Cistanche Tubulosa štiti dopaminergičke neurone kroz regulaciju apoptoze i neurotrofnog faktora koji potiče od glijalnih ćelija: in vivo i in vitro-Ⅰ

UVOD

Parkinsonova bolest (PD) je uobičajena neurodegenerativna bolest koja se javlja kod starijih osoba s patološkim manifestacijama gubitka dopaminergičkih neurona u supstanciji nigra (SN) uslijed degeneracije. Ozbiljnost bolesti je u korelaciji s gubitkom neuronskih ćelija dopamina (DA) u SN, što je u skladu sa stavom da neurodegenerativni proces napreduje mnogo godina prije nego što se pojave bilo kakvi simptomi (Sawle i Myers, 1993). Progresivna priroda bolesti sugerira zanimljive mogućnosti za terapijsku intervenciju blokiranjem osnovnog neurodegenerativnog procesa. Potraga za terapijskim indukovanim snažnim i specifičnim djelovanjem neurotrofnih faktora na preživljavanje DA neurona je stoga od velikog interesa.

PRIRODNI CISTANCHE TUBULOSA ZA ZAŠTITU DOPAMINERGIJSKIH NEURONA PHGS75% ECH 30% ACT 12%

Neurotrofni faktori su esencijalni proteini, uključujući faktor rasta nerava (NGF), neurotrofni faktor koji potiče iz mozga (BDNF) i neurotrofni faktor izveden iz glijalnih ćelija (GDNF), koji potiču rast nerava, neurološki razvoj, aksonsko vođenje i funkciju neurona. Među svim neurotrofnim faktorima koji štite i pospješuju popravak dopaminergičkih neurona, GDNF ima najjače djelovanje (Hong et al., 2008; Rangasamy et al., 2010; Allen et al., 2013). Pokazalo se da GDNF posjeduje moćne neurotrofne efekte na DA neurone in vitro (Lin et al., 1993) i da ispoljava neuroprotektivne efekte in vivo. Pokazalo se da GDNF spašava nigralne DA neurone od ćelijske smrti uzrokovane lezijom nakon hirurške ili toksinom izazvane aksotomije kod pacova (Beck et al., 1995.; Kearns i Gash, 1995.; Sauer et al., 1995.) i djelomično nakon sistemska administracijaN-metil-4-fenil-1,2,3,6-tetrahidropiridin (MPTP)kod miševa (Tomac et al., 1995). Povećana incidencija neuronske apoptoze i smanjeni zaštitni efekti neurotrofnih faktora, potencijalno izazvani različitim patološkim faktorima, leže u osnovi degeneracije dopaminergičkih neurona (Holden et al., 2006).

C. tubulosa je biljni lijek koji potiče od nekoliko biljaka iz roda Cistanche. To je glavna terapijska opcija za sindrom nedostatka bubrega koji je usko povezan s androgenim hormonima u tradicionalnoj kineskoj medicini (TCM). Do danas su mnoga klinička i osnovna istraživanja o C. tubulosa pokazala djelovanje neurodegenerativnih bolesti. Identifikacija TCM recepata koji toniziraju bubrege u liječenju PD može stoga pružiti alternativni klinički tretman za PD.ehinakozid (ECH)je glavna bioaktivna komponenta koja se nalazi u ljekovitoj biljci C. tubulosa. Studije su pokazale terapeutske efekte glikozida Cistanche i ECH,verbascoside(VER) i icariin (ICA) na Alchajmerovu bolest (AD), PD i druge pacijente sa vaskularnom demencijom (Urano i Tohda, 2010; Wang et al., 2013; Wu et al., 2014). Wu et al. (2014) sugerirali su da ekstrakti C. tubulosa koji sadrže dovoljno ECH i akteozida poboljšavaju kognitivnu disfunkciju uzrokovanu A -42 putem blokiranja taloženja amiloida i preokretanja holinergičke i hipokampalne dopaminergičke neuronske funkcije. Tao et al. (2015) su to otkrilifeniletanoidni glikozidiiz C. tubulosa (Ph Gs-Ct) spriječio je cerebralni edem na velikoj nadmorskoj visini smanjenjem ekspresije proteina i mRNA AQP4 u moždanom tkivu modela pacova.

