1. Uvod

Identifikacija sastojaka hrane sa imunomodulatornim svojstvima zajedno sa njihovim odgovarajućim molekularnim ciljevima privukla je povećan interes posljednjih godina. Zbog njihove velike raznolikosti liganda, superfamilija potencijalnih tranzijentnih receptora jonskih kanala (TRP kanala) predstavlja veoma interesantnu klasu potencijalnih ciljnih struktura.

Superfamilija TRP kanala sisara uključuje šest srodnih familija proteina, a to su ankirin (TRPA), kanonski (TRPC), melastatin (TRPM), mukolipin (TRPML), policistin (TRPP) i familija vaniloida (TRPV), od kojih svi tipično dijele šest transmembranskih segmenata koji se spajaju u tetrakacione varijante. selektivnost.[1] TRPV1 kanal je možda daleko najintenzivnije istražen član TRP superfamilije. TRPV1 je prvobitno identifikovan kao receptor za kapsaicin, ljutu komponentu čili papričica.[2] Kasnije se pokazalo da i oštri sastojci iz đumbira, gingeroli, aktiviraju TRPV1.[3]

Biološka uloga TRPV1 u ne-neuronskim tipovima ćelija je još uvijek pod opsežnim istraživanjem, ali dostupni rezultati impliciraju funkcije koje su daleko izvan senzorne i termalne percepcije. Na primjer, 12-nedjeljna intervencija s dnevnom dozom od 0,15 mg agonista TRPV1 nonivamida, strukturnog analoga kapsaicina, spriječila je povećanje tjelesne masnoće uzrokovano prehranom i povećala nivoe serotonina u plazmi kod zdravih subjekata s prekomjernom težinom.[4]

U 3T3-L1 adipocitima aktivacija TRPV1 nonivamidom smanjila je akumulaciju lipida tokom diferencijacije i sazrijevanja supresijom ekspresije PPAR𝛾.[5] U makrofagima, kapsaicin i nonivamid su oslabili oslobađanje proinflamatornih citokina kao što su IL6, CXCL8 i TNF-alfa izazvano LPS-om, na način ovisan o TRPV1.[6] Ipak, određene funkcije TRPV1 u leukocitima ljudske krvi ostaju nejasne. U ljudskim NK ćelijama, 10 i 50 μM kapsaicina inducirali su porast intracelularnih koncentracija Ca2+, što ukazuje na funkcionalni TRPV1 kanal.[7]

Međutim, prigušene efektorske funkcije NK stanica, kao što su citotoksična degranulacija i sekrecija citokina, inducirane prethodnom obradom stanica kapsaicinom u trajanju od 1 h u rasponu koncentracija od 10-100 μM, bile su uglavnom neovisne o TRPV1.[7] U T ćelijama je dokumentovano da je TRPV1 uključen u procese signalizacije receptora T ćelija, proliferaciju i diferencijaciju T ćelija, kao i proizvodnju citokina.[8] Prethodni rad naše grupe je takođe pokazao funkcionalnu ekspresiju TRPV1 u ljudskim primarnim T ćelijama.[9] Nadalje, analize odgovora na dozu u koncentracijama u rasponu od 0,03 do 300 μmol L-1 otkrile su da [6]-gingerol inhibira lučenje citokina primarnim ljudskim leukocitima sa IC50 vrijednošću od 82,2 μmol L-1.

Međutim, kvantifikacija [6]-gingerola u uzorcima plazme zdravih ispitanika pokazala je srednju maksimalnu koncentraciju u plazmi od samo 42,0 ± 16,3 nmol L-1 nakon uzimanja 1 L čaja od đumbira. Budući da ove koncentracije [6]-gingerola nisu imale značajan utjecaj na lučenje citokina u prethodnim studijama, [9] nije jasno da li je dijetalno relevantna koncentracija od 50 nmol L-1, koja se postigne u krvnoj plazmi nakon konzumiranja 1 L čaja od đumbira, dovoljna za moduliranje ćelijskog imunološkog odgovora u drugim ljudskim primarnim leukocitima.

