Cistanche Rb1 ublažava vaskularno oštećenje povezano sa starenjem modulacijom putanje gasa6

Rezultati Rb1 je ublažio starenje u aorti ostarjelih miševa

Da bismo identificirali antisenescencijski učinak Rb1, prvo smo istražili ćelijsko starenje, koje je karakterizirano ekspresijom proteina uključenih u inhibiciju ćelijskog ciklusa i ireverzibilno zaustavljanje rasta (Yang et al. 2019). Kako su rezultati imunohistohemije prikazani na slici 1(A,B), u poređenju sa onima u grupi mladih, miševi iz grupe Old þ Vehicle pokazali su da starenje ubrzava regulaciju p21Cip1 i p16INK4a u ćelijama torakalne aorte. Međutim, tretman Rb1 je ublažio ćelijsko starenje u krvnim sudovima, posebno u staroj þ Rb1-20 grupi. Osim toga, rezultati Western blota bili su u skladu sarezultati imunohistohemije. Kao što je prikazano na slici 1(C), ekspresija proteina p21Cip1 i p16INK4a je značajno povećana za približno 2-puta u torakalnim aortama starijih miševa u poređenju sa mladim miševima. Nakon tretmana sa 20 mg/kg Rb1, nivoi proteina p21Cip1 i p16INK4a su samo povećani za 41,92 posto i 37,52 posto u poređenju sa onima u grupi mladih, koji su bili značajno niži od onih u grupi Old plus Vehicle. Osim toga, nije bilo značajne razlike u ekspresiji p21Cip1 ili p16INK4a između mladih miševa sa i bez tretmana Rb1.

Slika 1. Utjecaj Rb1 na starenje torakalne aorte. Slike imunohistohemijskog bojenja (400) p21Cip1 (A) i p16INK4a (B) u poprečnim presjecima torakalne aorte miša. (C) Western blot analiza ekspresije p21Cip1 i p16INK4a mišje torakalne aorte. Podaci su izraženi kao srednja vrijednost ± SD. p < 0,01 u odnosu na grupu mladih; # p < 0,05 u odnosu na grupu Oldþ Vehicle.

Rb1 je poboljšao vaskularnu reaktivnost kod starijih miševa

Eksperiment sa vaskularnim prstenom korišten je za procjenu vazodilatacije zavisne od endotela. Kao što je prikazano na slici 2, u svim mišjim torakalnim aortalnim prstenovima, primjena Ach je rezultirala vazorelaksacijom. Pri maksimalnim koncentracijama (10-5 mol/L), Ach je izazvao otprilike 88,84 posto ± 1,20 posto i 58,35 posto ± 2,50 posto vazorelaksacije u grupi mladih i starijih þ vozila, respektivno, pokazujući da je starenje povezano s oštećenjem vaskularne reaktivnosti. Međutim, tretman sa 10 i 20 mg/kg Rb1 rezultirao je otprilike 70,48 posto ± 2,20 posto i 80,90 posto ± 3,24 posto relaksacije, respektivno, kod starenja mišjih torakalnih prstenova aorte kao odgovora na 10 5 mol/L Ach.

Kliknite ovdje da biste dobili Cistanche za anti-aging

Rb1 smanjuje ekspresiju molekula stanične adhezije u torakalnim aortama ostarjelih miševa

Ispitivali smo ekspresiju proteina određenih molekula stanične adhezije da bismo odrediliinflamatornoiantiinflamatorno dejstvoRb1 na ostarjelim miševima. Rezultati su pokazali da je ekspresija proteina ICAM-1, VCAM-1 i PAI-1 značajno povećana za približno 2-4 puta u torakalnim aortama starijih miševa u poređenju sa onima u grupi Mladi (Slika 3). Nasuprot tome, tretman Rb1 značajno je inhibirao ove promjene u torakalnim aortama starijih miševa, ali nije imao efekta na grupe mladih miševa. Kvantitativna analiza je pokazala da je tretman sa 20 mg/kg Rb1 rezultirao približno 36,58 posto, 46,66 posto i 49,34 posto smanjenjem ekspresije proteina ICAM-1, VCAM-1 i PAI{17}}, respektivno, u starenju tkiva torakalne aorte, u poređenju sa miševima grupe Old plus Vehicle.

