Sveobuhvatna identifikacija i hemijska analiza divljeg Cistanche Senegalensis u Keniji: morfologija, DNK barkodiranje i fitohemija

2. Molekularna identifikacija pomoću DNK barkodiranja

Molekularna identifikacija divljineCistanche uzorci iz Kenijea njihove biljke domaćine izvedene su korištenjem dva para prajmera, ITS2F/ITS3R i psbA-trnH [11]. Oba kenijska divljeg uzorka Cistanchea uspješno su uparena kaoCistanche tubulosau sistemu DNK barkodiranja tradicionalne kineske medicine, sa sličnošću sekvence od 96,7%. U bazi podataka GenBank, sekvence su odgovarale više vrsta, pokazujući 100% sličnost sa njimaCistanche senegalensis i preko 98% sličnosti saCistanche tubulosa. Biljka domaćin nije se poklapala ni sa jednim zapisom u sistemu barkodiranja DNK tradicionalne kineske medicine, ali je pokazala veliku sličnost (97,55%) sa vrstama AmaranthaceaeSericocomopsis hildebrandtiiGenBank.

Da dodatno razjasnimo odnos, najsličnijiCistanche senegalensispsbA-trnH sekvenca (Pristup: LT715293) i ITS2 sekvenca (Pristup: LT715483) preuzete su sa GenBank-a, zajedno sa ITS2 i psbA sekvencama četiri kineske vrste Cistanche. Filogenetska stabla su konstruisana korišćenjem MEGA X softvera (vidi sliku 3). Kao što je prikazano na slici 3, uzorci kenijskih divljih Cistanche (K1, K2) skupljaju se u istoj grani kaoCistanche senegalensis, s genetskom udaljenosti od 0-0,0016, što sugerira da možda pripadaju istoj vrsti. Nasuprot tome, oni spadaju u različite grane od četiri kineske vrste Cistanche, što ukazuje na značajne razlike među vrstama. Komparativno, filogenetska udaljenost između K1, K2 iCistanche tubulosaje relativno blizu (0,0089–0,0098), dok je udaljenost doCistanche deserticolaje mnogo veća (0,1193–0,2961). Ovo sugerira da je kenijska divlja Cistanche bliža srodniciCistanche tubulosa, što implicira zajedničko porijeklo, ali kasniju divergenciju zbog različitih pritisaka okoline i evolucijskih procesa.

 

 

Cistanche tubulosa

3. Određivanje sadržaja aktivnih sastojaka i analiza otiska prsta u različitim uzorcima Cistanche

Tečna hromatografija visokih performansi (HPLC) korištena je za istovremeno određivanje sadržaja pet feniletanoidnih glikozida i pet saharidnih alkohola u dva uzorka divljeg kenijskog Cistanchea, kao i kineskogCistanche tubulosaiCistanche deserticola(vidi tabele 1 i 2).

Što se tiče feniletanoidnih glikozida, ehinakozid i akteozid su pronađeni na konstantno visokim razinama u svim uzorcima Cistanchea, što podržava razloge za njihov odabir kao markerskih spojeva u kineskoj farmakopeji. Posebno,Cistanche senegalensisiz Kenije ima značajno veći sadržaj tubulozida A, što ga razlikuje od kineske vrste Cistanche i može poslužiti kao karakteristična karakteristika kenijskog Cistanchea.

Što se tiče ukupnog sadržaja alkohola saharida,Cistanche deserticolapokazao mnogo više nivoe od obaCistanche tubulosaiCistanche senegalensis. Betain nije otkriven uCistanche tubulosa, iako je sadržaj fruktoze, manitola i glukoze bio sličan onima uCistanche deserticola, osim mnogo nižeg sadržaja saharoze. Nasuprot tome,Cistanche senegalensissadržavao betain koji se može detektovati, ali ne i glukozu, a nivoi drugih saharidnih alkohola takođe su se značajno razlikovali od kineske vrste Cistanche.

Cistanche tubulosa svježi korijen

Kontaktirajte sada upoznajte farmere cistanche u Kini

 

 

 

Tabela 1 Sadržaj pet feniletanoidnih glikozida u biljkama Cistanche (%, n=3, srednja vrijednost ± SD). GH: C. tubulosa; HM: C. deserticola; "-" označava da nije otkriveno

