Kloniranje gena, funkcionalna identifikacija, struktura i analiza ekspresije saharozne sintaze iz Cistanche Tubulosa Ⅲ

4 Analiza ekspresije CtSus u različitim dijelovima Cistanche tubulosa iu sistemu ćelijske kulture pod stresom od suše

4.1 Analiza ekspresije CtSus u različitim dijelovima Cistanche tubulosa

In vitro eksperimenti transformacije cijele ćelije i eksperimenti enzimske katalitičke reakcije potvrdili su da protein kodiran CtSus genom ima sposobnost da katalizira sintezu UDP-glukoze. Kako bi se dalje istražila korelacija između ovog gena i biosinteze glikozidnih jedinjenja u Cistanche tubulosa, nivo ekspresije ovog gena u različitim dijelovimaCistanche tubulosaje analiziran.

PRODAJA VISOKOKVALITETNE SIROVINE CISTANCHE

Služba podrške Wecistanche-Kontaktirajte nas za informacije o popustu:

Email:wallence.suen@wecistanche.com

Whatsapp/tel:+86 15292862950

Echinacosideje najreprezentativniji glikozidni spoj u Cistanche tubulosa, a njegov sadržaj može doseći više od 30% suhe težine biljaka Cistanche tubulosa [23]. Istraživačka grupa je prethodno mjerila sadržaj ehinakozida u različitim dijelovima biljaka Cistanche tubulosa, a specifičan učinak bio je: sadržajechinacoside in different tissues was haustorium>underground part>>vazdušni deo; među njima je najveći sadržaj ehinakozida u haustoriju. Kvantitativni PCR fluorescencije u realnom vremenu je izveden korištenjem cDNA iz različitih dijelova Cistanche tubulosa kao šablona, ​​a rezultati su analizirani od strane 2–ΔΔCT metoda, te je urađena diferencijalna analiza. Rezultati su prikazani na slici 4A. Nivo ekspresije CtSus gena u haustoriju bio je najviši, 1,5 puta veći od nadzemnog dijela, a nivo ekspresije u podzemnom dijelu bio je značajno veći od onog u nadzemnom dijelu, što je u skladu sa obrascem akumulacije feniletanol glikozida. predstavljen ehinakozidom u različitim dijelovimaCistanche tubulosa.

Slika 4 Relativni nivoi ekspresije CtSus u različitim dijelovima C. tubulosa iu ćelijama suspenzije tretiranim PEG6000. O: Relativni nivo ekspresije CtSus u različitim delovima C. tubulosa; B: Relativni nivo ekspresije CtSus u ćelijama suspenzije C. tubulosa tretiranih PEG6000 u različitim vremenskim tačkama n=3, 𝑥̅± s.*P ＜ 0,05,***P ＜ 0,001

VISOKOKVALITETNE SIROVINE CISTANCHE

4.2 Analiza ekspresije CtSus u ćelijama suspenzije Cistanche deserticola u uslovima stresa od suše

Preliminarna istraživanja na projektu su to pokazalastres od suše izazvan PEG6000moguznačajno povećatithenakupljanje feniletanol glikozidau ćelijama suspenzije Cistanche. Od 3 do 9 dana nakon indukcije, sadržaj ehinaceaside se značajno povećao. Od 12. do 15. dana,stopa rasta ehinaceasidesadržaj se usporio i dostigao maksimalnu vrijednost 15. dana. Zatim, kako se vrijeme kulture povećavalo, sadržaj ehinaceaside se značajno povećao. Sadržaj fruktozida se postepeno smanjivao [24]. Na osnovu ovog istraživanja, ovaj rad je koristio cDNK netretiranih ćelija suspenzije Cistanche deserticola i PEG6000-indukovanih ćelija suspenzije Cistanche deserticola kao šablona za provođenje kvantitativne PCR detekcije fluorescencije u realnom vremenu za ispitivanje CtSus gena u suspenziji Cistanche deserticola. ćelije u uslovima stresa od suše. promene nivoa ekspresije. Rezultati su prikazani na slici 4B. U ćelijama suspenzije Cistanche deserticola indukovanim PEG6000, ekspresija CtSus se značajno povećala 6. dana nakon indukcije, i dostigla najvišu vrednost 9. dana, a zatim se vratila na isti nivo kao i kontrola. grupe istog nivoa. Navedeni rezultati pokazuju da stres od suše može značajno povećati ekspresiju gena CtSus u ćelijskoj liniji suspenzije Cistanche deserticola, što je u skladu sa uzorkom akumulacije ehinaceaside pod stresom od suše. Međutim, vršna ekspresija CtSus gena pojavljuje se ranije od vrha sadržaja ehinaceasida, jer je aktivni donor glikozila sintetiziran CtSus katalizom važan prekursor potreban za reakciju glikozilacije u više koraka u kasnijem biosintetskom putu ehinaceaside. , stoga se spekuliše da će organizmi nakon što su podvrgnuti stresu od suše prvenstveno mobilizirati gene povezane s primarnim metabolizmom kako bi postigli akumulaciju aktivnih donora, a zatim ostvarili akumulaciju važnih sekundarnih metabolita.