Rb1 je inhibirao vaskularnu kalcifikaciju i fibrozu uzrokovanu starenjem

Izvršili smo HE bojenje i alizarin crveno S bojenje kako bismo procijenili strukturu tkiva aorte i vaskularnu medijalnu kalcifikacija kod starijih miševa. HE bojenje je pokazalo da se zadebljani zidovi torakalne aorte uzrokovani starenjem i dezorganizacija ekstracelularnog matriksa aorte mogu ublažiti tretmanom Rb1 (slika 4(A)). Kao što je prikazano na slici 4(B), stariji miševi razvili su ozbiljniju medijalnu kalcifikacija (crveno obojeno područje) od mladih miševa, dok je Rb1 intervencija smanjila ovu patološku promjenu. Zatim smo pregledali poprečne presjeke torakalne aorte Massonovim trihromnim bojenjem da bismo procijenili vaskularnu medijalnu fibrozu kod starijih miševa. Rezultati su pokazali da je došlo do primjetnog povećanja taloženja kolagena (plavo obojeno područje) u grupi Staro þ Vozilo u odnosu na grupu Mladih (Slika 4(C)), a ovaj efekat je značajno inhibiran Rb1 intervencijom. Štaviše, Western blotting je pokazao da se ekspresija kolagena I i kolagena III značajno povećala za 4.34- i 2.62-puta kod miševa grupe Old þ Vehicle u poređenju sa mladim miševima; međutim, tretman Rb1 smanjio je ekspresiju kolagena I i kolagena III kod starijih miševa (Slika 4(D)). Štaviše, tretman sa Rb1 nije imao uticaja na stepen kalcifikacije torakalne aorte i fibroze kod mladih miševa (Slika 4 (A-D)).

Rb1 je regulisao Gas6 signalni put

Dalje smo istražili da li je Rb1 funkcionirao kroz Gas6/Axl signalni put kako bi poboljšao oštećenje torakalne aorte povezano sa starenjem kod miševa. Smanjenje ekspresije Gas6 proteina za 41,72 posto i ekspresije mRNA za 52,73 posto kod ostarjelih miševa u poređenju sa mladim miševima poništeno je tretmanom Rb1 (Slika 5(A,B)). Također smo odredili ekspresiju proteina Axl Western blottingom. Zanimljivo je da nije bilo značajne razlike u ekspresiji Axl proteina među pet eksperimentalnih grupa (Slika 5(A)). Takođe nismo otkrili značajnu razliku u nivoima mRNA Axl među grupama (Slika 5(B)).

Slika 2. Tretman Rb1 je oslabio oštećenje vazorelaksacije zavisne od endotela u vezi sa starošću u vaskularnim prstenovima torakalne aorte. Slike koje prikazuju rezultate analize. Podaci su izraženi kao srednja vrijednost ± SD. p < 0.05, p < 0.01 u odnosu na grupu mladih; # p < 0,05, ##p < 0,01 u odnosu na grupu Old þ Vehicle.

Slika 3. Rb1 smanjena ekspresija molekula ćelijske adhezije u torakalnim aortama starijih miševa. Western blot analiza ekspresije ICAM-1, VCAM-1 i PAI-1 u tkivima torakalne aorte. Podaci su izraženi kao srednja vrijednost ± SD. p < 0.01 u odnosu na grupu mladih; # p < 0.05, ##p < 0,01 u odnosu na Oldþ Vehicle grupu.

