Analiza komponenti arome i diferencijalnih metabolita u Cistanche Musalais na osnovu GC-MS i metabolomike
Nov 28, 2025
sažetak:Ova studija je pripremila Cistanche Musalais koristeći tradicionalne tehnike sa Xinjiang Hetian crvenim grožđem i različitim dodacima Cistanchea. Optimalni uvjeti obrade određeni su jednosmjernom ANOVA-om. GC–MS i neciljana metabolomika korišteni su za analizu komponenti arome i diferencijalnih metabolita, a kvantificirani su aktivni sastojci kao što su ukupni flavonoidi i ukupni polifenoli. Optimalni uslovi su bili: početni sadržaj šećera 32 stepena Bx, temperatura fermentacije 25 stepeni i 7% dodatka Cistanche deserticola. Pod ovim uslovima, sadržaj alkohola, ukupne kiselosti, ukupnih flavonoida i ukupnih polifenola dostigao je (12,6 ± 0,6)% vol, (3,82 ± 0,19) g/L, (0,80 ± 0,01) g/L i (0,60 ± 0,00) g/L, respektivno. GC-MS je otkrio 38 aroma jedinjenja, od kojih su esteri najzastupljenija klasa (24 jedinjenja), a zatim 6 alkohola, 2 ketona i 2 aldehida. U poređenju sa Musalaisom napravljenim isključivo od soka grožđa, Cistanche deserticola Musalais je pokazao značajno više nivoe ključnih estera, uključujući etil acetat (6,42% vs. 2.42%) i etil palmitat (3,75% naspram {. 1.18%), dok su viši alkoholi, kao što je izobutanol, smanjen. Metabolomika je identifikovala 230 diferencijalnih metabolita (VIP veći ili jednak 1, P < 0,05), obogaćenih putevima povezanim sa ABC transporterima i biosintezom aminokiselina. Komponente kao što su trigonelin i krocin su značajno povišene. Metabolizam aminokiselina doprinio je formiranju karakterističnog profila okusa. Ova studija pruža teoretsku i tehničku osnovu za razvoj i poboljšanje kvaliteta Cistanche Musalais. Buduća istraživanja bi trebala uključiti molekularne senzorne tehnike, kao što je GC-O, kako bi se bolje identificirali ključni aktivni spojevi odgovorni za ukupni profil okusa.
Ključne riječi: Cistanche;Musalais; GC–MS; metabolomika
CistancheMusalais
Cistanche Musalais Listing Details
Musalais (Msalais)je tradicionalno fermentirano piće jedinstveno za Xinjiang, proizvedeno od Awati crvenog grožđa ili Hetian (Hotan) crvenog grožđa. Pravi se cijeđenjem soka, koncentriranjem i spontanom fermentacijom, a karakterizira ga primitivnim, prirodnim i zelenim. Kao jedinstveno kinesko prirodno fermentirano alkoholno piće, Musalais pokazuje različite regionalne karakteristike u senzornim atributima, nutritivnoj vrijednosti i funkcionalnim aktivnostima. Alkoholi, estri, aldehidi, kiseline, fenoli i terpeni koji nastaju tokom fermentacije ne samo da daju jedinstven okus, već su i povezani s blagodatima kao što su promicanje cirkulacije, snižavanje lipida u krvi, toniziranje bubrega i jačanje tijela, regulacija kolesterola i održavanje zdravlja srca i krvnih žila, što ga čini prikladnim za kardiovaskularno i kardiovaskularno zdravlje potrošača.
In recent years, with growing consumer demand for healthy beverages, the functional liquor market has expanded rapidly. Na temelju tradicionalnog pivarstva, funkcionalna pića sadrže specifične funkcionalne komponente kako bi zadovoljile potrebe za dobrobit, održavanje zdravlja ili specifičnu fiziološku regulaciju. Their quality is influenced by raw materials, processes, microbial communities, and the stability of functional components [2]. U narodnoj praksi južnog Xinjianga, lokalni dodaci kao što su goji bobice, šafran, cistanche i šafran često se dodaju tokom pripreme Musalaja kako bi se poboljšale zdravstvene prednosti i obogatila raznolikost okusa [3]. Među njima, Cistanche bogat polisaharidima, aminokiselinama, feniletanoidnim glikozidima, iridoidnim glikozidima i alkaloidima – ima toničko djelovanje na jang bubrega, modulira neuroendokrinu funkciju i bori se protiv umora, zbog čega je dobio naziv „pustinjski ginseng“ [4–5].
