Abstract

CiljZa ispitivanje učinka na snižavanje mokraćne kiseline i procjenu sigurnosti ehinakozida (Ech) ekstrahiranog izCistanche tubulosa. MetodeU testu akutne toksičnosti KM miševima je oralno davan Ech u maksimalnoj koncentraciji dva puta dnevno radi promatranja akutne toksičnosti. Model pacova hiperurikemije (HUA) je uspostavljen upotrebom 1,5 g·kg⁻¹ kalijum oksonata + 0.1 g·kg⁻¹ adenina. Pacovi modela HUA su nasumično podijeljeni u modelsku grupu, grupu alopurinola (30 mg·kg⁻¹) i grupe sa niskim, srednjim i visokim dozama Ech (50, 75, 100 mg·kg⁻¹), sa normalnom kontrolnom grupom (n=10 po grupi). Lijekovi su davani intragastrično jednom dnevno tokom 28 uzastopnih dana. Nakon davanja, pacovi su žrtvovani, a serum je sakupljen da bi se otkrili relevantni biohemijski indikatori i nivoi ksantin oksidaze (XOD); uočene su bubrežne histopatološke promjene. Organi su vagani da bi se izračunali koeficijenti organa; otkriveni su nivoi ekspresije srodnih gena i proteina u bubrežnom tkivu.RezultatiU testu akutne toksičnosti nisu uočene očigledne toksične reakcije. Ech je značajno smanjio nivoe mokraćne kiseline u serumu, značajno poboljšao bubrežnu funkciju i bubrežne tubularne/intersticijske lezije kod pacova modela HUA, i značajno regulisao nivoe transkripcije i ekspresije proteina gena povezanih sa transporterom urata u bubrežnom tkivu.ZaključakEfekat snižavanja mokraćne kiseline Ech kod pacova modela HUA može biti povezan sa smanjenjem proizvodnje mokraćne kiseline in vivo, regulacijom bubrežne funkcije i modulacijom ekspresije transportera urata, uz povoljnu sigurnost.Ključne riječi: Cistanche tubulosa; Echinacoside; hiperurikemija; Mokraćna kiselina; Transkripcija gena; Ekspresija proteina; Mehanizam djelovanja; Procjena sigurnosti

 

 

 

Cistanche tubulosa(Schenk) R. Wight je biljka koja se obično koristi u tradicionalnoj kineskoj medicini (TCM). Kako je zabilježeno uKineska farmakopeja, nadoknađuje jang bubrega, obnavlja esenciju i krv, a klinički se koristi za impotenciju i neplodnost, nedostatak esencije i krvi, te bolove u struku i koljenima. Feniletanoid glikozidi su najzastupljenije i biološki aktivne komponente uCistanche tubulosa, pokazujući veliki potencijal za razvoj i primjenu. Naš istraživački tim je prethodno putem mrežne farmakologije i preliminarnih eksperimenata na miševima otkrio da ehinakozid (Ech) izCistanche tubulosaEkstrakt može imati efekte na snižavanje mokraćne kiseline, dok se o njegovom mehanizmu i sigurnosti rijetko prijavljuje. Ova studija uzima patogenezu hiperurikemije kao ulaznu tačku za ispitivanje farmakološkog efekta Ech na snižavanje mokraćne kiseline, s ciljem da se razjasni njegov mehanizam i procijeni njegova sigurnost.

1 Materijali i metode

1.1 Instrumenti, reagensi i životinje

7100 Automatski biohemijski analizator (Hitachi, Japan); Čitač mikroploča Multiskan GO 1510 (Thermo, SAD); BG-Power600i sistem za elektroforezu (Beijing Baijing Biotechnology Co., Ltd.); 7500 Brzi fluorescentni kvantitativni PCR sistem u realnom vremenu (Applied Biosystems, SAD).