Za ljudske neutrofile, znanje o funkcionalnoj ulozi TRPV1 je ograničeno. Dok su Köse i Nazıroglu˘ [10] pokazali da se tok Ca2+- u neutrofilima kao odgovor na 10 μM kapsaicina smanjuje od strane antagonista TRPV1 kapsazepina, drugi rezultati nisu pokazali da kapsaicin inducira priliv Ca2+ unatoč koncentraciji μM u rasponu od 1–10 kada je testiran u rasponu koncentracije 1–10 μM. RNA ekspresija.[11]

Neutrofili su najzastupljeniji leukociti u ljudskoj krvi, koji čine 60-70% svih cirkulirajućih bijelih krvnih stanica. One su prve imunološke ćelije koje se regrutuju na mjesta infekcije; stoga se često nazivaju prvom linijom odbrane.[12] Regrutaciju neutrofila pokreću, između ostalog, bakterijski ili mitohondrijski peptid N-formilmetionin-leucil-fenilalanin (fMLF) ili hemokini kao što je CXCL8 (IL-8).[13]

Odbrambeni mehanizmi neutrofila uključuju fagocitozu,[14] oslobađanje antimikrobnih enzima degranulacijom,[15] stvaranje reaktivnih vrsta kiseonika (ROS),[16] i formiranje neutrofilnih ekstracelularnih zamki.[17] Pored ovih direktnih odbrambenih mehanizama, neutrofili dalje doprinose kasnijim imunološkim odgovorima putem oslobađanja različitih citokina i hemokina.[18] Takođe, neutrofili mogu da prođu proces pražnjenja koji im omogućava da snažnije reaguju na kasniju punu aktivaciju.[16b]

Posljednjih godina su narasli dokazi da sastojci iz hrane i/ili ljekovitog bilja mogu modificirati jedan ili više spomenutih odbrambenih odgovora ljudskih neutrofila. Ove modifikacije uključuju povećanu fagocitotsku aktivnost[19] i stvaranje ROS,[20] pojačanu hemotaksiju prema fMLF,[21] i formiranje neutrofilnih ekstracelularnih zamki.[20] Međutim, aktivni spoj(i) nije identificiran. Sastojci iz Ferula akitschkensis (𝛽-pinen, sabinen, 𝛾-terpinen, geranilaceton i izobornilacetat) su desenzibilizirali neutrofile na fMLF- i CXCL8- inducirali priliv Ca2+ i inhibirali, gdje se fMLF inhibirao u Efekti izazvani geranilacetonom bili su posredovani preko TRPV1.[22]

Na osnovu dostupnih podataka, pretpostavili smo da ligandom indukovana aktivacija TRPV1 od strane [6]-gingerola može uticati na opšte funkcije neutrofila, bilo direktno ili kroz pojačavanje njihovih odgovora na aktivirajuće stimuluse. U okviru ove hipoteze, posebno smo imali za cilj da razjasnimo da li je verifikovana nutritivno relevantna koncentracija dovoljna da modulira ćelijske imune odgovore u ljudskim primarnim neutrofilima kao delu populacije leukocita. '

Nadalje, nastojali smo da uporedimo nivoe ekspresije RNK svih članova TRP superfamilije sisara u pet najistaknutijih tipova ćelija u ljudskoj krvi kako bismo dobili kvalitativno i kvantitativno sveobuhvatan pregled ekspresije TRP kanala u ljudskim leukocitima.

2. Rezultati

2.1. Obilje i relativni nivoi transkripta TRP kanala u ljudskim leukocitima

Kako bi se procijenila ekspresija RNK TRP kanala u krvnim leukocitima, pet najistaknutijih tipova ćelija leukocita izolovano je iz krvi zdravih donora, a ekspresija RNK TRP kanala je analizirana kvantitativnim RT-PCR (slika 1).

Specifični transkripti TRPV kao i TRPM porodice su detektovani sa visokim frekvencijama od 75-100% u svim analiziranim tipovima ćelija. Prosječna ukupna učestalost uzimajući u obzir sve tipove ćelija bila je 96% za porodicu TRPV i 98% za porodicu TRPM. TRPC-specifični transkripti su bili mnogo manje zastupljeni, u rasponu od 0% u monocitima, NK ćelijama, T ćelijama i B ćelijama do 100% u NK ćelijama i T ćelijama sa ukupnom srednjom učestalošću od samo 53% (Slika 1A). TRPC5-specifičan transkript je otkriven samo u neutrofilima, sa učestalošću od 70%.

