Polisaharidi Cistanche Deserticola poboljšavaju starenje crijeva inhibirajući aktivaciju NLRP3 inflamasoma
Nov 12, 2025
Starenje dovodi do postepenog opadanja višestrukih fizioloških funkcija i povećava rizik od bolesti povezanih sa starenjem [1]. Istraživanja su pokazala da starenje ima značajan utjecaj na strukturu i funkciju crijeva [2]. Kao ključni organ za probavu, metabolizam i imunološku odbranu, starenje crijeva može uzrokovati malapsorpciju nutrijenata, metaboličke poremećaje i oštećenu imunološku funkciju [3–4], čime se povećava osjetljivost na gastrointestinalne bolesti [5]. Hronična upala je obilježje starenja crijeva, ali njeni molekularni mehanizmi još uvijek nisu u potpunosti razjašnjeni. Trenutno, agensi protiv starenja uglavnom uključuju beta-nikotinamid mononukleotid (NMN), rapamicin, dasatinib plus kvercetin i druge [3]. Među njima, NMN je ključni prekursor esencijalnog koenzima NAD+, a više studija je potvrdilo da značajno odgađa starenje crijeva kod prirodno ostarjelih miševa; široko je priznata u ovoj oblasti kao efikasna intervencija [4–5]. Stoga je istraživanje relevantnih mehanizama i strategija intervencije od velikog značaja.
Cistanche oralni liker za bolesti povezane sa starenjem
Kontaktirajte sada upoznajte farmere cistanche u Kini
Wecistanche usluga podrške - najveći izvoznik cistanchea u Kini:
Email:wallence.suen@wecistanche.com
Inflamasom 3 (NLRP3) porodice receptora za oligomerizaciju koji se vezuje za oligomerizaciju, koji sadrži 3 (NLRP3) je ključni regulator urođenog imuniteta i igra važnu ulogu u bolestima povezanim sa starenjem. Za njegovo aktiviranje potrebna su dva signala. Prvi signal: molekularni obrasci povezani sa patogenom (PAMP) i molekularni obrasci povezani sa oštećenjem (DAMP) indukuju ekspresiju NLRP3 i prekursora interleukina-1 (pro-IL-1). Drugi signal (kao što je efluks kalijuma i oštećenje mitohondrija) pokreće sklapanje inflamasoma, aktivira kaspazu-1 i cijepa pro-IL-1 i pro-IL-18 kako bi se stvorile zrele IL-1 i IL-18, čime se pokreće upala [6]. Tokom starenja, homeostaza crijeva je poremećena, što dovodi do oslobađanja proupalnih faktora kao što je lipopolisaharid (LPS), koji uporno aktivira NLRP3 inflamasom, formirajući kroničnu upalu niskog stupnja. Ovo dodatno pogoršava oštećenje crijevne barijere i disbiozu, mijenja ekspresiju proteina čvrstog spoja, povećava propusnost crijeva i ubrzava starenje crijeva [7–10].
Cistanche deserticola, cijenjena tradicionalna kineska ljekovita i hrana homologna biljka poznata kao "pustinjski ženšen", tonizira jang bubrega, hrani esenciju i krv i vlaži crijeva kako bi ublažio zatvor. Njegovi aktivni polisaharidi pokazuju svojstva protiv starenja, antioksidansa i zaštitu crijeva [11-12]. U smislu zaštite crijeva, polisaharidi Cistanche deserticola (CDP) mogu modulirati ravnotežu crijevne mikrobiote tako što inhibiraju aktivaciju Toll-like receptor 4 (TLR4)/nuklearni faktor-kappa B (NF-κB) puta, smanjujući na taj način nivoe LPS-a i popravljajući funkciju crijevne barijere [13–14]. CDP takođe mogu poboljšati funkciju mitohondrija kroz aktivaciju puta protein kinaze aktivirane AMP (AMPK)/sirtuin 1 (SIRT1), odgoditi ćelijsko starenje, regulirati metabolizam lipida i ublažiti lipotoksične ozljede u epitelnim stanicama crijeva [15].
Iako su dokazani intestinalni zaštitni efekti CDP-a, ostaje nejasno da li oni poboljšavaju starenje crijeva suzbijanjem puta NLRP3 inflamasoma. Ova studija ima za cilj istražiti mehanizam pomoću kojeg CDP inhibiraju aktivaciju inflamasoma NLRP3 dopoboljšati starenje crijeva.