Cistanche tubulosa extract (Ech, self-prepared, chromatographic purity >98%); kalijum oksonat, adenin (Shanghai Aladdin Biochemical Technology Co., Ltd.); setovi za testiranje kreatinina (CREA), mokraćne kiseline (UA), uree (UREA), adenozin deaminaze (ADA), alanin transaminaze (ALT), aspartat transaminaze (AST), alkalne fosfataze (ALP) (Shenzhen Mindray Bio-Medical Electronics Co., Ltd.); XOD set za analizu aktivnosti (Shanghai Macklin Biochemical Technology Co., Ltd.); antitela URAT1, GLUT9, OAT1, OAT3 (Jiangsu Qinke Biotechnology); kozji anti-zečji IgG/HRP konjugat (Beijing Zhongshan Jinqiao Biotechnology Co., Ltd., Lot: 245440113); DEPC (Amresco, SAD); M5 HiClear DL2000 DNK marker (Beijing Juhemai Biotechnology Co., Ltd.); TRIzol™ reagens (Thermo Fisher Scientific, SAD); 5× All-In-One RT MasterMix, EvaGreen Express 2× qPCR MasterMix-Low ROX (Aibimeng Biotechnology Co., Ltd.).

Četrdeset KM miševa SPF razreda (mužjaci i ženke, 18–22 g) i 90 SPF muških SD pacova (150–180 g) obezbijedio je Centar za eksperimentalne životinje Medicinskog univerziteta Xinjiang (licenca za proizvodnju br. SCXK Xin 2023-0001).

1.2 Metode i rezultati

1.2.1 Test akutne toksičnosti

Eksperimente na životinjama odobrio je Etički komitet Instituta za istraživanje droga Xinjiang (odobrenje br. IACUC-(Zhun)-2024-008, IACUC-(Zhun)-2024-009). Četrdeset KM miševa SPF razreda nasumično je podijeljeno u kontrolnu grupu i grupu za tretman (n=20, mužjak i ženka) nakon karantina i aklimatizacije. Miševi su držani na gladovanju preko noći sa slobodnim pristupom vodi prije primjene. PremaSmjernice za ispitivanje toksičnosti jedne doze tradicionalnih kineskih lijekova i prirodnih proizvoda, pripremljena je otopina maksimalne koncentracije (250 mg·mL⁻¹) koja može proći kroz iglu za gavažu od 12. KM miševima je oralno davana 40 mL·kg⁻¹ dva puta dnevno u intervalu od 4 sata, sa kumulativnom dozom od 20 g·kg⁻¹. Opća stanja, boja dlake, aktivnost, hod, mentalno stanje, izmet i urin su pažljivo promatrani u pogledu simptoma toksičnosti, vremena početka, trajanja i oporavka. Nisu uočene štetne toksične reakcije (npr. ograničena aktivnost, prostracija, bezvoljnost, smrt) u liječenoj grupi. Boja dlake, aktivnost, hod, mentalno stanje, izmet i urin ostali su normalni tokom perioda posmatranja. Tjelesna težina i unos hrane nisu pokazali značajne razlike između tretirane i kontrolne grupe. Gruba obdukcija na kraju opservacije nije otkrila abnormalnosti u volumenu, boji ili teksturi organa.

 

Slika 1. Efekti Echo tjelesne težine (AB) i uzimanja hrane (C,D) miševa

 

1.2.2 Uspostavljanje modela, grupisanje i administracija

Šezdeset mužjaka SD štakora (150-180 g) je aklimatizirano i podijeljeno u normalnu kontrolnu grupu (n=10) i grupu za modeliranje (n=50). Grupi za modeliranje je intragastrično primijenjeno 100 mg·kg⁻¹ adenin + 1.5 g·kg⁻¹ kalijum oksonata (suspendiranog u 0,5% CMC-Na) u količini od 10 mL·kg⁻¹ jednom dnevno tokom 14 dana; kontrolna grupa je primila 0,5% CMC-Na. Nakon modeliranja, sakupljena je orbitalna krv da bi se otkrila UREA, CREA i serumska mokraćna kiselina (SUA). Model se smatrao uspješnim kada su UREA, CREA i SUA bili značajno povišeni. Uspješni štakori HUA modela podijeljeni su u modelsku grupu, grupu alopurinola (30 mg·kg⁻¹) i grupe sa niskim, srednjim i visokim dozama Ech (50, 75, 100 mg·kg⁻¹) (n=10 po grupi). Da bi se održala stabilna hiperurikemija, svim grupama, osim kontrolne, intragastrično je davano 100 mg·kg⁻¹ adenin + 500 mg·kg⁻¹ kalijum oksonata (0,5% CMC-Na suspenzija) svakog jutra, i odgovarajući lijekovi svakog popodneva tokom 14 dana. Agensi za modeliranje su tada zaustavljeni, dok je primjena lijeka nastavljena još 14 dana.

