Cistanche Tubulosa izaziva apoptozu primarnih i metastatskih ljudskih ćelija raka debelog crijeva posredovanu vrstama reaktivnog kisika

UVOD

Rak debelog crijeva je jedan od najčešćih karcinoma u svijetu (Brenneret al., 2014.), a njegova incidencija stalno raste sa procijenjenih 2,4 miliona slučajeva u 2035. godini, zbog moderne prehrane i načina života, uz smanjenu fizičku aktivnost. Trenutni napori nisu dovoljni za borbu protiv sadašnje epidemije kolorektalnog karcinoma i stoga su potrebni novi pristupi za efikasnu prevenciju i liječenje, uključujući promjene u načinu života u kombinaciji sa sigurnijim alternativnim intervencijama kao što suFitoterapeutika (Weidneret al., 2015). Fitoterapija, upotreba ljekovitog bilja za liječenje bolesti, bila je neizbježan dio drevne ljudske povijesti. Ljekovite biljke se dugo koriste kao alternativni izvori liječenja raka, što predstavlja više od šezdeset posto lijekova protiv raka koji se koriste u konvencionalnoj medicini (Balunas i Kinghorn, 2005; Saibuet al., 2015). Neki od najpoznatijih primjera uključuju izvode izCatharanthus roseusG. Don. (Apocynaceae), Taxus baccata L. (Taxaceae) i Camptotheca acuminate Decne (Nyssaceae) (Cragg i Newman, 2005; da Rochaet al., 2001). Pokazalo se da nekoliko biljnih ekstrakata i fitokemikalija ispoljava antitumorske efekte kod kolorektalnog karcinoma koji se pripisuju indukciji proizvodnje reaktivnih kisikovih vrsta (ROS) i povezanoj apoptozi stanica raka kao u slučaju ekstrakata izMelissa officinalis(Weidneret al., 2015)

Među fitoterapeutskim kandidatima,Cistanche tubulosa, parazitska pustinjska biljka Orobanchaceae (Jiang et al., 2009.) koja je široko rasprostranjena u sušnim i polusušnim regijama Afrike, Azije i Mediterana, pokazala se da ima vrijedna ljekovita svojstva. Cistanche tubulosa se intenzivno koristi u tradicionalnoj medicini i pretpostavlja se da ima ljekovito djelovanje kod nedostatka bubrega, morbidne leukoreje, metroragije, ženske neplodnosti i senilne konstipacije (Jiang et al., 2009.). Pored svoje tradicionalne medicinske upotrebe, važne svojstva Cistanche Tubulosa su intenzivno proučavana tokom posljednje decenije, uključujući vazorelaksante (Yoshikawa et al., 2006), hepatoprotektivne (Morikawa et al, 2010), antihiperglikemijske i hipolipidemijske efekte (Xiong et al., 2013). Cistanche Tubulosa je također predložen kao snažan pojačivač imunološkog sistema, promotor formiranja kostiju i sredstvo protiv starenja i umora (Xu et al., 2014). Nadalje, pokazalo se da ekstrakt Cistanche tubulosa blokira taloženje amiloida u modelu Alchajmerove bolesti (Wu et al., 2015). Unatoč raznim terapijskim primjenama, učinak Cistanche Tubulosa kao potencijalnog lijeka protiv raka još uvijek nije proučavan.

U ovom radu istražili smo antikancerogeno djelovanje Cistanche Tubulosa na dvije primarne i dvije metastatske ćelijske linije raka debelog crijeva i potencijalne mehanizme koji su u osnovi ovog efekta.

PRIRODNI CISTANCHE TUBULOSA ZA POBOLJŠANJE SEKSUALNE FUNKCIJE PHGS75% ECH 30% ACT 12%

MATERIJALI I METODE

Sakupljanje i priprema biljnog ekstrakta

Uzorci Cistanche tubulosa prikupljeni su iz pustinjskih područja u Kataru 2014. godine, a autentičnost biljke potvrdio je herbatolog. Uzorci vaučera se arhiviraju u Odjeljenju za toksikologiju i višenamjensku upotrebu u ADLQ. Uzorci biljaka osušeni na suncu su mljeveni Retsch Knife Mill Grindomix GM300 u fini prah. Dvadeset grama praha je ekstrahovano sa 200 mL ultra čiste vode preko noći na 37 stepeni na rotacionoj mešalici pri 200 o/min. SirovaEkstrakti Cistanche tubulosa (CTE)centrifugirani 30 min na 8000 rpm da bi se taložila nerastvorljiva jedinjenja, supernatant je sakupljen i osušen zamrzavanjem korišćenjem Labconco Freezone 6 plus sušara za zamrzavanje. Osušeni ekstrakt je rekonstituisan u Dulbecco-ovom modificiranom orlovom mediju (DMEM, SIGMA, Njemačka) do koncentracije od 20 mg/mL i sterilno filtriran kroz 0.2-mikronski membranski filter.