Diskusija

U ovoj studiji pokazali smo da se Rb1 poboljšaovaskularno oštećenje vezano za starenjesuzbijanjem kalcifikacije i fibroze kroz regulaciju ekspresije Gas6, ali ne i ekspresije Axl, što pruža potencijalnu terapijsku strategiju za prevenciju vaskularnih bolesti povezanih sa starenjem. Dobro je prihvaćeno da starenje vaskularnih stanica, koje karakterizira endotelna disfunkcija i fenotipska tranzicija glatkih mišićnih stanica, može rezultirati povećanom vaskularnom krutošću i povećanjem debljine vaskularnih zidova (Liu et al. 2019). Starenje vaskularnih ćelija je uobičajena karakteristika različitih složenih bolesti povezanih sa starenjem, posebno kardiovaskularnih bolesti (O'Rourke et al. 2010). Sa razvojem starenja vaskularnih ćelija, vaskularna funkcija je narušena (Gong et al. 2014). Vaskularna disfunkcija povezana sa starenjem je oslikana patofiziološkim promjenama, uključujući progresivni pad vazodilatacije ovisne o endotelu (Herrera et al. 2010; Gong et al. 2014). U našoj studiji potvrdili smo ćelijsku senescenciju u torakalnim aortama ostarjelih miševa, na što ukazuje povećana ekspresija proteina p21Cip1 i p16INK4a vezanih za starost, kao i pad vazodilatacije zavisne od endotela. Konzistentnost naših rezultata s gore navedenim studijama sugerira da su postojali neki važni molekularni mehanizmi povezani s promjenama u patofiziologiji vaskularnih ćelija tokom starenja. Sredstva koja djeluju na ove mehanizme vjerovatno bi u velikoj mjeri smanjila i odložila starenje vaskularnih ćelija.

Slika 4. Tretman Rb1 je poboljšao vaskularnu kalcifikaciju i fibrozu uzrokovanu starenjem. (A) Bojenje hematoksilinom i eozinom (HE) (400), (B) Alizarin crveno S bojenje (400) i (C) Massonovo trihromsko bojenje (400 ) reprezentativnih sekcija torakalne aorte u svakoj grupi. (D) Western blot analiza ekspresije kolagena I i kolagena III u tkivima torakalne aorte. Podaci su izraženi kao srednja vrijednost ± SD. p < 0,01 u odnosu na grupu mladih; # p < 0,05, ##p < 0,01 u odnosu na Oldþ Vehicle Group

Slika 5. Utjecaj Rb1 na signalni put Gas6/Axl. (A) Vestern blot je izveden da bi se ispitala ekspresija proteina Gas6 i Axl. (B) qPCR je izveden da bi se ispitala ekspresija mRNA Gas6 i Axl. Podaci su izraženi kao srednja vrijednost ± SD. p < 0.05, p < 0.01 u odnosu na grupu mladih; # p < 0,05 u odnosu na grupu Old þ Vehicle.

Akumulirani dokazi su otkrili da se Rb1 smatra lijekom koji obećava za prevenciju vaskularnih oštećenja (Zhou et al. 2017, 2019a, 2019b; Zheng et al. 2020). Prethodne studije su otkrile da Rb1 sprečava starenje vaskularnih ćelija i inhibira vaskularnu kalcifikaciju (Nanao-Hamai et al. 2019; Zhou et al. 2019b; Zheng et al. 2020). Međutim, još uvijek je neizvjesno može li Rb1 zaštititi arterijske funkcije od starenja i relevantnog molekularnog mehanizma. Ovdje smo otkrili da Rb1 smanjuje i odlaže arterijsko starenje kod ostarjelih miševa, što je pokazano smanjenom ekspresijom srodnih proteina i poboljšanom vazodilatacijom, što ukazuje da Rb1 može efikasno blokirati prekomjerno starenje kod starenja torakalne aorte miševa i može se koristiti kao djelotvoran agens za liječiti ili spriječiti oštećenje arterija uzrokovano starenjem.