PRIRODNI CISTANCHE TUBULOSA EKSTRAKT GRINACI POBOLJŠAVAJU PAMĆENJE PHGS75% ECH 30% ACT 12%

Prethodne studije su pokazale da kineska biljna jedinjenja, uključujući tri sastojka C. tubulosa, epimedium i rhizoma polygonati, ublažavaju oštećenje dopaminergičkih neurona i povećavaju nivoe dopamina regulacijom ekspresije neurotrofnih faktora (Wu et al., 2013). Stoga, još nije poznato da li su neuroprotektivni efekti izazvani C. tubulosa dugotrajni i u kojoj mjeri spašavanje nigralnih DA neurona primjenom GDNF-a može priuštiti značajno očuvanje motoričkog ponašanja od značaja za simptomatologiju PD životinja. Ova studija je koristila TCM recept za toniranje bubrega, C. tubulosa nanopowder, koji je dobio nacionalni patent (broj patenta: 2011103028541) u Kini i koji je ranije pokazao određeni terapeutski učinak u PD. Ova studija je, stoga, osmišljena da ispita neuroprotektivne i regenerativne efekte tretmana C. tubulosa i da istraži apoptozu na MES23.5 ćelijama i bihevioralnim definitivnim štakorima, te regulaciju GDNF-a, mjerenu nizom ciljnih testova. .

MATERIJALI I METODE

Materijali, reagensi i oprema

C. tubulosa je kupljen od Beijing Tong Ren Tang Group, Co., Ltd., Peking, Kina. ECH, VER i ICA dolaze iz Nacionalnog instituta za kontrolu hrane i lijekova, Kina. MES23.5 dopaminergička neuronska ćelijska linija je poklon profesora Biao Chena, Laboratorije za neurobiologiju, Capital Medical University, Peking, Kina. Pedeset muških miševa C57BL/6 (težine 20-25 g svaki) kupljeno je od Shanghai SLAC Laboratory Animal Co., Ltd. (broj licence: SCXK2012-0002), Šangaj, Kina.

MPP+, MTT i glutamin su kupljeni od Sigma-Aldrich (Carlsbad, CA, USA); DMEM/F12 medijum i fetalni goveđi serum kupljeni su od Gibco Co. (Life Technologies, Carlsbad, Kalifornija, SAD); i MPTP, DA standard i standard homovanilne kiseline (HVA) kupljeni su od Sigma-Aldrich (Carlsbad, CA, USA). -aktin, Bax, Bcl2, GDNF, GDNF familija receptora alfa (GFR 1) i Ret antitela su kupljena od Cell Signaling Technology, Inc. (Beverly, MA, SAD); 3,3'-diaminobenzidin (DAB) komplet reagensa za bojenje kupljen je od Fuzhou Maixin Biotech., Ltd. (Fujian, Kina); i SDS-PAGE komplet za pripremu uzoraka gela, komplet za detekciju ultraosjetljive poboljšane hemiluminiscencije (ECL) i test bicinhoninske kiseline (BCA) kupljeni su od Beyotime Institute of Biotechnology (Peking, Kina).

U ovoj studiji korišteni su sljedeći instrumenti: ELX800 čitač mikroploča (Bio Tek Winooski, VT, SAD); CO2 inkubator (Heraeus, Hanau, Njemačka); Gel DOC 2000 sistem za analizu gela, ćelija za elektroforezu i rezervoar za elektroforezu (Bio-Rad, Hercules, Kalifornija, SAD); DU-650 analizator proteina (Beckman Coulter, Inc., Fullerton, CA, SAD); 5417R brza rashladna centrifuga (Eppendorf, Hamburg, Njemačka); SXQM dvostruki planetarni kuglični mlin (Changsha, Tencan Powder Technology Co., Ltd, Hunan, Kina); Mlin za miješanje MM400 (Retsch GmbH, Haan, Njemačka); Agilent 1200 tečna hromatografija visokih performansi (HPLC; Agilent Technologies, Santa Clara, Kalifornija, SAD); PowerPac Basic elektroforeza, PowerPac Basic transmembranski transfer sistem, Universal Hood II hemiluminiscencijski snimač, S1000 Thermal Cycler RNA sistem reverzne transkripcije (Bio-Rad); Motic Med 6.0 sistem za analizu slike tkiva i ćelija (Motic China Group, Co., Ltd, Xiamen, Kina).