Ćelijske linije i održavanje ćelija

Ćelijske linije humanog karcinoma debelog crijeva CaCo2, SW620 i LoVo su nabavljene od Cell Lines Service-a (CLS, Eppelheim, Njemačka), dok je ćelijska linija HCT 116 ljubazan poklon Odsjeka za biološke nauke i nauke o okolišu na Univerzitetu u Kataru. CaCo2 i HCT11 izvedeni su iz primarnog mjesta karcinoma debelog crijeva, dok su SW620 i LoVo izvedeni iz metastatskog mjesta. SW620, HCT116 i LoVo ćelije su kultivisane i održavane u DME medijumu, dok su CaCo2 ćelije održavane u Eagleovom minimalnom esencijalnom medijumu (EMEM, SIGMA, Nemačka). Ćelije su uzgajane kao monosloj kultivisane na 37 stepeni u odgovarajućoj podlozi sa dodatkom 10% fetalnog goveđeg seruma (FBS, SIGMA, Nemačka) i 1% penicilina/streptomicina (SIGMA, Nemačka) u vlažnoj atmosferi koja sadrži 5% ugljen-dioksida.

Test vitalnosti ćelija

{{0}}[4,5-dimetiltiazol-2-il]-2,5-difeniltetrazolijum (MTT) test je korišten za procjenu citotoksične aktivnosti CTE slično kao što je ranije opisano (Jaganjac et al., 2010). Gustina zasijavanja CaCo2, HCT116, SW620 i LoVo ćelija kultiviranih u 96-pločama sa jažicom bila je 104 ćelije po jažici. Ćelije su postavljene u odgovarajući medijum sa dodatkom 10% FBS 24 sata pre tretmana. Nakon 24 sata, medijum je uklonjen i ćelije su tretirane sa 0, 0,25, 0,5, 1 i 2 mg/mL CTE tokom 24, 48 i 72 sata na 37 stepeni u vlažnoj atmosferi koja sadrži 5% CO2. Nakon CTE tretmana, medijum je uklonjen i 40 µL MTT rastvora (0,5 mg/mL) je dodato u svaku jažicu.

Nakon 3 h inkubacije, otopina MTT je uklonjena, produkt formazana otopljen u dimetilsulfoksidu (DMSO, SIGMA, Njemačka), a apsorbancija je izmjerena na 590 nm čitačem mikroploča (Infinite 200 PRO NanoQuant, Tecan Trading AG, Švicarska) .

Test apoptoze

Apoptoza u CaCo2, HCT116, SW620 i LoVo ćelijama je otkrivena korištenjem PE Annexin V kompleta za detekciju apoptoze I sa 7-Amino-Aktinomicinom D (7-AAD) kao vitalnom bojom (Becton Dickinson International, Belgija) prema uputstvu proizvođača. Ukratko, ćelije su zasijane u 24-ploče sa gustinom od 5×104 ćelije/jažici u odgovarajućoj podlozi sa dodatkom 10% FBS tokom 24 h pre dodavanja CTE (0, 0,5 ili 1 mg/mL). Nakon 24 CTE inkubacije, ćelije su sakupljene, isprane dva puta hladnom fiziološkom otopinom puferovanom fosfatom i obojene s Phycoerythrin (PE) Aneksin V i 7-AAD 15 minuta na sobnoj temperaturi u mraku. Obojene ćelije su analizirane u roku od 1 sata protočnom citometrijom koristeći FACS. Aria III protočni citometar i softver FACSDiva (Becton Dickinson) pri maloj brzini protoka sa minimalno 104 ćelije. Tretman ćelija tokom 4 sata sa 6 µM kamptotecinom (SIGMA) korišten je kao pozitivna kontrola za test.