Prethodni dokazi su pokazali akumulaciju hronične arterijske upale niskog stepena sa starenjem, što doprinosi vaskularnim strukturnim i funkcionalnim promenama povezanim sa starenjem (Wang et al. 2014). Dodatne studije su pokazale da mikrookruženje obogaćeno upalnim profilima inducira fenotipski pomak u VSMC od kontraktilnog do sintetičkog tipa. Ovaj fenotipski pomak karakterizira oslabljena ekspresija kontraktilnih proteina specifičnih za SMC i izlučivanje dodatnih proinflamatornih citokina, hemokina, ECM proteina i molekula ćelijske adhezije, kao što su kolagen, ICAM-1, VCAM-1 i PAI{6}} (Wang et al. 2011; Lacolley et al. 2018). Štaviše, adhezioni molekuli doprinose remodeliranju arterija izazvanom upalom, posebno reorganizacijom ECM-VSMC interakcija i utjecajem na fenotipsku modulaciju VSMC (Intengan et al. 1999). Nadalje, studije su pokazale da Rb1 ima protuupalno djelovanje in vivo i in vitro (Miao et al. 2017; Zhou et al. 2017). U ovoj studiji otkrili smo da tretman Rb1 može značajno smanjiti nivoe ekspresije molekula ćelijske adhezije koji se odnose na upalne procese kod ostarjelih miševa, što sugerira da bi Rb1 mogao djelovati kao protuupalni lijek i zaštititi vaskulaturu tijekom starenja.

Pored upalnih oštećenja, remodeliranje arterijskog zida koje karakterizira kalcifikacija i fibroza je druga glavna patofiziološka promjena u avaskularnim modifikacijama vezanim za starenje i uzrokuje vaskularnu ukočenost koja doprinosi smanjenju vazodilatacije (McEniery et al. 2005; Iyemere et al. 2006; Kovačić i sur. 2011). Studije velikih razmjera su pokazale da se koronarna aterosklerotska kalcifikacija povećava s godinama (Tesauro et al. 2017). Druga istraživanja su također pokazala prisustvo povećane kalcifikacije sa starenjem u regiji karotidne arterije (Wendorff et al. 2015). Slično, naši rezultati su pokazali da su stariji miševi razvili ozbiljniju vaskularnu medijalnu kalcifikacija od mladih miševa. Rb1 intervencija je značajno inhibirala ove promjene. Ovaj rezultat ukazuje na to da je primjena Rb1 ublažila stupanj vaskularne kalcifikacije povezane sa starenjem in vivo. Dovoljni dokazi su pokazali da vaskularna kalcifikacija uključuje različite patobiološke procese, a ne jednostavno taloženje kalcija, među kojima ključnu ulogu igra VSMC prebacivanje u ćelije slične osteoblastima (Zhou et al. 2019b). Jedno od ograničenja naše studije je da, unatoč otkrivanju da Rb1 intervencija značajno inhibira vaskularnu kalcifikacija u torakalnim aortama starenja miševa, kontraktilne VSMC markere (kao što su A-aktin glatkih mišića i kalponin) i osteogene VSMC markere (kao što je transkripcijski faktor 2 povezan s trncem). ) zahtijevaju daljnja istraživanja.

Štaviše, u ovoj studiji, također smo primijetili smanjene nivoe intersticijalnog kolagena i smanjenu ekspresiju srodnih proteina kod starijih miševa tretiranih Rb1- u poređenju sa starijim miševima tretiranim vozilom, što sugerira da bi Rb1 mogao imati povoljan učinak na vaskularnu funkciju kod starenja torakalnih aorta ublažavanjem vaskularne fibroze izazvane starenjem. Harvey et al. (2016) izvijestili su da ukrućenje arterija uzrokovano pretjeranom fibrozom i povećanim taloženjem kolagena može rezultirati povećanim vazomotornim tonusom i promijenjenom perfuzijom tkiva. Smatra se da sredstva koja ublažavaju fibrozu štite od vaskularnih bolesti povezanih sa starenjem (Kim et al. 2018).