Međutim, industrijalizacija Cistanche Musalais trenutno se suočava sa izazovima uključujući nedostatak standarda proizvodnje, nepotpunu tehnologiju prerade i nedovoljno istraživanja aromatičnih supstanci, ograničavajući njegovu promociju na tržištu i poboljšanje kvaliteta. U ovoj studiji, Cistanche je korišten kao dodatak za optimizaciju procesa Musalais fermentacije. GC-MS i neciljana metabolomika korišteni su za sistematsko rješavanje aromatičnih sastojaka i diferencijalnih metabolita, s ciljem pružanja teorijske osnove i tehničke podrške za standardiziranu proizvodnju, modulaciju okusa i funkcionalno poboljšanje Cistanche Musalais, čime se promovira modernizacija i razvoj vrijednosti ovog tradicionalnog napitka.
1 Materijali i metode
1.1 Materijali i reagensi
Cistanche tubulosa (cijevasta Cistanche): komercijalni primjerci prvog razreda dobiveni iz Hetiana (Hotan), Xinjiang, pune teksture i bez plijesni i nečistoća.
Hetian crveno grožđe: komercijalno voće netaknutog izgleda i jake arome, poreklom iz Hetiana, Xinjiang.
Metanol i acetonitril: Thermo Fisher Scientific (China) Co., Ltd.
Mravlja kiselina: TCI (Shanghai) Development Co., Ltd.
L-2-klorofenilalanin: Shanghai Aladdin Biochemical Technology Co., Ltd.
1.2 Instrumenti i oprema
08-2T magnetna mješalica s konstantnom temperaturom, Shanghai Meiyingpu Instrument Co., Ltd.
57330-U SPME uređaj i 57348-U 50/30 μm DVB/CAR/PDMS SPME vlakna, Sigma-Aldrich (Shanghai) Trading Co., Ltd.
6890N-5973 GC–MS sistem, Agilent Technologies (China) Co., Ltd.
5430R rashladna centrifuga, Eppendorf (Shanghai) International Trading Co., Ltd.
TL-48R visokopropusna brusilica za tkivo, Shanghai Jingxin Industrial Development Co., Ltd.
SCIENTZ-1LS vakuumski koncentrator, Ningbo Scientz Biotechnology Co., Ltd.
Vanquish Flex UHPLC, Thermo Fisher Scientific (China) Co., Ltd.
SDAJ-0.5 Linija za proizvodnju vina u kineskom stilu, Shandong Anji Bio-Fermentation Equipment Technology Co., Ltd.
1.3 Eksperimentalne metode
1.3.1 Tok procesa
Cistanche je kuhan na pari za kasniju upotrebu. Hetiansko crveno grožđe je oprano i odabrano, otkinuto i zgnječeno. Sok od grožđa je ekstrahiran presom, zatim zagrijan i koncentriran da se podese indikatori koncentracije soka. Na kraju, pareni proizvod Cistanche pomiješan je s koncentriranim sokom od grožđa i fermentiran pod kontroliranim temperaturnim i vremenskim parametrima. Nakon fermentacije, proizvod je bistren da bi se dobio Cistanche Musalais.
1.3.2 Priprema Cistanchea
Uz manje modifikacije Gong et al. [6], visokokvalitetna, neiskvarena osušena Cistanche je oguljena, narezana, umotana u gazu i kuhana na pari 20 minuta za kasniju upotrebu.
1.3.3 Priprema soka od grožđa
Korišteno je crveno grožđe Hetian sa početnom topivom krutom tvari (šećerom) od 18 stupnjeva Bx. Uklonjeno je trulo, pokvareno i neravnomjerno sazrelo grožđe. Nakon pranja i guljenja grožđe je presovano. Sok je prokuvan (koncentrisan) na visokoj temperaturi i koncentracija je prekinuta kada je šećer dostigao 26, 29 ili 32 stepena Bx. Sok je ohlađen na sobnu temperaturu za kasniju upotrebu.
1.3.4 Proces fermentacije Cistanche Musalais
Cistanche kuhani na pari je dodat u definisanim omjerima (3%, 5%, 7%) u 600 mL koncentriranog soka od grožđa u fermentoru. Zaostali šećer je mjeren svaka 24 h tokom fermentacije kako bi se pratio napredak. Kada je preostali šećer pao na 4 g/L, fermentacija je prekinuta. Supernatant je sakupljen i pasterizovan na 85 stepeni tokom 30 minuta da se dobije Cistanche Musalais.
1.3.5 Jednofaktorski eksperimentalni dizajn za Cistanche Musalais
Ispitivani su efekti dodavanja Cistanchea (3%, 5%, 7%), početnog sadržaja šećera (26, 29, 32 stepena Bx) i temperature fermentacije (22, 25, 28 stepeni) na fizičko-hemijska svojstva i bioaktivnost.
1.3.6 Analize i mjerenja
Sadržaj alkohola, rastvorljivih čvrstih materija i ukupna kiselost: utvrđeno prema GB/T 15038-2006 "Opće analitičke metode za vino i voćno vino."