Materijali
1.1 Pokusne životinje
Pedeset zdravih mužjaka miševa C57BL/6J (10 u dobi od 2 mjeseca; 40 u dobi od 20 mjeseci) kupljeno je od Beijing Speifu Biotechnology Co., Ltd. Proizvodna dozvola: SYXK (Peking) 2023-0011. Životinje su bile smeštene u zaštitnom okruženju u Ustanovi za eksperimentalne životinje u bolnici tradicionalne kineske medicine u provinciji Hebei pod sledećim uslovima: temperatura 22 ± 2 stepena, relativna vlažnost 50% ± 10% i ciklus svetlosti 12 h/12 h tame. Svi miševi su se aklimatizirali 1 sedmicu. Ovu studiju je odobrio Institucionalni komitet za brigu o životinjama i upotrebu Provincialne bolnice tradicionalne kineske medicine Hebei (IACUC-HPHCM-2025001).
1.2 Instrumenti i reagensi
Kriostat (Thermo Fisher; CryoStar NX50)
Laserski konfokalni mikroskop za skeniranje (Nikon; AX)
PCR sistem u realnom vremenu (Thermo Fisher; 7500)
Multimode čitač ploča (Tecan; Spark)
Beta-nikotinamid mononukleotid (Bontac, Kina; Cat. BT05N120A005)
SA- - komplet za bojenje (Solarbio, Peking; Cat. 250003003)
LPS ELISA komplet za miš (CUSABIO/Huamei, Wuhan; kat. CSB-E13066m)
TransZol Up Plus RNA komplet (TransGen Biotech, Peking; kat. ER501-01-V2)
MonAmp ChemoHS qPCR Mix (Monad; Cat. MQ00501S)
Lgr5 poliklonsko antitijelo (Wuhan Sanying; Cat. 30007-1-AP)
ZO-1 monoklonsko antitelo, NLRP3 monoklonsko antitelo, kaspaza-1 monoklonsko antitelo, ASC monoklonsko antitelo, GAPDH monoklonsko antitelo, Ki67 monoklonsko antitelo (Abcam; Cats. ab307799, ab263899, ab179515, ab525, ab308)
Metode
2.1 Priprema polisaharida Cistanche deserticola
Cistanche materijal (50 g) ekstrahovan je dva puta dekocijom sa 8-strukim zapreminama vode, svaki put po 1 sat. Filtrati su sjedinjeni i ohlađeni na sobnu temperaturu. Dodan je bezvodni etanol do konačne koncentracije od 80% za taloženje. Nakon centrifugiranja, supernatant je odbačen. Precipitat je otopljen u vodi, dijaliziran, zatim liofiliziran da bi se dobio uzorak.
2.2 Grupisanje životinja i administracija
Nakon aklimatizacije, četrdeset 20-mjesečnih C57BL/6J miševa nasumično je raspoređeno u: grupu prirodnog starenja, grupu sa niskim dozama CDP (2,5 g·kg-1), grupu sa visokim dozama CDP (5,0 g·kg-1) i NMN grupu (200 mg·kg-1). Dodatnih deset dvomjesečnih SPF C57BL/6J miševa služilo je kao mlada kontrolna grupa. Niske i visoke doze CDP-a date su oralnom gavažom od 2,5 g·kg-1 i 5,0 g·kg-1, respektivno. Koristeći konverziju površine tijela i faktor konverzije od čovjeka do miša od 12 [16], oni odgovaraju približno 1× i 2× kliničkoj ekvivalentnoj dozi za odrasle. NMN grupa je primala NMN 200 mg·kg-1 putem sonde. Mlade kontrolne grupe i grupe prirodnog starenja dobile su jednake količine fiziološkog rastvora (10 mL·kg-1). Tretmani su davani kontinuirano 2 mjeseca.
2.3 Priprema smrznutih rezova
Miševi su anestezirani intraperitonealnom injekcijom natrijum pentobarbitala (30 mg·kg-1) i eutanazirani. Abdomen je brzo otvoren, mezenterij je odvojen, a ilealno tkivo je sakupljeno i isječeno na 5 μm za zamrznute rezove [17].
2.4 SA- -gal test za aktivnost intestinalne galaktozidaze
Bojenje je obavljeno prema uputama za SA- -gal komplet. Nakon inkubacije, otopina za bojenje je uklonjena i sekcije su isprane sa PBS. Slike su prikupljene pomoću obrnutog mikroskopa.
2.5 PCR u realnom vremenu za sekretorni fenotip povezan sa starenjem (SASP)
Ukupna RNK iz ilealnog tkiva ekstrahirana je pomoću TransZol Up Plus kompleta. Reverzna transkripcija je izvršena GoScript sistemom pod sledećim uslovima: 42 stepena 15 min, 70 stepeni 15 min, 4 stepena 10 min. PCR u realnom vremenu je sproveden korišćenjem MonAmp ChemoHS qPCR miksa sa sledećim ciklusima: 95 stepeni 10 min; zatim 40 ciklusa od 95 stepeni 15 s, 60 stepeni 1 min. Kriva topljenja: 95 stepeni 15 s, 60 stepeni 15 s, 95 stepeni 15 s. GAPDH je služio kao interna referenca, a relativna kvantifikacija je koristila 2^-ΔΔCt metodu. Prajmeri su kupljeni od Promege. Prajmer sekvence su prikazane u tabeli 1.