1.2.3 Određivanje SUA i mokraćne kiseline (UUA) u pacovima

Nakon posljednje primjene, pacovi su gladni preko noći sa slobodnim pristupom vodi. Urin je sakupljen, centrifugiran (3×10³ r·min⁻¹, 10 min), razblažen 1:9 fiziološkim rastvorom i testiran na UUA koristeći biohemijski analizator. Krv je sakupljena pod anestezijom, a serum je odvojen (3×10³ r·min⁻¹, 10 min) za detekciju SUA. U poređenju sa kontrolnom grupom, grupa modela pokazala je značajno povećanu SUA (P<0.05) and decreased UUA (P<0.01). The allopurinol group and low-, medium-, and high-dose Ech groups had significantly reduced SUA (P<0.05); the allopurinol group and medium-/high-dose Ech groups had significantly increased UUA (P<0.05 or P<0.01).

 

Slika 2 Učinak Ech na SUA(A) i UUA(B) kod pacova modela hiperurikemije

 

1.2.4 Određivanje nivoa ADA i XOD u serumu kod pacova

ADA u serumu je mjeren biohemijskim analizatorom; XOD aktivnost je otkrivena enzimskim imunosorbentnim testom (apsorbanca na 290 nm). U poređenju sa normalnom grupom, grupa modela imala je značajno povišene ADA i XOD (P<0.01). Compared with the model group, the allopurinol group and all Ech dose groups had significantly reduced ADA (P<0.01); the allopurinol group and high-dose Ech group had significantly reduced XOD (P<0.01).

1.2.5 Određivanje nivoa UREA, CREA, ALT, AST, ALP u serumu

U poređenju sa normalnom grupom, grupa modela imala je značajno povišene vrednosti UREA i CREA (P<0.05 or P<0.01). Compared with the model group, the allopurinol group had significantly reduced UREA (P<0.01); all Ech dose groups had significantly reduced UREA and CREA (P<0.05 or P<0.01); medium-/high-dose Ech groups had significantly reduced ALT (P<0.01); low-dose Ech group had significantly increased ALP (P<0.01).

1.2.6 Određivanje koeficijenta bubrežnih organa kod pacova

Koeficijent organa=masa organa (mg)/tjelesna težina (g). U poređenju sa normalnom grupom, grupa modela imala je značajno smanjenu tjelesnu težinu natašte (P<0.01) and increased kidney and adrenal gland coefficients (P<0.05 or P<0.01). Compared with the model group, all Ech dose groups had significantly increased body weight (P<0.05); the allopurinol group and all Ech dose groups had significantly reduced kidney coefficients (P<0.01).

 

Tabela 1 Efekti Ech na nivoe UREA, CREA, ALT, AST i ALP kod pacova modela hiperurikemije (xˉ±s, n=10)

 

Grupa	Doza / mg·kg⁻¹	UREA / mmol·L⁻¹	CREA / μmol·L⁻¹	ALT / U·L⁻¹	AST / U·L⁻¹	ALP / U·L⁻¹
Kontrola	–	8.00 ± 0.71	34.11 ± 3.33	51.22 ± 3.80	109.11 ± 11.62	206.00 ± 42.20
Model	–	23.20 ± 6.05**	100.10 ± 43.59*	62.00 ± 9.64	109.10 ± 7.92	173.10 ± 27.30
Allopurinol	30	10.70 ± 1.95##	55.20 ± 13.27	52.70 ± 12.79	117.50 ± 21.71	198.40 ± 52.66
Ech	50	11.20 ± 3.33##	44.80 ± 21.01#	55.70 ± 12.59	106.10 ± 13.80	242.11 ± 55.04##
	75	9.90 ± 1.45##	41.20 ± 4.54#	46.50 ± 5.72##	102.10 ± 16.11	183.70 ± 22.31
	100	8.90 ± 1.10##	35.20 ± 2.74#	46.50 ± 5.72##	106.00 ± 15.19	195.20 ± 33.96

Napomena:U poređenju sa kontrolnom grupom: *P<0.05, **P<0.01; compared with model group: #P<0.05, ##P<0.01

 

