Ekstrakt Cistanche za poboljšanje mineralne gustine kostiju, metode njegove pripreme i primjene
Oct 09, 2026
Abstract
Ovaj pronalazak otkriva aEkstrakt Cistanche za poboljšanje mineralne gustine kostiju (BMD). U izvodu, theukupan sadržaj ehinakozida i akteozida (verbaskozida)je>25 mas%. Ekstrakt se priprema izvođenjemekstrakcija destilovanom vodomofsirovi prah odCistanche tubulosa, praćenofiltracija, centrifugiranjefiltrata,koncentracija, ekstrakcija tečnost-tečnost, koncentracija uz uklanjanje nečistoća, razblaživanje, post-tretman, a zatimkonačna koncentracija i sušenjeda dobijete ekstrakt Cistanche.
Cistanche Extract Process
U ekstraktu Cistanche za poboljšanje mineralne gustine kostiju prema pronalasku,ukupan sadržaj ehinakozida i akteozidaje25–30 tež.%(isključujući 25 tež%), a ekstrakt je takođe bogatšikimična kiselinakao ikomponente tipa fenilpropionske kiselineikomponente alkaloidnog tipa, omogućavajući mu dastabilno ispoljavaju efekat poboljšanja gustine kostiju.
Zahtevi
1. Metoda pripreme
Metoda za pripremu ekstrakta Cistanche za poboljšanje mineralne gustine kostiju, naznačena time što se sastoji od sljedećih koraka:
drobljenjeCistanche tubulosada se dobije sirovi prah odCistanche tubulosa;
dodavanjem destilovane vode sirovom prahuCistanche tubulosaza ekstrakciju, filtriranje, centrifugiranje filtrata i koncentriranje da se dobije koncentrovana otopinaCistanche tubulosa;
ekstrakcija koncentrovanog rastvoraCistanche tubulosa, koncentriranje donje faze ekstrakcije kako bi se uklonile nečistoće i razrjeđivanje kako bi se dobila otopina za punjenje;
naknadna obrada otopine za punjenje, nakon čega slijedi koncentracija i sušenje kako bi se dobio ekstrakt Cistanchea.
2. Odnos materijala i vode
2. Metoda prema zahtjevu 1, naznačena time što je omjer mase i zapremine sirovog praha odCistanche tubulosana destilovanu vodu je1 : (15–25).
3. Temperatura ekstrakcije
2. Postupak prema zahtjevu 1, naznačen time što je temperatura ekstrakcije destilovane vode60–100 stepeni.
4. Odnos tokom ekstrakcije tečnost–tečnost
2. Postupak prema zahtjevu 1, naznačen time, što se tokom ekstrakcije koncentrovanog rastvora volumni odnos koncentrovanog rastvoraCistanche tubulosarastvarač za ekstrakciju je1 : (1–5).
5. Rastvarač za ekstrakciju
5. Postupak prema zahtjevu 4, naznačen time što rastvarač za ekstrakciju sadrži najmanje jedan odpetrolej eter, etil acetat, n-heksan ili cikloheksan.
6. Proces nakon tretmana
2. Metoda prema zahtjevu 1, naznačena time što naknadna obrada otopine za punjenje uključuje: propuštanje otopine za punjenje krozmakroporozna smola, a zatim eluiranjem uzastopno sadestilovana vodai anrastvor etanola.
7. Zapremine eluiranja
7. Postupak prema zahtjevu 6, naznačen time, što je volumni omjer destilovane vode i makroporozne smole(5–10) : 1, a volumni omjer otopine etanola i makroporozne smole je(3–9) : 1.
8. Ekstrakt
Ekstrakt Cistanche za poboljšanje mineralne gustine kostiju, naznačen time što je pripremljen prema bilo kojem od zahtjeva 1-7.
9. Sadržaj aktivnog markera
9. Ekstrakt Cistanche prema zahtjevu 8, naznačen time, što je ukupan sadržaj ehinakozida i akteozida25–30 tež.%, isključujući 25 mas%.