Ukupni flavonoidi: određeno prema Xu et al. [7]. Kalibraciona kriva je pripremljena sa koncentracijom rutina (X) kao apscisom i apsorbancijom (Y) na 510 nm kao ordinatom, dajući Y=0.8043X − 0,0278, R2=0.9999, što ukazuje na dobru linearnost.
Ukupni polifenoli: određeno Folin-Ciocalteu metodom [8]. Pripremljena je kalibracijska kriva sa sadržajem galne kiseline (X) kao apscisom i apsorbancijom (Y) na 760 nm kao ordinatom, dajući Y=0.4177X + 0.1048, R2=0.9975, što ukazuje na dobru linearnost.
1.3.7 GC–MS analiza
Uzorci iz dvije grupe - eksperimentalne (32 stepena Bx, 25 stepeni, 7% Cistanche) i kontrolne bez Cistanchea - podvrgnuti su GC-MS.
Predtretman uzorka: Uzorak je stavljen u bočicu za ekstrakciju od 20 mL; 100 μL 50 ug/mL izoamil fenilacetata dodano je kao interni standard. Bočica je zapečaćena i ekvilibrisana u vodenom kupatilu od 60 stepeni uz magnetno mešanje na 250 o/min tokom 20 minuta. SPME vlakno je zatim ubačeno na ekstrakciju od 30 minuta. Prije upotrebe, SPME vlakno je kondicionirano na ulazu GC-a na 250 stepeni 20 min.
GC-MS uslovi: HP-INNOWax kolona (60 m × 250 μm × 0,25 μm); ulaz 250 stepeni; prijenosna linija 250 stepeni; protok gasa nosača 1,5 mL/min; podijeliti 4:1. Program rerne: 40 stepeni (5 min), rampa 5 stepeni/min do 250 stepeni, držite 10 min. Izvor jona 230 stepeni; četveropol 150 stepeni; EI 70 eV; potpuno skeniranje 35–550 Da.
1.3.8 Neciljana metabolomika
1.3.8.1 Priprema uzorka
Ispitivane su dvije grupe: eksperimentalna (32 stepena Bx, 25 stepena, 7% Cistanche) i kontrolna bez Cistanchea; n=3 bioloških replika po grupi, ukupno 6 uzoraka. Nakon odmrzavanja i vorteksiranja, 300 μL svakog uzorka je prebačeno u epruvetu od 1,5 mL i centrifugirano na 12.000 o/min, 4 stepena 15 minuta. Zatim je 100 μL supernatanta premješteno u epruvetu od 2 mL, brzo zamrznuto u tekućem dušiku i liofilizirano. Dodati 1 mL prethodno ohlađenog metanola:acetonitril (1:1, v/v), vortex 30 s; zamrznuti na -20 stepeni 30 min; centrifugirati na 12.000 o/min, 4 stepena 10 min; prikupiti 850 μL supernatanta i osušiti u vakuumu do kraja; rekonstituisati u 150 μL 50% metanola (sa 5 ppm 2-klorofenilalanina), vrtložni 30 s; centrifuga 12.000 o/min, 4 stepena 10 min; filtrirati kroz membranu od 0,22 μm i prenijeti filtrat u bočice. Kombinujte 10–20 μL iz svakog uzorka da biste kreirali QC uzorak za procenu stabilnosti instrumenta i pouzdanosti podataka; QC se izostavlja ako je uključeno manje od 5 uzoraka.
1.3.8.2 Analitički uslovi
Kromatografija: ACQUITY UPLC HSS T3 kolona (100 Å, 1,8 μm, 2,1 mm × 100 mm); protok 0,4 mL/min; stub 40 stepeni; autosampler 8 stepeni; injekcija 2 μL. Mobilna faza A: voda sa 0,1% (v/v) mravlje kiseline; mobilna faza B: acetonitril sa 0,1% (v/v) mravlja kiselina.
Masena spektrometrija: napon raspršivanja +3.5 kV/−3,0 kV; plašt plin 40 arb; pomoćni plin 10 arb; kapilarni 320 stepeni; temp. pomoćnog gasa 300 stepeni; MS1 rezolucija 60.000; opseg skeniranja m/z 70–1000; AGC ciljni standard; Max IT 100 ms; MS/MS zavisan od podataka na gornja 4 jona sa dinamičkim isključenjem 4 s; MS2 rezolucija 15.000; HCD energija sudara 30%.
1.3.8.3 Identifikacija metabolita
Identifikacija metabolita bazirana je na PSNGM (PerSonalbio Next-Generation Metabolomics Database), koja se sastoji od interne biblioteke standarda, mzCloud (https://www.mzcloud.org/), LIPID MAPS (https://www.lipidmaps.org/), HMDB (https://hmdb.ca/), MoNA (https://mona.fiehnlab.ucdavis.edu/), NIST_2020_MSMS i MS/MS spektralnu biblioteku predviđenu AI.