Tabela 2. Efekti Ech na koeficijente organa kod pacova modela hiperurikemije (xˉ±s, n=10)

 

Grupa	Doza / mg·kg⁻¹	Tjelesna težina natašte / g	Koeficijent jetre	Koeficijent bubrega	Koeficijent nadbubrežne žlijezde	Koeficijent slezine	Thymus Coefficient
Kontrola	–	403.6 ± 28.0	26.92 ± 3.15	6.57 ± 0.55	0.14 ± 0.04	1.88 ± 0.26	1.07 ± 0.15
Model	–	352.5 ± 38.5**	26.60 ± 1.78	11.52 ± 1.67**	0.18 ± 0.03*	2.12 ± 0.23	1.03 ± 0.17
Allopurinol	30	367.5 ± 26.3	25.76 ± 1.14	7.93 ± 0.51##	0.16 ± 0.03	1.93 ± 0.35	1.08 ± 0.27
Ech	50	392.3 ± 28.3#	27.04 ± 2.14	8.06 ± 0.54##	0.16 ± 0.04	2.09 ± 0.24	1.09 ± 0.19
	75	388.4 ± 34.8#	26.78 ± 2.37	7.80 ± 0.78##	0.16 ± 0.02	2.00 ± 0.20	0.99 ± 0.25
	100	386.3 ± 41.4#	25.91 ± 1.46	7.58 ± 0.33##	0.18 ± 0.03	2.09 ± 0.28	1.17 ± 0.31

Napomena:U poređenju sa kontrolnom grupom: *P<0.05, **P<0.01; compared with model group: #P<0.05, ##P<0.01

 

 

 

1.2.7 Histopatološko promatranje bubrega pacova (HE bojenje)

Bubrežna tkiva su fiksirana, dehidrirana, ugrađena, isječena (4 μm), obojena HE i zapečaćena. Grupa modela pokazala je odvajanje bubrežnih tubularnih epitelnih stanica, nekrotične i inflamatorne ćelijske infiltracije i fokalnu inflamatornu infiltraciju u bubrežnom intersticiju. Grupa koja je primala alopurinol pokazala je blage lezije; Grupe za liječenje Ech pokazale su ublaženo odvajanje epitelnih stanica, nekrozu i inflamatornu infiltraciju.

 

 

Slika 4 HE bojenje slike fratkinog tkiva kontrolne grupe (A), grupe modela (B), alopurinolne grupe (C, D), niske (E) i visoke
(F)dozne grupeEch(×400)

 

1.2.8 Proteinska ekspresija URAT1, GLUT9, OAT1, OAT3 u bubrezima pacova

Urađena je imunohistohemija da bi se otkrila ekspresija proteina (integrisana optička gustina, IOD). U poređenju sa normalnom grupom, grupa modela imala je značajno povećanu regulaciju URAT1 i GLUT9 (P<0.01) and downregulated OAT1 and OAT3 (P<0.05). Compared with the model group, the allopurinol group and all Ech dose groups had significantly downregulated URAT1 and GLUT9 (P<0.05, P<0.01) and upregulated OAT1 (P<0.05, P<0.01); the allopurinol group and medium-/high-dose Ech groups had significantly upregulated OAT3 (P<0.05, P<0.01).

 

Slika 5. Efekti vrijednosti EchonURAT1/IOD(A), GLUT9/IODvrijednosti(B),OAT1/IODvrijednosti(C),iOAT3/IODvrijednosti(D)u
renaltissueofhyperurikemiamodelrats

 

Slika 6. Efekti Ech na ekspresiju URAT1 bubrega kod pacova sa modelom hiperurikemije

(Kontrolna grupa (A), grupa modela (B), alopurinolna grupa (C) i 50, 75, 100 mg·kg⁻¹ Ech grupe (D–F); IHC ×400)

 

Slika 7. Efekti Ech na ekspresiju GLUT9 bubrega kod pacova sa modelom hiperurikemije

(Kontrolna grupa (A), grupa modela (B), alopurinolna grupa (C) i 50, 75, 100 mg·kg⁻¹ Ech grupe (D–F); IHC ×400)

Slika 8. Efekti Ech na ekspresiju OAT3 bubrega kod pacova modela hiperurikemije

(Kontrolna grupa (A), grupa modela (B), alopurinolna grupa (C) i 50, 75, 100 mg·kg⁻¹ Ech grupe (D–F); IHC ×400)