Također, TRPA1-specifični transkript općenito je otkrio prilično nisku zastupljenost u analiziranim tipovima ćelija sa učestalošću od 100% u neutrofilima, 25% u monocitima, 80% u NK ćelijama, 100% u T ćelijama i 60% u B ćelijama. Isto tako, transkript specifičan za TRPML3 pokazao je nisku učestalost u neutrofilima (50%), monocitima (25%), NK ćelijama (40%) i B ćelijama (20%), ali učestalost od 100% u T ćelijama. TRPV1-specifični transkript je detektovan u svim tipovima ćelija, pokazujući učestalost od 100% u monocitima, NK ćelijama i T ćelijama, i učestalost od 90% u neutrofilima i 80% u B ćelijama.

Što se tiče relativne ekspresije RNK, u poređenju sa odgovarajućim frekvencijama, TRP kanali su otkrili obrazac ekspresije koji je više specifičan za tip ćelije, što je vidljivo poređenjem odgovarajućih vrednosti Δct u različitim analiziranim tipovima ćelija (Slika 1B). Na primjer, TRPP3 je detektovan sa frekvencijom od 100% u svim tipovima ćelija, ali je jasno otkrio najviši nivo ekspresije u monocitima.

Nasuprot tome, TRPV2 kanal je otkriven u svim ispitivanim tipovima ćelija, sa uporedivo visokim nivoom ekspresije RNK, kao i visokom frekvencijom. Isto tako, nivoi transkripta TRPV1 bili su slični u svim ispitivanim tipovima ćelija (Slika 1B).

2.2. TRPV1 površinska ekspresija na neutrofilima

Trenutno saznanje o funkciji TRPV1 u ljudskim neutrofilima je još uvijek nejasno. Da bismo dalje istražili uloge TRPV1 u ljudskim neutrofilima, zatim smo istražili da li je kanal TRPV1 eksprimiran na površini primarnih ljudskih neutrofila koristeći protočnu citometriju živih stanica (slika 2).

Izolovani neutrofili su obojeni na CD15 kao površinski marker za neutrofile (Slika 2A,B) i istovremeno obojeni antitijelom podignutim na epitop u prvoj ekstracelularnoj petlji proteina TRPV1 (Slika 2B) ili odgovarajućom kontrolom izotipa, pri čemu potonji služi kao surroginska slika (Slika 2B). 2A). Unutar CD15+ populacije analiziran je intenzitet fluorescencije za FITC. Bojenje neutrofila antitijelom TRPV1 dovelo je do jasno prepoznatljivog fluorescentnog signala u poređenju sa kontrolom izotipa, čime je potvrđena površinska ekspresija TRPV1 u primarnim ljudskim neutrofilima (Slika 2C). Analiza neutrofila od četiri pojedinačna donora otkrila je uporedivu površinsku ekspresiju TRPV1 (slika 2D).

2.3. [6]-Gingerol indukovano povećanje intracelularnog Ca2+

Pošto će ligandom indukovana aktivacija TRPV1 rezultirati prilivom Ca2+, [23] intracelularne koncentracije Ca2+ neutrofila su određene preko Ca2+-osjetljive boje Fura-2. Na osnovu naših prethodnih nalaza [9] odabrana je koncentracija od 50 nM dobro poznatog TRPV1 liganda [6]-gingerola i vrijeme inkubacije od 2 h. Analize su pokazale da je inkubacija neutrofila sa 50 nM [6]-gingerola rezultirala povećanjem intracelularnih koncentracija Ca2+ koje su u prosjeku iznosile 18,4% ± 1,0% od maksimalne vrijednosti, utvrđene primjenom 1 μM jonofora jonomicina. Povećanje izazvano DMSO iznosilo je 4,7% ± 1,2% (Slika 3).