ID uzorka	Porijeklo	Forma rasta	Datum prikupljanja	Echinacoside	Tubulozid A	Acteoside	Izoakteozid	2'-Acetilakteozid	Ukupno
GH1	Yutian, Xinjiang	Kultivisano	2023.11	9.47 ± 0.070	0.63 ± 0.003	4.34 ± 0.032	1.43 ± 0.007	0.11 ± 0.001	15.98
GH2	Yutian, Xinjiang	Kultivisano	2023.11	13.31 ± 0.347	0.64 ± 0.012	4.34 ± 0.032	1.33 ± 0.07	0.17 ± 0.001	19.52
GH3	Yutian, Xinjiang	Kultivisano	2023.11	24.64 ± 0.043	0.84 ± 0.014	5.75 ± 0.091	2.06 ± 0.038	0.06 ± 0.003	33.35
HM1	Turpan, Xinjiang	Kultivisano	2023.11	1.93 ± 0.094	0.04 ± 0.003	0.15 ± 0.026	0.03 ± 0.006	0.02 ± 0.001	2.17
HM2	Turpan, Xinjiang	Kultivisano	2023.11	2.76 ± 0.140	0.05 ± 0.003	0.16 ± 0.018	0.03 ± 0.004	0.03 ± 0.001	3.05
HM3	Turpan, Xinjiang	Kultivisano	2023.11	2.44 ± 0.174	0.06 ± 0.004	0.15 ± 0.008	0.03 ± 0.002	0.02 ± 0.001	2.69
K1	Kenija	Wild	2023.08	3.83 ± 0.027	2.69 ± 0.034	2.70 ± 0.27	0.27 ± 0.003	0.74 ± 0.001	10.23
K2	Kenija	Wild	2023.08	1.46 ± 0.018	1.51 ± 0.001	0.15 ± 0.001	0.08 ± 0.001	0.03 ± 0.001	3.23

---

Tabela 2 Sadržaj šećernih alkohola i betaina u biljkama Cistanche (%, n=3, srednja vrijednost ± SD)

ID uzorka	Porijeklo	Forma rasta	Datum prikupljanja	Betain	Fruktoza	Manitol	Glukoza	Saharoza	Ukupno
GH1	Yutian, Xinjiang	Kultivisano	2023.11	-	11.66 ± 0.084	5.56 ± 0.112	5.45 ± 0.054	2.29 ± 0.042	24.96
GH2	Yutian, Xinjiang	Kultivisano	2023.11	-	8.75 ± 0.061	4.94 ± 0.159	3.34 ± 0.081	1.70 ± 0.092	18.73
GH3	Yutian, Xinjiang	Kultivisano	2023.11	-	9.44 ± 0.107	5.09 ± 0.089	4.31 ± 0.455	1.80 ± 0.149	20.29
HM1	Turpan, Xinjiang	Kultivisano	2023.11	6.62 ± 0.136	7.60 ± 0.119	3.22 ± 0.049	3.55 ± 0.150	23.18 ± 0.425	44.16
HM2	Turpan, Xinjiang	Kultivisano	2023.11	6.46 ± 0.105	7.82 ± 0.104	4.82 ± 0.038	4.98 ± 0.104	28.57 ± 0.449	52.65
HM3	Turpan, Xinjiang	Kultivisano	2023.11	6.65 ± 0.148	8.29 ± 0.159	3.90 ± 0.084	4.88 ± 0.009	26.90 ± 0.629	50.62
K1	Kenija	Wild	2023.08	9.41 ± 0.021	5.31 ± 0.333	7.06 ± 0.045	-	8.44 ± 0.102	30.22
K2	Kenija	Wild	2023.08	6.29 ± 0.034	-	-	-	-	6.29

---

Napomena:
"-" označava da nije otkriveno.
GH =Cistanche tubulosa, HM =Cistanche deserticola, K=Kenija divljaCistanche.

 

Kromatografski otisci Cistanche uzoraka iz različitih regija prikazani su na slici 4, a rezultati analize sličnosti otisaka prstiju prikazani su u tabeli 3. Sličnost između uzorka kenijske divlje Cistanche K1 i uzoraka GH1–GH3 (Cistanche tubulosaiz Kine) kretao se od 0,785 do 0,899, dok je sličnost sa uzorcima HM1–HM3 (Cistanche deserticolaiz Kine) kretao se od 0,630 do 0,745. Za uzorak K2 iz Kenije, sličnost sa uzorcima GH1–GH3 bila je 0,840 do 0,859, a sa uzorcima HM1–HM3 bila je 0,775 do 0,824. Ovi rezultati pokazuju da je hemijski sastav kenijske divlje cistanče sličniji onom kineskogCistanche tubulosanego daCistanche deserticola.