Slika 9. Efekti Ech na ekspresiju OAT1 bubrega kod pacova modela hiperurikemije

(Kontrolna grupa (A), grupa modela (B), alopurinolna grupa (C) i 50, 75, 100 mg·kg⁻¹ Ech grupe (D–F); IHC ×400)

 

 

1.2.9 mRNA Ekspresija URAT1, GLUT9, OAT1, OAT3 u bubrezima pacova

Ukupna RNK je ekstrahirana i reverzno transkribirana; qPCR je izveden metodom 2⁻ΔΔCt. U poređenju sa normalnom grupom, grupa modela imala je značajno povećanu regulaciju URAT1 i GLUT9 mRNA (P<0.05) and downregulated OAT1 and OAT3 mRNA (P<0.05). Compared with the model group, the allopurinol group and all Ech dose groups had significantly downregulated URAT1 mRNA (P<0.05); the allopurinol group and low-/medium-dose Ech groups had significantly downregulated GLUT9 mRNA (P<0.05); the allopurinol group and all Ech dose groups had significantly upregulated OAT1 and OAT3 mRNA (P<0.05).

 

Tabela 3 Prajmer sekvence

 

Primer naziv	Slijed (5′ do 3′)	Veličina proizvoda
URAT1-	F: GTTCCCATGGCCTCCAGATTR: CATATGCATGCCACACAGCC	121 bp
GLUT9	F: TCTGCCTTGGCTGAGTATTGAR: ATGTGTCCCCCACATCATTGT	2147 bp
OAT1	F: TGTGAAGCCCTTCCGTTCTCR: TGTGAAGCCCTTCCGTTCTC	218 bp
OAT3	F: TACCTGCATGTGACCTTGCTGR: GAGACACTTCTCAGGCTTCCC	171 bp
-Aktin	F: CCCATCTATGAGGGTTACGCR: TTTAATGTCACGCACGATTTC	150 bp

 

1.2.10 Statistička analiza

Podaci su analizirani pomoću SPSS 20.0, izražene kao srednja vrijednost ± standardna devijacija (x̄±s). Jednosmjerna ANOVA korištena je za grupna poređenja, a LSD ili Tamhaneov T2 za post-hoc testove. P<0.05 was considered statistically significant.

Slika 5. Efekti vrijednosti EchonURAT1/IOD(A), GLUT9/IODvrijednosti(B),OAT1/IODvrijednosti(C) i OAT3/IODvrijednosti(D) u bubrežnom tkivu hiperurikemije modela pacova

 

2 Diskusija

Perzistentna hiperurikemija uzrokuje oštećenje bubrega uzrokovano mokraćnom kiselinom i mijenja biomarkere bubrežne funkcije. Ova studija je uspostavila model HUA štakora koristeći adenin u kombinaciji sa kalijum oksonatom, sa UREA, CREA i SUA kao ključnim indikatorima. Rezultati su pokazali da Ech izCistanche tubulosapoboljšana bubrežna funkcija i smanjena SUA kod pacova modela HUA, ispoljavajući terapeutske efekte. Hiperurikemija nastaje zbog prekomjerne proizvodnje mokraćne kiseline i poremećaja izlučivanja. Hepatična XOD i ADA su ključni enzimi u sintezi mokraćne kiseline; prekomjerna proizvodnja je glavni uzrok HUA. Otprilike dvije trećine dnevne mokraćne kiseline izlučuje se putem bubrega, zbog čega je disfunkcija bubrežnog izlučivanja primarni pokretač. URAT1 i GLUT9 posreduju u reapsorpciji mokraćne kiseline, dok OAT1 i OAT3 olakšavaju izlučivanje mokraćne kiseline – svi su ključni ciljevi za razvoj lijekova za snižavanje mokraćne kiseline. Ech je značajno smanjio hepatičku ADA i XOD, smanjio renalni URAT1/GLUT9 (protein i mRNA) i povećao OAT1/OAT3 (protein i mRNA), što ukazuje da njegov efekat snižavanja mokraćne kiseline djeluje kroz smanjenje sinteze i regulaciju transportera. U ispitivanju akutne toksičnosti kod miševa nije uočena smrtnost niti očigledna akutna toksičnost. Ech je poboljšao bubrežnu funkciju i snizio jetreni ALT kod HUA štakora bez uticaja na AST ili koeficijente organa, potvrđujući povoljnu sigurnost. U zaključku, Ech ispoljava značajne efekte na snižavanje mokraćne kiseline kod pacova HUA izazvanih adenin-kalijum oksonatom supresijom ADA/XOD-posredovane sinteze mokraćne kiseline, štiteći funkciju bubrega i balansirajući ekspresiju transportera urata, uz pouzdanu sigurnost za potencijalnu kliničku primjenu.