Priprema odC. tubulosaNanoprah

C. tubulosa je izvagana, zatim pročišćena i dehidrirana. Nakon konvencionalnog usitnjavanja, fini prah C. tubulosa je propušten kroz 200-mrežasto sito i osušen zamrzavanjem. Za pripremu nanopraha C. tubulosa korišteni su vakuumski i visokoenergetski mlin s kontroliranom temperaturom. Prvo, sirovi nanoprašak C. tubulosa stavljen je u vakuumski rezervoar za mlevenje koji je bio napunjen karbidnim kuglicama za mlevenje. Omjer između kuglica za mljevenje i nanopraha C. tubulosa kretao se od 15:1 do 5:1. Da bi se dobio fini prah, brzina i trajanje visokoenergetskog loptastog mlina su postavljeni na 300 o/min, odnosno 20 min. Fini prah je vagan za obradu nanomaterijala i obrađen u mikserskom mlinu sa frekvencijom od 25/s i oscilacijom od 20s u tri ponavljanja. PBS je korišten za otapanje i pripremu osnovnog rastvora od 25 mg/mL, nakon čega je uslijedilo 30 min ultrazvučne obrade, autoklaviranja i konačno skladištenja na -20°C.

Kontrola kvaliteta aktivnih komponentiC. tubulosapomoću HPLC

ECH i VER sadržavali su gradijent eluiranja sa silicijum-dioksidom vezanim za oktadecilsilan kao punilom, metanolom kao mobilnom fazom A i 0.1% rastvorom mravlje kiseline kao mobilnom fazom B. Talasna dužina detekcije bila je 330 nm. ICA je sadržavala gradijent eluiranja sa oktadecilsilanom vezanim silicijum dioksidom kao punilom i acetonitril-voda (30:70) kao mobilnu fazu. Talasna dužina detekcije bila je 270 nm. Uzorak, kontrola i negativna kontrola su izmjereni kao 10 µL svaki za test.

Ćelijska kultura i MTT test za mjerenje održivosti MPP+-Tretirane ćelije

MES23.5 ćelije su inokulirane sa 5% fetalnog telećeg seruma, 1% glutamina, 2% 50× Sato-ovog rastvora i DMEM/F12 medijumom sa 2% penicilina/streptomicina. Inkubirani su na 37◦C u inkubatoru sa 5% CO2 sa zasićenom vlagom. Ćelije su izolovane i pasirane sa 0,25% tripsina, a ćelijska suspenzija je sakupljena u logaritamskoj fazi rasta. Izolirane ćelije gustine 1 × 105 zasijane su u ploče obložene polilizinom 96-jažice, nakon čega je uslijedilo dodavanje različitih konačnih koncentracija (6,25, 12,5, 25, 50, 100, 200, 400 i 800 µmol/L ) MPP+ medija. MES23.5 ćelije koje su inkubirane sa normalnom podlogom za kulturu 24 h i 48 h korišćene su kao negativne kontrole u in vitro eksperimentima. Ćelije iz različitih tretiranih grupa su inkubirane sa MTT reagensom 4 h. Rastvor u jamicama je zatim odbačen i dodano je 150 µL DMSO i oscilirano 10 min. Apsorbancija svakog uzorka na talasnoj dužini od 570 nm izmjerena je pomoću automatskog čitača mikroploče. Procenat vitalnosti ćelije (%)=srednja apsorpcija eksperimentalne grupe/srednja apsorpcija negativne kontrolne grupe × 100%.

Relevantne koncentracije MPP+ medijuma dodane su za 24-satni tretman u ćelijama MES23.5 koristeći isti pristup kao za in vitro kulturu. Nakon tretmana, rastvor iz bunara je odbačen. Podloga koja sadrži različite koncentracije (10, 50, 100, 200, 250, 500 i 1000 µg/mL) nanopraha C. tubulosa dodana je ćelijama MES23.5 u različitim jažicama i ostavljena da se inkubira 24 h i 48 h. Ćelije MES23.5 koje su inkubirane sa normalnom podlogom za kulturu 24 h i 48 h korišćene su kao negativne kontrole. MES23.5 ćelije koje su inkubirane sa MPP+ medijumom korišćene su kao nosač. Mjerenja su obavljena u tri primjerka za svaki uzorak. Apsorbancija odgovarajućih tretiranih i kontrolnih grupa je izmjerena da bi se izračunala vitalnost ćelija.