VISOKOKVALITETNE SIROVINE CISTANCHE

5 Studija trodimenzionalne strukture CtSus proteina i analiza ključnih aktivnih mesta

Na osnovu funkcije CtSus u katalizaciji proizvodnje glikozil donora UDP-glukoze, dalje je proučavana strukturna osnova katalitičke aktivnosti CtSus. Online alat SOPMA korišten je za predviđanje sekundarne strukture proteina. Rezultati su pokazali da sekundarna struktura CtSus sadrži 55,28% -heliksa, 25,47% nasumičnih zavojnica, 12,80% produženih niti i 6,46% -zavoja (slika 5A), što ukazuje da su -helices najvažnije sekundarne strukturne jedinice u CtSus proteinu, slijede nasumične spirale, koje također čine veliki dio proteina. Produženi niti i zavoji su raspoređeni po proteinu. Prema postojećim studijama, saharoza sintaza obično postoji u obliku tetramera, koji se smatra njegovim aktivnim oblikom. Stoga je ovaj rad dalje koristio AlphaFold2 za predviđanje strukture CtSus proteina i dobio njegovu trodimenzionalnu strukturu proteinskih tetramera. Poređenje baze podataka PDB (Protein Data Bank) je pokazalo da sličnost sekvenci između Arabidopsis thaliana saharoze sintaze AtSus1 (PDBID 3S28) i CtSus može doseći 77,93%. Predviđena struktura CtSus upoređena je sa trodimenzionalnom strukturom AtSus1, a vrijednost srednje kvadratne devijacije (RMSD) nakon superpozicije proteina bila je 1,11 Å, što ukazuje da su prostorne strukture ove dvije strukture vrlo konzistentne (Slika 5B).

Prijavljena struktura kristalnog kompleksa protein-ligand Arabidopsis AtSus1 sa UDP i fruktozom (PDBID3S29) korištena je kao šablon [16] za analizu načina vezivanja CtSus sa UDP i fruktozom. Rezultati molekularnog spajanja prikazani su na slici 5C. Može se primijetiti da su džepovi za vezivanje supstrata AtSus1 i CtSus vrlo slični u pogledu tipa aminokiselina, prostorne distribucije i konfiguracije, a preklapanje je veliko, što dokazuje da je sekvenca saharoze sintaze visoko očuvana u biljkama. Konformacije dva liganda, UDP i fruktoze, u džepu za vezivanje proteinskog supstrata prikazane su na slici 5D. Najpovoljnija konformacija molekularnog spajanja UDP i CtSus ima dobro preklapanje sa konformacijom UDP u AtSus1-UDP kristalnom kompleksu, što dokazuje tačnost rezultata molekularnog spajanja. Interakcija između UDP-a i ključnih aminokiselinskih ostataka u džepu za vezivanje proteinskog supstrata prikazana je na slici 5E. UDP i CtSus su uglavnom povezani zajedno vodoničnim vezama i hidrofobnim interakcijama. Ključni aminokiselinski ostaci u džepu za vezivanje supstrata uključuju: eu294, Gly301, Met576, Arg578, Lys583, Gln646, Asn652, Leu677, Thr678 i Glu681.

Reference

[1] Pjesma ZH, Lei L, Tu PF. Napredak u istraživanju farmakološke aktivnosti u biljkama CistancheHoffinga. et Link [J]. Chin Tradit Herb Drugs (中草药), 2003, 34: 113-115.

[2] Liu WJ, Liu Y, Song QQ, et al. Poređenje hemoma između kultivisane i divlje Cistanchetubulose pomoću ¹H-NMR spektroskopije [J]. Kina J Chin Mater Med (中国中药杂志), 2018, 43:3506-3512.

[3] Song Y, Zeng K, Jiang Y, et al. Cistanches Herba, od ugrožene vrste do velikog brenda kineske medicine [J]. Med Res Rev, 2021, 41: 1539-1577.

[4] Liu Y, Wang H, Yang M, et al. Polisaharidi Cistanche deserticola štite PC12 ćelije od OGD/RP-indukovanih povreda [J]. Biomed Pharmacother, 2018, 99: 671-680.

[5] Yin Y, Huang J, Gu X, et al. Evolucija enzima interkonverzije biljnih nukleotida i šećera [J].PLoS One, 2011, 6: e27995.

[6] Bar-Peled M, O'Neill MA. Formiranje šećera u biljnim nukleotidima, međusobna konverzija i spašavanje reciklažom šećera [J]. Annu Rev Plant Biol, 2011, 62: 127-155.

[7] Guo H, Li L, Wang PG. Biohemijska karakterizacija UDP-GlcNAc/Glc{2}}epimeraze iz Escherichia coli O86:B7 [J]. Biohemija, 2006, 45: 13760-13768.

[8] Dong S, Chesnokova ON, Turnbough CL Jr, et al. Identifikacija UDP-N-acetilglukozamin4-epimeraze uključene u glikozilaciju proteina egzosporijuma u Bacillus anthracis [J]. J Bacteriol, 2009, 191: 7094-7101.

[9] Li LN, Kong JQ. Identifikacija gena saharoze sintaze na nivou transkriptoma u Ornithogalumcaudatum [J]. RSC Adv, 2016, 6: 18778-18792.

[10] Schmölzer K, Gutmann A, Diricks M, et al. Saharoza sintaza: jedinstvena glikoziltransferaza za razvoj procesa biokatalitičke glikozilacije [J]. Biotechnol Adv, 2016, 34: 88-111.

[11]Cardini CE, Leloir LF, Chiriboga J. Biosinteza saharoze [J]. J Biol Chem, 1955,214: 149-155.[12]Stein O, Granot