2.4. Utjecaj [6]-Gingerola na ekspresiju TRPV1

Zatim smo imali za cilj da analiziramo uticaj stimulacije TRPV1 [6]-gingerolom na ekspresiju TRPV1 na nivou transkripta putem q-RTPCR, kao i na nivou površinskog proteina putem bojenja živih ćelija. U tu svrhu, ljudski neutrofili su inkubirani sa 50 nM [6]-gingerola tokom 2 h i odgovarajući nivoi ekspresije su kvantifikovani.

Ova inkubacija od 2 sata nije uticala ni na transkript TRPV1 ni na nivoe proteina (slika 4), a takođe se nije promenila, osim za IL6, IL17A, IL24, C5 i GDF5, istražena RNA ekspresija zajedničkih gena citokina i hemokina (slika S1, tabela S2, prateće informacije).

2.5. Utjecaj [6]-Gingerola na ekspresiju površinskih markera neutrofila

1. Uvod

Identifikacija sastojaka hrane sa imunomodulatornim svojstvima zajedno sa njihovim odgovarajućim molekularnim ciljevima privukla je povećan interes posljednjih godina. Zbog njihove velike raznolikosti liganda, superfamilija potencijalnih tranzijentnih receptora jonskih kanala (TRP kanala) predstavlja veoma interesantnu klasu potencijalnih ciljnih struktura.

Superfamilija TRP kanala sisara uključuje šest srodnih familija proteina, a to su ankirin (TRPA), kanonski (TRPC), melastatin (TRPM), mukolipin (TRPML), policistin (TRPP) i familija vaniloida (TRPV), od kojih svi tipično dijele šest transmembranskih segmenata koji se spajaju u tetrakacione varijante. selektivnost.[1] TRPV1 kanal je možda daleko najintenzivnije istražen član TRP superfamilije. TRPV1 je prvobitno identifikovan kao receptor za kapsaicin, ljutu komponentu čili papričica.[2] Kasnije se pokazalo da i oštri sastojci iz đumbira, gingeroli, aktiviraju TRPV1.[3]

Biološka uloga TRPV1 u ne-neuronskim tipovima ćelija je još uvijek pod opsežnim istraživanjem, ali dostupni rezultati impliciraju funkcije koje su daleko izvan senzorne i termalne percepcije. Na primjer, 12-nedjeljna intervencija s dnevnom dozom od 0,15 mg agonista TRPV1 nonivamida, strukturnog analoga kapsaicina, spriječila je povećanje tjelesne masnoće uzrokovano prehranom i povećala nivoe serotonina u plazmi kod zdravih subjekata s prekomjernom težinom.[4]

U 3T3-L1 adipocitima aktivacija TRPV1 nonivamidom smanjila je akumulaciju lipida tokom diferencijacije i sazrijevanja supresijom ekspresije PPAR𝛾.[5] U makrofagima, kapsaicin i nonivamid su oslabili oslobađanje proinflamatornih citokina kao što su IL6, CXCL8 i TNF-alfa izazvano LPS-om, na način ovisan o TRPV1.[6] Ipak, određene funkcije TRPV1 u leukocitima ljudske krvi ostaju nejasne. U ljudskim NK ćelijama, 10 i 50 μM kapsaicina inducirali su porast intracelularnih koncentracija Ca2+, što ukazuje na funkcionalni TRPV1 kanal.[7]

Međutim, prigušene efektorske funkcije NK stanica, kao što su citotoksična degranulacija i sekrecija citokina, inducirane prethodnom obradom stanica kapsaicinom u trajanju od 1 h u rasponu koncentracija od 10-100 μM, bile su uglavnom neovisne o TRPV1.[7] U T ćelijama je dokumentovano da je TRPV1 uključen u procese signalizacije receptora T ćelija, proliferaciju i diferencijaciju T ćelija, kao i proizvodnju citokina.[8] Prethodni rad naše grupe je takođe pokazao funkcionalnu ekspresiju TRPV1 u ljudskim primarnim T ćelijama.[9] Nadalje, analize odgovora na dozu u koncentracijama u rasponu od 0,03 do 300 μmol L-1 otkrile su da [6]-gingerol inhibira lučenje citokina primarnim ljudskim leukocitima sa IC50 vrijednošću od 82,2 μmol L-1.