PRIRODNI CISTANCHE TUBULOSA EKSTRAKT ANTI UMORA PHGS75% ECH 30% ACT 12%

Ekspresija TH mjerena imunocitohemijom

Kada je nanoprašak C. tubulosa bio u 100, 200 i 250 µg/ml, stopa preživljavanja ćelija se značajno povećala (Slika 2G). Stoga smo u narednim eksperimentima testirali tri koncentracije: grupe sa niskom dozom, srednjom dozom i visokim dozama. Tri replikacije su testirane za svaku od grupa C. tubulosa. Sterilizovana, polilizinom obložena pokrivna stakla su stavljena u 6-ploče sa bunarima. Zatim je 5 × 104 ćelije zasejano u svaku jažicu i inkubirano 24 h. Konvencionalna svježa podloga je zamijenjena u normalnoj kontrolnoj grupi, a konačna koncentracija od 100 µmol/L MPP+ medijuma je zamijenjena u preostalim tretiranim grupama kako bi se inkubirala 24 h. Konvencionalne svježe podloge su zatim zamijenjene normalnom kontrolnom i vehikulumom, a konačne koncentracije od 100, 200 i 250 µg/mL nanopraha C. tubulosa su inkubirane sa ćelijama 24 sata u niskim, umjerenim i visokim dozama. C. tubulosa tretirane grupe, respektivno. MES23.5 ćelije u različitim grupama su isprane tri puta u PBS-u da bi se uklonio supernatant i dalje fiksirane u 4% paraformaldehidu tokom 15 minuta. Nakon ispiranja sa PBS, ćelije su inkubirane sa blokatorom peroksidaze na 37°C tokom 30 min, a zatim ponovo isprane sa PBS. Za permeabilizaciju ćelija korištena je 0,2% otopina Triton X-100 u trajanju od 10 minuta, nakon čega je slijedilo ispiranje sa PBS. U svaki uzorak je dodat normalan kozji serum i inkubiran na sobnoj temperaturi 30 minuta. Normalni kozji serum je zatim uklonjen i primarno antitelo razblaženo 1:400 u PBS je dodato svakom uzorku i inkubirano na 4◦C preko noći. Ćelije u negativnoj kontrolnoj grupi su inkubirane sa PBS na 4°C preko noći. Nakon ispiranja sa PBS, ćelije su inkubirane sa sekundarnim antitelima obeleženim biotinom u komori za vlagu na 37◦C tokom 20 minuta. Svaki uzorak je zatim ispran u PBS-u i obeležen konjugatima peroksidaza-streptavidin iz hrena (radni rastvor C) na 37°C tokom 20 min. Nakon ispiranja sa PBS-om, ćelije su obojene DAB reagensom u mraku otprilike 1-10 min, a razvoj smeđe boje je praćen svjetlosnom mikroskopijom. Svaki uzorak je zatim dva puta ispran u destilovanoj vodi u trajanju od 1-2 min, a jezgra su obojena rastvorom hematoksilina 0,5-1 min. Nakon temeljitog ispiranja svakog uzorka u vodi, ćelije su uronjene u 1% alkohol hlorovodonične kiseline za diferencijaciju i 1% vodeni rastvor amonijaka, nakon čega je sledilo temeljito ispiranje ćelija u vodi. Ćelije iz svakog uzorka su zatim dehidrirane u 70% etanolu 2 min, 80% etanolu 2 min, 90% etanolu 2 min dva puta, 95% etanolu 2 min dva puta i 100% etanolu dva puta 2 min. Ćelije su zatim dva puta uronjene u rastvor ksilena na 2 min i postavljene na staklo sa neutralnim smolama. Pod svjetlosnom mikroskopijom, svaki uzorak je podvrgnut snimanju slike i nasumičnom odabiru 5-10 efektivnih vidnih polja kako bi se odredila ekspresija odabranih proteina u dopaminergičkim neuronima naznačena intenzitetom smeđih čestica i polukvantificirao sadržaj proteina prema njegovoj prosječnoj sivoj vrijednosti. .