Intracelularna proizvodnja ROS

Intracelularna proizvodnja ROS-a je ispitana upotrebom 2,7- diklorodihidrofluorescein diacetata (DCFH-DA, SIGMA, Njemačka). DCFH-DA je nefluorescentna sonda, koja se oksidira intracelularnim ROS u fluorescentno jedinjenje 2,7- diklorofluorescein (DCF) (Poljak-Blazi et al., 2011). DCFH DA test je izveden na sličan način kao što smo opisali ranije (Cindric et al, 2013; Poljak-Blazi et al., 2011). Ukratko, gustina sjetve CaCo2, HCT116, SW620 i LoVo ćelija kultiviranih u 96-crnim pločama u bunarima iznosila je 104 ćelije po jažici. Ćelije su postavljene u odgovarajuću podlogu sa dodatkom 10% FBS tokom 24 sata. Pre tretmana ćelije su inkubirane sa 10 µM DCFH-DA na 37 stepeni tokom 30 minuta u 5% CO2 / 95% vazduha. Ćelije su zatim isprane i tretirane sa 0, 0,5 i 1 mg/mL CTE u medijumu bez fenol crvenog. Formiranje intracelularnog ROS-a je praćeno kontinuirano tokom 25 sati na 37 stepeni i 5% CO2 korišćenjem čitača mikroploče sa gornjom fluorescencijom i modulom za kontrolu gasa (Infinite 200 PRO, Tecan Trading AG, Švajcarska). Intenzitet fluorescencije je mjeren uz talasnu dužinu ekscitacije od 500 nm i detekciju emisije na 529 nm. Proizvoljne jedinice, relativne jedinice fluorescencije (RFU), bile su bazirane direktno na intenzitetu fluorescencije.

PRIRODNA CISTANCHE TUBULOSA ZA POBOLJŠANJE FUNKCIJE BUBREGA PHGS75% ECH 30% ACT 12%

Generisanje mitohondrijalnog superoksida

Sposobnost CTE-a da inducira stvaranje superoksida od strane mitohondrija procijenjena je korištenjem ćelijske propusne, mitohondrije ciljane MitoSOX Red sonde (Life Technologies) i Hoechst 33342 za nuklearno bojenje (Life Technologies). CaCo2, HCT116, SW620 i LoVo ćelije su zasijane u 96-ploče sa gustinom od 104 ćelije po jažici u odgovarajućem mediju sa dodatkom 10% FBS tokom 24 sata . Ćelije su zatim napunjene sa 4 µM MitoSOX-a i 2 µM Hoechst 33342 tokom 20 minuta, višak boje je ispran, a jažice su tretirane sa 0, 0,5 i 1 mg/mL CTE tokom 24 sata na 37 stepeni i 5% CO2. Intenzitet fluorescencije je mjeren uz talasnu dužinu ekscitacije od 510 nm i detekciju emisije na 580 nm za MitoSOX i talasnu dužinu ekscitacije od 350 nm i detekciju emisije na 461 nm za Hoechst 33342 uz pomoć čitača mikroploče PROFU0CAN sa vrhom fluorescencije TraIn AG, Švicarska)

Statistička analiza

Deskriptivna statistika je prikazana kao srednja vrednost +/− SD. Značajnost razlika između grupa procijenjena je pomoću Studentovog t-testa i Hi-kvadrat testa. Kada je upoređeno više od dvije grupe, koristili smo jednostranu ANOVA-u sa odgovarajućim post hoc testiranjem. Korišten je SPSS 11.01 za Mircosoft Windows. Razlike sa P manjim od 0,05 smatrane su statistički značajnim.