Napomena o vanjskim bazama podataka korištenim u napomenama:
HMDB: Sveobuhvatna baza podataka o ljudskom metabolomu (verzija 5.0) koja sadrži detaljne hemijske, kliničke i biohemijske informacije za 220 945 metabolita, sa opsežnim unakrsnim vezama na KEGG, PubChem, MetaCyc, ChEBI, PDB, UniProt i GendBank, i podršku za tekst/sequence advanced/MRstructure/sequence pretrage. Također povezan sa DrugBank, T3DB, SMPDB i FoodDB.
LIPID MAPS: An open-access lipidomics resource providing databases (e.g., LMSD with >50.000 kuriranih lipidnih struktura), spektri, putevi, alati za MS analizu, crtanje strukture i izvori nomenklature/klasifikacije.
mzCloud: Napredna biblioteka masenog spektra koja podržava pretrage zasnovane na spektru, strukturi, podstrukturi, stablu i m/z, sa 32.330 spojeva, 51.002 spektralna stabla i 16.531.567 spektra (sa značajnim dodacima u 2024.), optimizirana za pristup Firefoxu/Chromu.
1.3.8.4 Multivarijantna statistička analiza
Multivarijantne analize su primijenjene na podatke o metabolitima iz 6 uzoraka za izvođenje PCA, razjašnjavajući metaboličke razlike između Cistanche Musalais i Musalais. Diferencijalni metaboliti u grupama su pregledani korišćenjem OPLS-DA varijabilne važnosti u projekciji (VIP), promjeni puta i P vrijednosti (VIP prag i značaj kao gore), nakon čega je slijedila biološka interpretacija uključujući obogaćivanje KEGG puta [9].
Reference
[1] Zhu LX, Wang LL, Song HZ, et al. Kvalitativna analiza glavnih aromatičnih spojeva povezanih s tradicionalnom preradom Musalaja u Kini Xinjiang. Časopis Instituta za pivarstvo. 2012;118(2):236–242.
[2] Zhao B, Li DD, Yuan Y, et al. Savremeni napredak istraživanja fermentiranog funkcionalnog likera. Pravljenje pića. 2025;52(2):43–49.
[3] Zhu LX, Hou XJ, Xu Q. Diskusija o strategijama razvoja vina od grožđa Xinjiang Msalais. Nauka i tehnologija proizvodnje pića. 2008(7):111–113.
[4] Pjesma ZH, Lei L, Tu PF. Napredak u istraživanju farmakološke aktivnosti u biljkama Cistanche Hoffing. et Link. Kineske tradicionalne i biljne droge. 2003;34(9):U018.
[5] Shi TT, Ge WH. Razvoj istraživanja Cistanche Hoffmg. Et Link. Kineski časopis za etnomedicinu i etnofarmaciju. 2009;18(9):7–9.
[6] Gong X, Zhong T, Zhou JY, et al. Studija o tehnologiji novog fermentisanog vina Cistanche. Moderna hrana. 2019(5):64–68;79.
[7] Xu HT, Li H, Zhao YZ, et al. Antioksidativno i antibakterijsko djelovanje ukupnih flavonoida iz Nervilia fordii. Sjeverna hortikultura. 2017(16):161–165.
[8] Yu H, Xu X, Hao JX, et al. Mješovita fermentacija komine od kore citrusa s Trichoderma koningii, Aspergillus oryzae i Lactobacillus casei: optimizacija procesa, antioksidativna aktivnost i neciljana metabolomska analiza. Bioscience o hrani. 2025;66:106180.
[9] Zhou JN, Hou DH, Zou WQ, et al. Poređenje široko ciljane metabolomike i neciljane metabolomike divljeg Ophiocordyceps sinensis. Molekuli. 2022;27(11):3645.
[10] Li XH. Istraživanje tehnologije Rosa kwangsiensis var. sterilis fermentirano vino [Magistarski rad]. Chongqing: Jugozapadni univerzitet; 2017.
[11] Li ZJ, Zhang XD, Long BX, et al. Istraživanje razvoja proizvoda i optimizacije površine odziva kruške Msalais. Prerada poljoprivrednih proizvoda. 2025;3:1–10.
[12] Zhang L, Jiang XF. Provjera prilagodljivosti metode određivanja bakra u općoj metodi analize vina i voćnog vina GB/T15038-2006. Pravljenje likera. 2020;47(5):104–107.
[13] Zhong DL, Yang H, Wang Z, et al. Utjecaj temperature malolaktičke fermentacije na kvalitet vina Cabernet Sauvignon. Zhejiang Agricultural Sciences. 2025;66(7):1724–1732.