Međutim, kvantifikacija [6]-gingerola u uzorcima plazme zdravih ispitanika pokazala je srednju maksimalnu koncentraciju u plazmi od samo 42,0 ± 16,3 nmol L-1 nakon uzimanja 1 L čaja od đumbira. Budući da ove koncentracije [6]-gingerola nisu imale značajan utjecaj na lučenje citokina u prethodnim studijama, [9] nije jasno da li je dijetalno relevantna koncentracija od 50 nmol L-1, koja se postigne u krvnoj plazmi nakon konzumiranja 1 L čaja od đumbira, dovoljna za moduliranje ćelijskog imunološkog odgovora u drugim ljudskim primarnim leukocitima.

Za ljudske neutrofile, znanje o funkcionalnoj ulozi TRPV1 je ograničeno. Dok su Köse i Nazıroglu˘ [10] pokazali da se tok Ca2+- u neutrofilima kao odgovor na 10 μM kapsaicina smanjuje od strane antagonista TRPV1 kapsazepina, drugi rezultati nisu pokazali da kapsaicin inducira priliv Ca2+ unatoč koncentraciji μM u rasponu od 1–10 kada je testiran u rasponu koncentracije 1–10 μM. RNA ekspresija.[11]

Neutrofili su najzastupljeniji leukociti u ljudskoj krvi, koji čine 60-70% svih cirkulirajućih bijelih krvnih stanica. One su prve imunološke ćelije koje se regrutuju na mjesta infekcije; stoga se često nazivaju prvom linijom odbrane.[12] Regrutaciju neutrofila pokreću, između ostalog, bakterijski ili mitohondrijski peptid N-formilmetionin-leucil-fenilalanin (fMLF) ili hemokini kao što je CXCL8 (IL-8).[13]

Odbrambeni mehanizmi neutrofila uključuju fagocitozu,[14] oslobađanje antimikrobnih enzima degranulacijom,[15] stvaranje reaktivnih vrsta kiseonika (ROS),[16] i formiranje neutrofilnih ekstracelularnih zamki.[17] Pored ovih direktnih odbrambenih mehanizama, neutrofili dalje doprinose kasnijim imunološkim odgovorima putem oslobađanja različitih citokina i hemokina.[18] Takođe, neutrofili mogu da prođu proces pražnjenja koji im omogućava da snažnije reaguju na kasniju punu aktivaciju.[16b]

Posljednjih godina su narasli dokazi da sastojci iz hrane i/ili ljekovitog bilja mogu modificirati jedan ili više spomenutih odbrambenih odgovora ljudskih neutrofila. Ove modifikacije uključuju povećanu fagocitotsku aktivnost[19] i stvaranje ROS,[20] pojačanu hemotaksiju prema fMLF,[21] i formiranje neutrofilnih ekstracelularnih zamki.[20] Međutim, aktivni spoj(i) nije identificiran. Sastojci iz Ferula akitschkensis (𝛽-pinen, sabinen, 𝛾-terpinen, geranilaceton i izobornilacetat) su desenzibilizirali neutrofile na fMLF- i CXCL8- inducirali priliv Ca2+ i inhibirali, gdje se fMLF inhibirao u Efekti izazvani geranilacetonom bili su posredovani preko TRPV1.[22]

Na osnovu dostupnih podataka, pretpostavili smo da ligandom indukovana aktivacija TRPV1 od strane [6]-gingerola može uticati na opšte funkcije neutrofila, bilo direktno ili kroz pojačavanje njihovih odgovora na aktivirajuće stimuluse. U okviru ove hipoteze, posebno smo imali za cilj da razjasnimo da li je verifikovana nutritivno relevantna koncentracija dovoljna da modulira ćelijske imune odgovore u ljudskim primarnim neutrofilima kao delu populacije leukocita. '

Nadalje, nastojali smo da uporedimo nivoe ekspresije RNK svih članova TRP superfamilije sisara u pet najistaknutijih tipova ćelija u ljudskoj krvi kako bismo dobili kvalitativno i kvantitativno sveobuhvatan pregled ekspresije TRP kanala u ljudskim leukocitima.