Može se zaključiti davaskularno oštećenje vezano za starenjeje složen proces koji uključuje različite abnormalne promjene, uključujući upalu, kalcifikaciju i fibrozu. Što je još važnije, otkrili smo da je Rb1 bio u stanju inhibirati ove poznate abnormalne promjene u torakalnoj aorti ostarjelih miševa. Međutim, osnovni mehanizam je još uvijek nepoznat. Gas6 je identifikovan kao lig i za familiju TAM receptora, posebno receptore Axl tirozin kinaze (Rothlin et al. 2015). Prethodna studija je pokazala ulogu Gas6/Axl u regulaciji višestrukih ćelijskih funkcija (Chen et al. 2019). Nedavna studija je sugerirala da je Gas6/Axl igrao ključnu ulogu u vaskularnoj kalcizaciji (Son et al. 2010; Kaesler et al. 2016; Nanao-Hamai et al. 2019) i da također može biti uključen u smanjenje regulacije sinteze kolagena uzrokovano liječenjem. VSMC i starenje srčanog tkiva (Chen et al. 2016; 2019). Štaviše, prethodne studije su otkrile da je Rb1 aktivirao transkripciju Gas6 na specifičnom ARE mjestu u promotorskoj regiji (Son et al. 2010; Nanao-Hamai et al. 2019). Ovdje smo pokazali da je ekspresija proteina Gas6 smanjena kod starijih miševa, ali je poništena tretmanom Rb1, što ukazuje da Gas6 može učestvovati u Rb1-posredovanoj regulaciji arterijskog oštećenja kod starijih miševa. Međutim, naši rezultati pokazuju da nije došlo do promjene u ekspresiji Axl proteina i mRNA, što nije u skladu s prethodnom studijom (Chen et al. 2019). Porodica TAM receptora uključuje Tyro3, ​​Axl i MerTK. Iako Gas6 pokazuje najjači afinitet za Axl među tri člana (Rothlin et al. 2015), Sun et al. (2019) su otkrili da je aktivacija Gas6 ublažila upalne ozljede i apoptozu kod miševa, ali nije došlo do promjena u Axl aktivaciji među eksperimentalnim grupama. Druga istraživanja su pokazala da ekspresija Axl, koja inhibira apoptozu, a time i vaskularnu kalcifikacija, također nije promijenjena kod Gas6–/– miševa (Kaesler et al. 2016). Naši rezultati jasno pokazuju da je Rb1 specifično oslabio regulaciju Gas6 vezanu za starenje, ali nije imao utjecaja na ekspresiju Axl, za koji se navodi da je primarni događaj odgovoran za vaskularnu kalcifikacija i fibrozu, kako bi se poboljšala vaskularna upala povezana sa starenjem i vazodilatacija zavisna od endotela. . Stabilna ekspresija Axl može biti rezultat dovoljne količine prije aktivacije Gas6 ili ukazuje da Gas6 funkcionira preko drugih receptora. Potrebna je dalja istraga koja istražuje efekte Rb1 na druge TAM-ove koji bi također mogli biti aktivirani Gas6, kao što su Tyro3 i MerTK.

Zaključci

U ovoj studiji, potvrdili smo da Rb1 inhibira vaskularnu kalcifikacija i fibrozu i smanjuje ekspresiju molekula stanične adhezije, što je sve naknadno poboljšalo vazodilataciju vaskularnog endotela ovisnu o starosti barem djelomično regulacijom ekspresije Gas6, ali ne i ekspresije Axl. Kod nekontrolisanog starenja, od velike je važnosti pronalaženje sredstava koja mogu spriječiti ili liječiti oštećenje vaskularnih stanica uzrokovano starenjem. Naša studija pruža dokaze koji potvrđuju efekte Rb1 na vaskularne ozljede koje ocjenjuju melio kod starijih miševa.

Izjava o objelodanjivanju

Autor(i) nije prijavio nikakav potencijalni sukob interesa.

Finansiranje Ovaj rad je podržan grantovima Nacionalne fondacije za prirodne nauke Kine [81370447], Projekta planiranja nauke i tehnologije u provinciji Guangdong u Kini [2016A050502014], Shenzhen Key Medical Discipline Construction Fund [SZXK002] i Medical Scientific Research Osnivanje kineske provincije Guangdong [A2019079].

Izjava o dostupnosti podataka

Podaci i materijali dostupni su na zahtjev odgovarajućem autoru.

Doprinosi autora

SYK, DHL i XXQ doprinijeli su koncepciji i dizajnu ovog djela. LW, GYS i MW doprinijeli su analizi podataka. SYK, LW i JMZ su napisali rukopis. Svi autori su pročitali i odobrili konačnu verziju.

Reference

Acosta JC, O'Loghlen A, Banito A, Guijarro MV, Augert A, Raguz S, Fumagalli M, Da Costa M, Brown C, Popov N, et al. 2008. Hemokinska signalizacija preko CXCR2 receptora pojačava starenje. Cell. 133(6): 1006–1018.