 

Slika 4 Kromatogrami otiska prsta divlje Cistanche u Keniji i uzgojenih C. tubulosa i C. deserticola u Xinjiangu

 

Tabela 3. Rezultati procjene sličnosti uzoraka Cistanche

Uzorak	K1	K2	HM1	HM2	HM3	GH1	GH2	GH3	Referenca
K1	1	0.881	0.647	0.745	0.630	0.899	0.834	0.785	0.852
K2	0.881	1	0.783	0.824	0.775	0.859	0.854	0.840	0.875
HM1	0.647	0.783	1	0.988	1	0.887	0.950	0.975	0.945
HM2	0.745	0.824	0.988	1	0.985	0.946	0.986	0.997	0.983
HM3	0.630	0.775	1	0.985	1	0.876	0.942	0.969	0.937
GH1	0.899	0.859	0.887	0.946	0.876	1	0.987	0.967	0.988
GH2	0.834	0.854	0.950	0.986	0.942	0.987	1	0.996	0.999
GH3	0.785	0.840	0.975	0.997	0.969	0.967	0.996	1	0.993
Referenca	0.852	0.875	0.945	0.983	0.937	0.988	0.999	0.993	1

---

Napomena: K1, K2: Kenijski divlji Cistanche; HM1–HM3:Cistanche deserticolaiz Turpana, Xinjiang; GH1–GH3: *

 

Diskusija

Kenija se može pohvaliti bogatom biljnom raznolikošću i dugogodišnjom tradicijom korištenja biljaka u medicinske svrhe. Međutim, istraživanja o mnogim afričkim biljkama u smislu taksonomije, kemije i farmakologije ostaju ograničena, što dovodi do toga da su mnoge vrijedne ljekovite biljke zanemarene i nedovoljno istražene [9]. Iako postoje izvještaji koji sugeriraju da je Cistanche široko rasprostranjen u Keniji [15], trenutno nema zapisa o njegovoj medicinskoj upotrebi u zemlji. Kako bi razjasnili status i ljekovitu vrijednost resursa Cistanchea u Keniji, naš istraživački tim je proveo terensko istraživanje i otkrio daCistanche senegalensisje široko rasprostranjen u jugozapadnoj Keniji. Lokalni periodi cvatnje za Cistanche su od marta do maja i od oktobra do decembra. Kako je naše istraživanje sprovedeno u avgustu, uspeli smo da prikupimo samo dva uzorka. Unatoč ovom ograničenju, identificirali smo vrste divljeg kenijskog Cistanchea kroz morfološke, histološke i DNK molekularne analize i odredili njihov kemijski sastav, pružajući podršku očuvanju i razvoju resursa Cistanchea u Keniji.

Cistanche deserticola

 

Sočna stabljika kenijske divlje Cistanche je spljoštena i cilindrična, nalikCistanche deserticolapo izgledu, ali se značajno razlikuje od vretenaste stabljikeCistanche tubulosa. Poprečni presjek kenijske divlje Cistanche pokazuje rasute vaskularne snopove, što je u skladu se karakteristikeCistanche tubulosa. Međutim, dok je anther bazaCistanche tubulosaje tup i zaobljen bez oštrog vrha, ova karakteristika je odsutna u divljim kenijskim Cistanche [1,7]. Na osnovu analize ITS2 i psbA-trnH sekvence, vjerovatna je kenijska divlja CistancheCistanche senegalensis, a obje genetske regije pokazuju veliku sličnost s kineskimCistanche tubulosa. Prethodni izvještaji ukazuju na toC. senegalensisuglavnom je rasprostranjen od Senegala u sjeveroistočnoj Africi prema jugu do Kenije i drugih dijelova jugoistočne Afrike [15]. Najnovija i sveobuhvatna filogenetska studija roda Cistanche dijeli ga na četiri glavne klade: istočnu Aziju, sjeverozapadnu Afriku, jugozapadnu Aziju i rasprostranjenu kladu. Zbog hibridizacije među vrstama ili geografskih promjena, rasprostranjenu kladu karakterizira niska filogenetska rezolucija, što otežava razlikovanje vrsta na osnovu morfologije i DNK sekvenci. ObaC. tubulosaiC. senegalensisspadaju u ovu rasprostranjenu kladu, a četiri uzorka identificirana kaoC. tubulosapronađeni su unutarC. senegalensisgrana u studiji, što čini izazovom razlikovati ovo dvoje čak i na nivou nuklearnih ITS2 i hloroplastnih psbA-trnH sekvenci [8].