2. Rezultati

2.1. Obilje i relativni nivoi transkripta TRP kanala u ljudskim leukocitima

Kako bi se procijenila ekspresija RNK TRP kanala u krvnim leukocitima, pet najistaknutijih tipova ćelija leukocita izolovano je iz krvi zdravih donora, a ekspresija RNK TRP kanala je analizirana kvantitativnim RT-PCR (slika 1).

Specifični transkripti TRPV kao i TRPM porodice su detektovani sa visokim frekvencijama od 75-100% u svim analiziranim tipovima ćelija. Prosječna ukupna učestalost uzimajući u obzir sve tipove ćelija bila je 96% za porodicu TRPV i 98% za porodicu TRPM. TRPC-specifični transkripti su bili mnogo manje zastupljeni, u rasponu od 0% u monocitima, NK ćelijama, T ćelijama i B ćelijama do 100% u NK ćelijama i T ćelijama sa ukupnom srednjom učestalošću od samo 53% (Slika 1A). TRPC5-specifičan transkript je otkriven samo u neutrofilima, sa učestalošću od 70%.

Također, TRPA1-specifični transkript općenito je otkrio prilično nisku zastupljenost u analiziranim tipovima ćelija sa učestalošću od 100% u neutrofilima, 25% u monocitima, 80% u NK ćelijama, 100% u T ćelijama i 60% u B ćelijama. Isto tako, transkript specifičan za TRPML3 pokazao je nisku učestalost u neutrofilima (50%), monocitima (25%), NK ćelijama (40%) i B ćelijama (20%), ali učestalost od 100% u T ćelijama. TRPV1-specifični transkript je detektovan u svim tipovima ćelija, pokazujući učestalost od 100% u monocitima, NK ćelijama i T ćelijama, i učestalost od 90% u neutrofilima i 80% u B ćelijama.

Što se tiče relativne ekspresije RNK, u poređenju sa odgovarajućim frekvencijama, TRP kanali su otkrili obrazac ekspresije koji je više specifičan za tip ćelije, što je vidljivo poređenjem odgovarajućih vrednosti Δct u različitim analiziranim tipovima ćelija (Slika 1B). Na primjer, TRPP3 je detektovan sa frekvencijom od 100% u svim tipovima ćelija, ali je jasno otkrio najviši nivo ekspresije u monocitima.

Nasuprot tome, TRPV2 kanal je otkriven u svim ispitivanim tipovima ćelija, sa uporedivo visokim nivoom ekspresije RNK, kao i visokom frekvencijom. Isto tako, nivoi transkripta TRPV1 bili su slični u svim ispitivanim tipovima ćelija (Slika 1B).

2.2. TRPV1 površinska ekspresija na neutrofilima

Trenutno saznanje o funkciji TRPV1 u ljudskim neutrofilima je još uvijek nejasno. Da bismo dalje istražili uloge TRPV1 u ljudskim neutrofilima, zatim smo istražili da li je kanal TRPV1 eksprimiran na površini primarnih ljudskih neutrofila koristeći protočnu citometriju živih stanica (slika 2).

Izolovani neutrofili su obojeni na CD15 kao površinski marker za neutrofile (Slika 2A,B) i istovremeno obojeni antitijelom podignutim na epitop u prvoj ekstracelularnoj petlji proteina TRPV1 (Slika 2B) ili odgovarajućom kontrolom izotipa, pri čemu potonji služi kao surroginska slika (Slika 2B). 2A). Unutar CD15+ populacije analiziran je intenzitet fluorescencije za FITC. Bojenje neutrofila antitijelom TRPV1 dovelo je do jasno prepoznatljivog fluorescentnog signala u poređenju sa kontrolom izotipa, čime je potvrđena površinska ekspresija TRPV1 u primarnim ljudskim neutrofilima (Slika 2C). Analiza neutrofila od četiri pojedinačna donora otkrila je uporedivu površinsku ekspresiju TRPV1 (slika 2D).