Brandes RP, Fleming I, Busse R. 2005. Endotelno starenje. Cardiovasc Res. 66(2):286–294.

Chen FF, Song FQ, Chen YQ, Wang ZH, Li YH, Liu MH, Li Y, Song M, Zhang W, Zhao J, et al. 2019. Egzogeni testosteron ublažava srčanu fibrozu i apoptozu putem Gas6/Axl puta kod starijih miševa. Exp Gerontol. 119:128–137.

Chen YQ, Zhao J, Jin CW, Li YH, Tang MX, Wang ZH, Zhang W, Zhang Y, Li L, Zhong M. 2016. Testosteron odgađa starenje vaskularnih glatkih mišićnih ćelija i inhibira sintezu kolagena putem Gas6/Axl signalnog puta . Dob. 38(3):60.

Fridell YW, Villa J, Attar EC, Liu ET. 1998. GAS6 indukuje Axl posredovanu hemotaksiju vaskularnih glatkih mišićnih ćelija. J Biol Chem. 273(12): 7123–7126.

Gong X, Ma Y, Ruan Y, Fu G, Wu S. 2014. Dugotrajni atorvastatin poboljšava endotelnu disfunkciju povezanu sa starenjem ublažavanjem oksidativnog stresa i normalizacijom neravnoteže eNOS/iNOS u aorti štakora. Exp Gerontol. 52:9–17.

Harvey A, Montezano AC, Lopes RA, Rios F, Touyz RM. 2016. Vaskularna fibroza u starenju i hipertenziji: molekularni mehanizmi i kliničke implikacije. Can J Cardiol. 32(5):659–668.

Herrera MD, Mingorance C, Rodriguez-Rodriguez R, Alvarez de Sotomayor M. 2010. Endotelna disfunkcija i starenje: ažuriranje. Aging Res Rev. 9(2):142–152.

Hsu JJ, Lu J, Umar S, Lee JT, Kulkarni RP, Ding Y, Chang CC, Hsiai TK, Hokugo A, Gkouveris I, Tetradis S, et al. 2018. Učinci teriparatida na morfologiju kalcifikacije aorte kod starijih hiperlipidemičnih miševa. Am J Physiol Heart Circ Physiol. 314(6):H1203–H1213.

Hurtado B, Abasolo N, Munoz X, Garcia N, Benavente Y, Rubio F, Garcia de Frutos P, Krupinski J, Sala N. 2010. Studija asocijacije između polimorfima u GAS6-TAM genima i karotidne ateroskleroze. Thromb Haemost. 104(3):592–598.

Intengan HD, Thibault G, Li JS, Schiffrin EL. 1999. Mehanika arterije rezistencije, struktura i ekstracelularne komponente kod spontano hipertenzivnih pacova: efekti antagonizma angiotenzinskih receptora i inhibicije konvertujućeg enzima. Cirkulacija. 100(22):2267–2275.

Iyemere VP, Proudfoot D, Weissberg PL, Shanahan CM. 2006. Fenotipska plastičnost vaskularnih ćelija glatkih mišića i regulacija vaskularne kalcifikacije. J Intern Med. 260(3):192–210.

Kaesler N, Immendorf S, Ouyang C, Herfs M, Drummen N, Carmeliet P, Vermeer C, Floege J, Kruger T, Schlieper G. 2016. Gas6 protein: njegova uloga u kardiovaskularnoj kalcifikacije. BMC Nephrol. 17(1):52. Kim EN, Kim MY, Lim JH, Kim Y, Shin SJ, Park CW, Kim YS, Chang YS, Yoon HE, Choi BS. 2018. Zaštitni efekat resveratrola na vaskularno starenje modulacijom renin-angiotenzin sistema. Ateroskleroza. 270: 123–131. Korshunov VA, Mohan AM, Georger MA, Berk BC. 2006. Axl, receptorska tirozin kinaza, posreduje u vaskularnom remodeliranju izazvanom protokom. Circ Res. 98(11):1446–1452.