REZULTATI

Učinak CTE na proliferaciju ćelijskih linija humanog raka debelog crijeva prikazan je na slici 1. Sve testirane koncentracije CTE pokazale su snažan inhibitorni učinak na ćelijsku liniju CaCo2 na način ovisan o koncentraciji i vremenu (Slika 1A). Sedamdeset dva sata CTE tretmana inhibirala je rast CaCo2 ćelija za više od 60% u poređenju sa kontrolom (p < 0.05 za sve koncentracije). Značajan uticaj CTE tretmana na rast ćelija HCT116 je takođe otkriven u svim vremenskim tačkama pri dve najveće koncentracije (1 mg/mL i 2 mg/mL), dostižući smanjenje od više od 70% u poslednjoj koncentraciji (Slika 1B, p < 0,05). Iako su dvije niže koncentracije CTE (0,25 i 0,5 mg/mL) značajno smanjile rast stanica HCT116 nakon 24 sata (p<0.05), they had no significant effect following 72 hours of treatment compared to control (p>{{0}}.{{10}}5). Vremenski i koncentracijsko zavisna inhibicija proliferacije sa CTE dalje je potvrđena u LoVo ćelijama za više od 60% pri najvišoj koncentraciji (p < 0.05) (Slika 1C), i sve četiri testirane koncentracije CTE smanjile su rast ćelija SW620 nakon 48 sati (slika 1D, p < 0.05 za sve). Nakon 72 sata tretmana, isti efekat je uočen samo za dvije najveće koncentracije (p < 0,05), dok koncentracije od 0,25 i 0,5 mg/mL nisu pokazale značajan učinak u poređenju sa kontrolom (p > 0,05). Uticaj tretmana CTE od 0,5 i 1 mg/mL na indukciju apoptoze dalje je testiran u sve četiri ćelijske linije (Slika 2). Povećan broj ćelija u ranoj apoptozi otkriven je u HCT116 i LoVo nakon 24-satnog tretmana sa 0,5 mg/mL (p<0.05, Figure 2B and 2C) and in all cell lines at 1 mg/mL (p<0.05). A significant increase in necrotic or late apoptotic cell number was further observed in CaCo2 and SW620 cell lines (p<0.05, Figure 2A and 2D). The ability of CTE to induce intracellular ROS production is demonstrated in Figure 3. Three hours following CTE treatment there was a strong increase in intracellular ROS production in all cell lines (p<0.05). The intracellular ROS production increased progressively throughout the 25 hours of treatment in a time and concentration-dependent manner. Furthermore, the staining of cells with a mitochondria-targeted probe revealed a strong impact of CTE on mitochondrial superoxide production in a concentration-dependent manner (Figure 4). The highest increase in superoxide production by mitochondria was observed in HCT116 (69%, Figure 4B) and LoVo cells (82%, Figure 4C) following 24-hour treatment with 1 mg/mL of CTE.

Slika 1:Efekat odCistanche tubulosana održivost ćelijskih linija raka debelog crijeva. Vijabilnost ćelija izmerena MTT testom (A) CaCo2, (B) HCT116, (C) LoVo i (D) SW620 ćelija je predstavljena kao procenat kontrolne netretirane ćelijske linije raka debelog creva. Date su srednje vrijednosti (±SD) za 5 ponavljanja reprezentativnog eksperimenta: (*) značaj p<0.05 in comparison to control untreated respective cells.

Slika 2: Vodeni ekstrakt Cistanche tubulosa indukuje apoptozu u ljudskim ćelijama raka debelog creva. Aneksin-V-FITC analize protočne citometrije (A) CaCo2, (B) HCT116, (C) LoVo i (D) SW620 ćelija su predstavljene kao procenat kontrolne netretirane ćelijske linije raka debelog creva. Date su srednje vrijednosti (±SD) za 3 ponavljanja reprezentativnog eksperimenta: (*) značaj p<0.05 in comparison to control untreated respective cells.

Slika 3: Vodeni ekstrakt Cistanche tubulosa inducira intracelularnu proizvodnju ROS u zavisnosti od vremena i doze. Proizvodnja ROS-a mjerena DCFH-DA testom u (A) CaCo2, (B) HCT116, (C) LoVo i (D) SW620 ćelijama predstavljena je kao srednje vrijednosti RFU (±SD) za odgovarajuće 5- replike reprezentativni eksperiment. (*) Značaj str<0.05 in comparison to control untreated colon cancer cells. 

Slika 4: Vodeni ekstrakt Cistanche tubulosa indukuje proizvodnju mitohondrijalnog superoksida u ljudskim ćelijama raka debelog creva. Intenzitet fluorescencije MitoSOX Red sonde ciljane na mitohondrije u A) CaCo2, (B) HCT116, (C) LoVo i (D) SW620 ćelijama je predstavljen kao procenat kontrolne netretirane ćelijske linije raka debelog creva. Date su srednje vrijednosti (±SD) za 5 ponavljanja reprezentativnog eksperimenta: (*) značaj p<0.05 in comparison to control untreated colon cancer cells.

DISKUSIJA

Iako su ranije studije izvijestile o brojnim ljekovitim svojstvima Cistanche tubulosa, ovo je prvi izvještaj o njegovom antiproliferativnom djelovanju na maligne stanice. Bioaktivna jedinjenja Cistanche tubulosa ekstrahirana vodom, visoko polarnim rastvaračem, pokazala su snažnu bioaktivnost protiv raka. Ranije smo uporedili efikasnost Cistanche tubulosa rastvorenog u vodi sa drugim rastvaračima kao što su metanol i etil acetat, ali vodeni ekstrakti su pokazali najperspektivnije antikancerogeno dejstvo (podaci nisu prikazani).