Stopa apoptoze ćelija MES23,5 mjerena protočnom citometrijom

Adherentne ćelije su jednom isprane sa PBS. Za izolaciju ćelija, dodana je odgovarajuća količina rastvora tripsina bez EDTA na sobnoj temperaturi i rastvor je lagano pipetiran da bi se omogućilo da se prilepljene ćelije odvoje. Zatim je dodan medijum stanične kulture da se zaustavi tripsinizacija. Smjesa je prebačena u novu epruvetu za centrifugiranje i zatim centrifugirana 5 minuta na 1500 rpm da bi se sakupile izolovane ćelije. Nakon odbacivanja supernatanta, ćelijska peleta je lagano resuspendirana korištenjem PBS-a i ćelije su izbrojane. Otprilike 1 × 105 do 5 × 105 resuspendiranih ćelija centrifugirano je 5 minuta na 1500 rpm i supernatant je odbačen. Pet mikrolitara rastvora za vezivanje Aneksina V-FITC dodano je ćelijskom peletu da se ćelije nežno resuspenduju. Dodato je još 5 µL Annexin V-FITC i dobro promiješano. Pet mikrolitara rastvora propidijum jodida korišćeno je za bojenje ćelija inkubacijom na sobnoj temperaturi 10 minuta neposredno pre protočne citometrije.

Western blot analiza zain vitro

Ćelije su podijeljene u normalnu grupu, MPP+ tretiranu grupu, niske dozeC. tubulosaliječenu skupinu, umjerenu dozu C. tubulosa i liječenu grupu s visokim dozama C. tubulosa. Izmjerena je ekspresija Bcl2 i Bax u svakom od njih. Ukupno 1 × 105 ćelija po jažici u 6-ploči sa bunarima korišteno je za modeliranje i tretman u svakoj grupi prije sakupljanja ćelija. Mješoviti lizat, koji sadrži RIPA pufer, inhibitor proteaze i inhibitor fosfataze, dodat je da se ćelije lize 30 min na ledu. Nakon centrifugiranja, supernatant je korišten za analizu proteina. Ukupni protein je kvantifikovan korišćenjem BCA testa i razdvojen sa 10% SDS-PAGE. Odvojeni proteini su prebačeni na membranu i inkubirani sa 5% puferom za blokiranje obranog mleka na sobnoj temperaturi 2 h. Membrana je zatim inkubirana u primarnom antitelu (Bcl-2 0.34 mg/ml, Bax 0,11 mg/ml, 1:200 razblaživanje) na 4◦C preko noći. Nakon koraka ispiranja, membrana je inkubirana u sekundarnom antitelu (0,5 mg/ml, 1:5000 razblaženja) na 4◦C tokom 1 h, a zatim u ECL razvijaču 2 min za konvencionalni razvoj. Za semi-kvantitativnu analizu ekspresije proteina korišten je softver Quantity One.

PRIRODNI CISTANCHE TUBULOSA ZA ŠTITU JETRA PROTIV UMORA PHGS75% ECH 30% ACT 12%

Eksperimentalno modeliranje životinja i administracija lijekova

Pedeset mužjaka miševa bez specifičnih patogena 8-nedjelja starih nasumično je podijeljeno u pet grupa: normalna grupa, grupa za liječenje MPTP (vozilo), grupa za liječenje niskim dozama C. tubulosa, umjerena doza za liječenje C. tubulosa grupa, i grupa za liječenje visoke doze C. tubulosa. Životinje su bile smještene na 20-22°C sa slobodnim pristupom hrani i vodi. Miševima u normalnoj grupi intraperitonealno je ubrizgana jednaka količina normalnog fiziološkog rastvora sedam uzastopnih dana. Miševima u drugim tretiranim grupama intraperitonealno je ubrizgan MPTP (30 mg/kg/d) sedam uzastopnih dana da bi se uspostavili vehikulum.

Tokom PD modeliranja, miševima u grupama za liječenje niskim, umjerenim dozama i visokim dozama C. tubulosa intragastrično su davani ekvivalentni klinički volumeni od 4 g/kg/d, 8 g/kg/d i 16 g/ kg/dC. tubulosa nanoprah, odnosno 14 uzastopnih dana. Miševima u kontrolnoj i vehikulum grupi su intragastrično davani ekvivalentni volumeni normalnog fiziološkog rastvora tokom 14 uzastopnih dana. Sve eksperimentalne procedure odobrene su od strane Etičkog odbora Fujian univerziteta TCM i izvedene su u skladu sa međunarodno prihvaćenim principima za upotrebu i njegu laboratorijskih životinja. U ovoj studiji uloženi su svi napori da se patnja životinja svede na minimum.