2.6 Imunofluorescentno bojenje za ekspresiju ZO-1
Tkivo ileuma je fiksirano u 4% paraformaldehida i parafinski presečeno na 5 μm. Sekcije su permeabilizirane sa 0,3% Triton X-100 tokom 15 minuta i blokirane sa 10% kozjeg seruma 1 h na sobnoj temperaturi. Primarno antitijelo protiv ZO-1 (1:200) je primijenjeno preko noći na 4 stepena. Nakon ispiranja PBS-om, Cy3-konjugirano sekundarno antitijelo (1:500) je inkubirano 1 h na sobnoj temperaturi u mraku. Jezgra su obojena DAPI 5 min. Stakalca su postavljena sa antifade medijumom i snimljena konfokalnom mikroskopijom. Intenzitet fluorescencije je kvantifikovan korišćenjem softvera Image-Pro.
2.7 Imunohistohemija za ekspresiju Ki67 i Lgr5
Sekcije ileuma su inkubirane sa primarnim antitelima Ki67 (1:1000) i Lgr5 (1:200) preko noći na 4 stepena prema protokolu IHC kita, zatim sa odgovarajućim sekundarnim antitelima. DAB je korišten za kromogeni razvoj. Rezultati su posmatrani svetlosnom mikroskopijom. Srednja optička gustina je kvantifikovana korišćenjem softvera Image-Pro.
2.8 ELISA za nivoe LPS
Standardi i uzorci (100 μL po jažici) su dodani na ploču i inkubirani na sobnoj temperaturi 1,5 h. Zatim je dodan rastvor streptavidina konjugovan sa HRP (100 μL po jažici) i inkubiran 30 min. Supstrat je dodat u uslovima zaštićenim od svetlosti i reagovao je 30 min. Reakcija je prekinuta stop rastvorom, a apsorbanca je izmjerena na 450 nm.
2.9 Western blot za NLRP3, kaspazu-1 i ASC
Otprilike 30 mg ilealnog tkiva je mljeveno u tečnom dušiku. Dodan je RIPA pufer za lizu koji sadrži inhibitore proteaze/fosfataze; lizati su inkubirani na ledu 30 minuta i centrifugirani na 12,000 × g, 4 stepena 15 minuta da se sakupe supernatanti. Koncentracija proteina je određena BCA testom i podešena na 2 ug/μL. Jednake količine proteina (20-40 ug) su odvojene pomoću SDS-PAGE i prebačene na PVDF membrane. Membrane su blokirane 5% nemasnim mlijekom 1 h na sobnoj temperaturi, inkubirane sa primarnim antitijelima (NLRP3 1:1000, Caspase-1 1:500, ASC 1:1000) preko noći na 4 stepena, zatim sa HRP-konjugiranim sekundarnim antitijelima:500h na sobnoj temperaturi. Nakon TBST pranja, signali su razvijeni. Intenzitet opsega je normalizovan na GAPDH.
2.10 Statistička analiza
Podaci su izraženi kao srednja vrijednost ± standardna devijacija. Statistička analiza i grafički prikaz izvršeni su pomoću SPSS 26.0 i GraphPad Prism 8.0.2, respektivno. Jednosmjerna ANOVA korištena je za procjenu razlika među grupama, nakon čega je uslijedio Tukeyjev post hoc test. Statistička značajnost je postavljena na P < 0,05.
Praktične napomene za čitaoce zainteresirane za pokretljivost crijeva i razvoj suplemenata
Funkcionalni fokus Cistanche deserticola: Tradicionalno se koristi za vlaženje crijeva i ublažavanje zatvora; moderni podaci podržavaju barijeru, modulaciju upale (TLR4/NF-κB) i mitohondrijalnu funkciju preko AMPK/SIRT1.
Potencijalni mehanizam crijeva protiv starenja istražen ovdje: supresija aktivacije NLRP3 inflamasoma; smanjenje upale niskog stepena izazvane LPS; očuvanje čvrstih spojeva (npr. ZO-1); održavanje proliferacije epitela/markera stabljike (Ki67, Lgr5).
Tipične eksperimentalne oralne doze kod miševa: 2,5–5,0 g·kg-1 CDPs tokom 2 mjeseca; NMN 200 mg·kg-1 kao pozitivna kontrola.
Translacijski oprez: doze za miševe nisu direktne ljudske preporuke. Studija koristi skaliranje površine tijela; Ljudski ekvivalentna formulacija i sigurnost, testiranje identiteta i GMP proizvodnja su neophodni prije razvoja proizvoda.