2.3. [6]-Gingerol indukovano povećanje intracelularnog Ca2+

Pošto će ligandom indukovana aktivacija TRPV1 rezultirati prilivom Ca2+, [23] intracelularne koncentracije Ca2+ neutrofila su određene preko Ca2+-osjetljive boje Fura-2. Na osnovu naših prethodnih nalaza [9] odabrana je koncentracija od 50 nM dobro poznatog TRPV1 liganda [6]-gingerola i vrijeme inkubacije od 2 h. Analize su pokazale da je inkubacija neutrofila sa 50 nM [6]-gingerola rezultirala povećanjem intracelularnih koncentracija Ca2+ koje su u prosjeku iznosile 18,4% ± 1,0% od maksimalne vrijednosti, utvrđene primjenom 1 μM jonofora jonomicina. Povećanje izazvano DMSO iznosilo je 4,7% ± 1,2% (Slika 3).

2.4. Utjecaj [6]-Gingerola na ekspresiju TRPV1

Zatim smo imali za cilj da analiziramo uticaj stimulacije TRPV1 [6]-gingerolom na ekspresiju TRPV1 na nivou transkripta putem q-RTPCR, kao i na nivou površinskog proteina putem bojenja živih ćelija. U tu svrhu, ljudski neutrofili su inkubirani sa 50 nM [6]-gingerola tokom 2 h i odgovarajući nivoi ekspresije su kvantifikovani.

Ova inkubacija od 2 sata nije uticala ni na transkript TRPV1 ni na nivoe proteina (slika 4), a takođe se nije promenila, osim za IL6, IL17A, IL24, C5 i GDF5, istražena RNA ekspresija zajedničkih gena citokina i hemokina (slika S1, tabela S2, prateće informacije).

2.5. Utjecaj [6]-Gingerola na ekspresiju površinskih markera neutrofila

Isecite Jinkui Shenqi pilule na komade, tačno izmerite približno 2,0 g uzorka i prenesite ga u konusnu tikvicu sa čepom. Dodajte 25 mL 70% metanola, izmerite ukupnu masu i izvršite ultrazvučnu ekstrakciju (300 W, 40 kHz) tokom 35 minuta. Nakon hlađenja na sobnu temperaturu, nadopunite izgubljenu težinu sa 70% metanola i dobro protresite. Filtrirajte otopinu kroz mikroporoznu membranu od 0,45 μm da biste dobili testnu otopinu.

 

Provedeno je skeniranje pune talasne dužine (190–400 nm) da bi se odabrala talasna dužina detekcije. Iako moronizid i loganin imaju maksimalnu apsorpciju na 230-240 nm, ova talasna dužina pati od visokog osnovnog šuma. Talasna dužina od 254 nm osigurava stabilan odgovor i niske pozadinske smetnje. Paeonol, cimetna kiselina, akteozid i 7-hidroksikumarin proizvode stabilnu ultraljubičastu apsorpciju na 254 nm. Stoga je 254 nm odabrano kao objedinjena talasna dužina detekcije za višekomponentnu sinhronu analizu.

 

Među svim prirodnim biljnim sirovinama,Cistanche tubulosa (Desertliving Cistanche)ističe se kao biljka sanajveći sadržaj akteozidaglobalno. Kao osnovni feniletanoidni glikozid, akteozid je poznat po antiinflamatornom, antioksidativnom, neuroprotektivnom i imunološkom regulaciji. Naša tvornica specijalizirana je za ekstrakt Cistanche tubulosa visoke čistoće, koji sadrži daleko veće razine akteozida i drugih aktivnih sastojaka od uobičajenih biljnih materijala, što ga čini idealnom sirovinom za razvoj vrhunskih dodataka prehrani, funkcionalne hrane, biljnih napitaka i proizvoda za njegu kože za europsko i američko tržište.

 

 

Acteoside, komponenta s potpisom našeg ekstrakta Cistanche tubulosa, pruža višestruke osnovne prednosti koje odgovaraju zdravstvenim zahtjevima europskih i američkih potrošača: protiv upale, jačanje imuniteta, antihipoksiju, uklanjanje slobodnih radikala, popravak DNK i zaštitu jetre. U kombinaciji sa ehinakozidom (antioksidans, neuroprotekcija, kardiovaskularna zaštita) i polisaharidima (regulacija imuniteta), naš ekstrakt integriše sve glavne tokove efikasnosti vrhunskih biljnih sastojaka navedenih, uključujućiprotuupalno, antibakterijsko, antioksidativno, imunoregulacija i kardiovaskularna zaštita.