična ulja i hlapljive tvari: Priprema i analiza uzoraka. A review.Flavour Fragr. J. 2010, 25, 282–290. [CrossRef]

20. Seidler-Łozykowska, K.; Bocianowski, J.; Król, D. Procjena varijabilnosti morfoloških i kemijskih osobina ovih odabranih genotipova matičnjaka (Melissa officinalis L.). Ind. Crops Prod. 2013, 49, 515–520. [CrossRef]

21. Kubo, I.; Kinst-Hori, I. Tirozinaza inhibitorna aktivnost jedinjenja arome maslinovog ulja. J. Agric. Food Chem. 1999, 47, 4574–4578.[CrossRef] [PubMed]

22. Fiocco, D.; Arciuli, M.; Arena, MP; Benvenuti, S.; Gallone, A. Hemijski sastav i antimelanogeni potencijal različitih eteričnih ulja. Flavor Fragr. J. 2016, 31, 255–261. [CrossRef]

23. Hu, JJ; Li, X.; Liu, XH; Zhang, WP Inhibicijski učinak eteričnog ulja limuna na aktivnost tirozinaze gljiva in vitro. Mod. FoodSci. Technol. 2015, 31, 97–105. [CrossRef]

24. Vijeće Evrope. Evropska farmakopeja, 10. izdanje; Vijeće Evrope: Strazburg, Francuska, 2020; ISBN 978-92-871-8921-9.

25. Zheng, ZP; Tan, HY; Chen, J.; Wang, M. Karakterizacija inhibitora tirozinaze u grančicama Cudrania tricuspidata i studija odnosa njihove strukture i aktivnosti. Fitoterapia 2013, 84, 242–247. [CrossRef] [PubMed]

26. Williams, KP; Scott, JE Dizajn enzimskog testa za skrining visoke propusnosti. U skriningu visoke propusnosti. Metode u molekularnoj biologiji (Metode i protokoli); Janzen, WP, Paul, B., ur.; Humana Press: Clifton, NJ, SAD, 2009; Sveska 565, str. 107–126.

27. Brooks, HB; Geeganage, S.; Kahl, SD; Montrose, C.; Sittampalam, S.; Smith, MC; Weidner, JR Osnove enzimskih testova za HTS. In Assay Guidance Manual; Markossian, S., Sittampalam, S., Grossman, A., Eds.; Eli Lilly & Company i Nacionalni centar za unapređenje translacionih nauka: Bethesda, MD, SAD, 2004.