Reference

Zhang MH, Du JW, Zhang T, et al. Mehanizam Bixie Fenqing Wan-a u intervenciji pacova sa hiperurikemijom regulacijom ekspresije transportera urata [J]. Kineski časopis eksperimentalnih tradicionalnih medicinskih formula, 2023, 29(3): 1–8.

Niu YF, Zhou YF, Lin H, et al. Inhibicija 3,5,2′,4′-tetrahidroksihalkona na proizvodnju mokraćne kiseline kod hiperurikemičnih miševa izazvanih hipoksantinom [J]. Biološki i farmaceutski bilten, 2018, 41(1): 99–105.

Frédéric L. Gout: ažuriranje[J]. Journal of Bone and Joint Surgery, 2019, 86(1): 103–115.

Takeo N, Kouhei O, Sho S, et al. Funkcionalna saradnja URAT1 (SLC22A12) i URATv1 (SLC2A9) u bubrežnoj reapsorpciji urata[J]. Transplantacija nefrološke dijalize, 2013, 28(3): 603–611.

Lee SY, Cho SS, Han KM, et al. Korejski crveni ginseng poboljšava nivoe mokraćne kiseline u serumu kroz smanjenje URAT1 i povećanje OAT1 i OAT3[J]. Biološki i farmaceutski bilten, 2024, 47(11): 1876–1882.

Falah K, Zhang P, Nigam AK, et al. In vivo regulacija prirodnih proizvoda malih molekula, antioksidansa i nutrijenata pomoću OAT1 i OAT3[J]. Nutrients, 2024, 16(14): 2242.

 

Visok sadržajCistancheIzvor zaliha za snižavanje mokraćne kiseline

Za institucije, praktičare i pojedince na koje se fokusirabiljne terapije za smanjenje mokraćne kiselinei liječenje hiperurikemije,visoke čistoćeCistanche tubulosaekstraktje pouzdana prirodna sirovina sa provjerenom djelotvornošću.

Osnovne prednosti izvora snabdevanja

Visoko standardizirane aktivne komponente

Ehinakozid (Ech): veće ili jednako 10%–40%

Akteozid: veći ili jednak 4%-16%

Ukupni feniletanoidni glikozidi: Veći ili jednaki 40%–85% (Zadovoljava specifikacije za hranu i ekstrakte za istraživanje i razvoj i razvoj proizvoda)

 

Cistanche baza i tvornica

Kontaktirajte sada

 

Služba podrške Wecistanche-Za više detalja o saradnji
Email:wallence.suen@wecistanche.com

 

Provjereni mehanizam za snižavanje mokraćne kiseline

Inhibira XOD/ADA za smanjenje sinteze mokraćne kiseline

Reguliše URAT1/GLUT9/OAT1/OAT3 kako bi potaknuo izlučivanje mokraćne kiseline

Štiti funkciju bubrega i ublažava oštećenje bubrega uzrokovano hiperurikemijom

Sigurno i dobro podnošljivo

Test akutne toksičnosti: Nema očitih nuspojava pri visokim dozama

Nema značajnih oštećenja jetre, bubrega ili glavnih organa

U skladu sa zahtjevima za ishranu i dijetetske dodatke

Autoritativna veza za snabdevanje

https://www.xjcistanche.com/cistanche-extract-product/herbal-cistanche-dietary-supplement-capsules.html

 

Ovaj izvor pruža standardizovaneCistanche tubulosaekstrakt, kapsule, tablete, oralne tekućine i usluge obrade po narudžbi, podržavajući razvoj biljnih proizvoda za snižavanje mokraćne kiseline, klinička istraživanja i formulaciju dodataka prehrani.