Pokazali smo sposobnost CTE od 1 mg/mL i 2 mg/mL da inhibira 60% rasta primarnih i metastatskih ćelijskih linija raka debelog crijeva, otkrivajući potencijalno važnu uloguCistanche tubulosakao tretman raka debelog crijeva. U poređenju sa normalnim ćelijama, ćelije raka se generalno karakterišu poremećajem redoks homeostaze i uobičajena strategija trenutnih terapija protiv raka je povećanje ćelijskog oksidativnog stresa (Yang et al, 2013). Iako fiziološki niski nivoi ROS imaju važnu ulogu kao signalnih molekula, prekomjerna proizvodnja ROS može doprinijeti nestabilnosti raka i malignomu (Liou i Storz, 2010). Paradoksalno, ova neravnoteža u ćelijskoj redoks homeostazi čini ćelije raka ranjivijim na ćelijsku smrt izazvanu ROS (Jaganjac et al., 2008; Nogueira i Hay, 2013). Anti-proliferativni učinak CTE-a o kojem se govori u ovoj studiji može biti posredovan različitim ekstra- i intracelularnim mehanizmima poznatih i nepoznatih spojeva unutar ekstrakta, ciljajući na više puteva koji igraju bitnu ulogu u apoptozi. Da bismo napravili razliku između različitih načina ćelijske smrti, istražili smo potencijalni mehanizam odgovoran za uočenu citotoksičnost izazvanu CTE.

EKSTRAKT CISTANCHE TUBULOSA Anti Alzhermer PHGS75% ECH 30% ACT 12%

Naši podaci pokazuju da CTE povećava unutarćelijsku proizvodnju ROS-a i posljedično ROS-indukovanu ćelijsku smrt. Redox stanje ćelije takođe igra ključnu ulogu u regulaciji apoptoze, a mitohondrijski lanac transporta elektrona jedno je od glavnih mesta generisanja ćelijskih ROS (Trachootham et al., 2008). Nadalje, intracelularni ROS može uzrokovati ćelijsku apoptozu putem i mitohondrijski zavisnih i nezavisnih puteva (Sinha et al., 2013). Zaista, naši podaci također ukazuju na to da je eksternalizacija fosfatidilserina izazvana CTE uobičajen učinak u apoptozi, kako u primarnim tako iu metastatskim ćelijskim linijama raka, sugerirajući da je mehanizam smrti uzrokovane CTE posredovan apoptozom, a ne nekrozom. Aktivacija apoptoze u stanicama raka je korektivna strategija i mnogi lijekovi protiv raka mogu imati apoptotičke efekte u stanicama raka.

Spojevi ili ekstrakti s pro-apoptotičkim aktivnostima u stanicama raka su stoga potencijalno korisni u istraživanju lijekova protiv raka (Wong, 2011). Da bismo utvrdili da li je pro-apoptotički efekat izazvan CTE-om posredovan mitohondrijskim mehanizmom ROS-a, izmjerili smo proizvodnju superoksida korištenjem fluorescentne sonde usmjerene na mitohondrije u stanicama tretiranim CTE. Naši podaci jasno pokazuju da CTE stimulira proizvodnju mitohondrijalnog superoksida što sugerira da je antikancerogena aktivnost Cistanche tubulosa barem djelomično posredovana mitohondrijama induciranim ROS mehanizmom.

ZAKLJUČCI

Zaključno, naši podaci sugeriraju da vodeni ekstrakt pustinjske biljke Cistanche tubulosa može predstavljati obećavajući kandidat za pristup protiv raka u kombinaciji s drugim konvencionalnim terapijama za prevenciju i liječenje raka debelog crijeva. Također smo pokazali da je toksičnost biljnog ekstrakta protiv stanica raka posredovana povećanom intracelularnom produkcijom ROS i, barem djelomično, apoptozom ovisnom o mitohondrijima. Dalja istraživanja su u toku kako bi se izolirali i karakterizirali pojedinačni biološki aktivni sastojci odgovorni za djelovanje protiv raka.

Potrebno je više istraživanja kako bi se procijenila potencijalna upotreba ovog ekstrakta kao efikasnog hemopreventivnog sredstva i razumjeli mehanizmi djelovanja na ćelije raka debelog crijeva na molekularnom nivou. Potrebne su i dodatne pretkliničke i kliničke studije kako bi se potvrdili uočeni korisni učinci na zdravljeCistanche tubulosa za prevenciju raka.

 CISTANCHE TUBULOSA CISTANCHE COFFE POBOLJŠAVA PAMĆENJE PROTIV UMORA PHGS75% ECH 30% ACT 12%