Prema istraživanju [15], domaćini odC. senegalensisuključuje nekoliko vrsta, kao nprSuaeda monoica(Amaranthaceae),Salvadora persica(Salvadoraceae),Zygophyllumvrste (Zygophyllaceae), iVachellia tortilis(Fabaceae). U ovoj studiji, domaćin kenijske divlje Cistanche je identificiran kaoSericocomopsis hildebrandtii(Amaranthaceae), grm ili grm čije se korijenje lokalno koristi kao etnomedicina za liječenje malarije, bolova u želucu, hepatitisa, zatvora i drugih bolesti [16,17]. U Kini, domaćini odCistanche deserticolauključitiHaloxylon ammodendron, H. persicum(oba Amaranthaceae), iAtriplex canescens(Chenopodiaceae) [18]; dok su domaćini KineziCistanche tubulosasu razne vrsteTamarix(Tamaricaceae). U poređenju sa relativno ograničenim rasponom domaćina kineskih vrsta Cistanche,C. senegalensisu Keniji koristi širi izbor domaćina iz različitih rodova, što ukazuje na širu ekološku prilagodljivost.

Oba uzorkaC. senegalensisprikupljeni u ovoj studiji sadržavali su svih pet feniletanoidnih glikozida, iako su nivoi uvelike varirali, vjerovatno zbog razlika u fazi cvjetanja. Uzorak K1 je sakupljen prije nego što je biljka izašla iz zemlje, sa manjom stabljikom i nepotrošenim rezervama hranljivih materija, što je rezultiralo većim sadržajem aktivnog sastojka; uzorak K2 je sakupljen tokom perioda cvatnje, kada su hranljive materije bile iscrpljene, što je rezultiralo nižim sadržajem aktivnog sastojka, u skladu sa prethodnim studijama [19]. Ukupni sadržaj pet feniletanoidnih glikozida u K1 bio je veći nego u kineskomCistanche deserticolaali niže nego na kineskomCistanche tubulosa. Nadalje, ukupan sadržaj četiri šećerna alkohola i betaina u K1 bio je veći nego uCistanche tubulosaali niže nego uCistanche deserticola. Značajno je da su i K1 i K2 uzorci sadržavali relativno visoke nivoe betaina, što nikada nije otkriveno u kineskimCistanche tubulosaali je poznato da je prisutan u velikim količinama u kineskom jezikuCistanche deserticola[6]. Druga značajna razlika je u tome što ni K1 ni K2 nisu sadržavali glukozu, ali zbog male veličine uzorka nije jasno da li je to karakteristikaC. senegalensisili jednostavno pojedinačna varijacija - ovo će zahtijevati dalju verifikaciju sa više uzoraka u budućnosti.

Ukratko, istraživanjem na terenu i istraživanjem, ova studija je identificirala distribuciju divlje cistanche u Keniji, razjasnivši njene vrste kaoCistanche senegalensis, i pronašao sličnosti i razlike s kineskimCistanche deserticolaiCistanche tubulosa. Na ove razlike mogu uticati metode uzgoja, ekološka sredina i drugi faktori, te zahtijevaju dalje istraživanje i praćenje.

 

Reference

[1] Kineska farmakopejska komisija. Farmakopeja Narodne Republike Kine (中华 人民共和国药典) [S]. Vol 1. 2025 Ed. Peking: China Medical Science Press, 2025: 319-320.

[2] Tu PF, Jiang Y. Ažuriranje istraživanja klasične literature o Cistanches Herba [J]. China J Chin Mater Med (中国中药杂志), 2022, 47: 5670-5679.

[3] Fu Z, Fan X, Wang X, et al. Cistanches Herba: pregled njegove hemije, farmakologije,

[4] Xu CH, Tuerdimaimaiti N, Wang YX, et al. Napredak u bioaktivnosti feniletanoidnih glikozida u Cistanches [J]. Food Drug (食品与药品), 2023, 25: 261-266.

[5] Pjesma ZH, Lei L, Tu PF. Napredak u istraživanju farmakološke aktivnosti u biljkama Cistanche Hoffing et Link [J]. Chin Tradit Herb Drugs (中草药), 2003, 34: 113-115.

[6] Gao YJ, Jiang Y, Dai F, et al. Studija o laksativnim sastojcima u Cistanche deserticola YC Ma [J]. Mod Chin Med (中国现代中药), 2015, 17: 307-310, 314.

[7] Urednički odbor Flora Reipublicae Popularis Sinicae, Kineska akademija nauka. Flora Kine (中国植物志) [M]: Vol 69. Peking: Science Press, 1999: 86.

[8] Ataei N, Schneeweiss GM, García MA, et al. Multilokusna filogenija nefotosintetičke parazitske biljke Cistanche (Orobanchaceae) pobija trenutnu taksonomiju i identificira četiri glavne morfološki različite klade [J]. Mol Phylogenet Evol, 2020, 151: 106898.

[9] Nankaya J, Gichuki N, Lukhoba C, et al. Ljekovito bilje kenije maasai: pregled [J]. Biljke, 2020, 9:44