10. Aplikacija
10. Upotreba ekstrakta Cistanche prema bilo kojem od zahtjeva 8-9 za pripremu proizvoda za poboljšanje mineralne gustine kostiju, pri čemu je koncentracija ekstrakta Cistanche u proizvodu12,5–25 ug/mL.
Technical Field
[0001] Ovaj pronalazak se odnosi na oblastmedicinske formulacije, a posebno se odnosi na aEkstrakt Cistanche za poboljšanje mineralne gustine kostiju, itmetoda pripreme, iaplikacije.
Pozadina
[0002] Cistanche se odnosi na osušenu mesnatu stabljiku sa ljuskavim listovima biljke OrobanchaceaeCistanche deserticola YC MailiCistanche tubulosa (Schenk) Wight. Cistanche ima više aktivnosti kao nprimunološka regulacija, protuupalno, protiv umora, antioksidans, neuroprotektivni, ipodrška reproduktivnom sistemu.
Feniletanoid glikozidi (PhGs)-sechinacosideiakteozid (verbaskozid)budući da su glavni PhG-ovi u Cistanche-u važni su sastojci.Echinacosidepokazalo se da ima uticaj napoboljšanje mineralne gustine kostiju. Međutim, otkrili smo da je učinak ekstrakta Cistanchea na poboljšanje gustoće kostijunije samo u korelaciji sa sadržajem ehinakozida. Jednostavno kontroliranje sadržaja ehinakozidane može osiguratida će ekstraktstabilnoimaju efekat poboljšanja gustine kostiju. Stoga je ključno razviti ekstrakt Cistanchea i metodu pripreme koja možestabilnopružaju željeni efekat podrške gustoći kostiju.
[0003] Kineska prijava patenta za pronalazakCN102441040Aotkriva metodu pripreme ukupnih feniletanoidnih glikozida iz Cistanchea putem usitnjavanja, ekstrakcije, adsorpcije makroporozne smole, eluiranja, koncentracije, itd. U slabo kiselim uvjetima (pH 2–4), stabilnost Cistanche feniletanoidnih glikozida je značajno poboljšana, a rezultirajući spojevi glikozida sadrže i ukupni glykozid. proporcija > 90%. Međutim, ne potvrđuje da li proizvod možestabilnopoboljšati mineralnu gustinu kostiju.
Kineska prijava patenta za pronalazakCN105111255Aotkriva metodu za ekstrakciju i odvajanje ehinakozida i akteozida iz Cistanchea, koristeći 75% etanola kao rastvarača za ekstrakciju, AB-8 makroporoznu smolu kao materijal za pakovanje i 55% etanolno eluiranje, dajući ekstrakt Cistanchea sa ehinakozidom sa ehinakozidom >10%, G ukupno > 25%. Međutim, možda još uvijek ne garantuje astabilanefekat poboljšanja gustine kostiju.
Sažetak pronalaska
[0004] Razviti ekstrakt Cistanche i metodu pripreme koja možestabilnopodržavaju poboljšanu mineralnu gustinu kostiju, pronalazak obezbeđuje:
Prvi aspekt: Metoda pripreme
Metoda pripreme ekstrakta Cistanche za poboljšanje mineralne gustine kostiju, koja se sastoji od:
drobljenjeCistanche tubulosaza dobijanje sirovog praha;
ekstrahovanje sirovog praha destilovanom vodom, filtriranje, centrifugiranje i koncentriranje da se dobije koncentrovani rastvor;
obavljanje ekstrakcije; koncentriranje donje faze za uklanjanje nečistoća; razrjeđivanje kako bi se dobila otopina za punjenje;
naknadna obrada otopine za punjenje, koncentriranje i sušenje kako bi se dobio ekstrakt Cistanchea.
[0005] U jednom aspektu, sirovi prah se propušta kroz a40-meshsito.
[0006] U jednom aspektu, odnos mase i zapremine sirovog praha i destilovane vode je1 : (15–25).
[0007] U jednoj varijanti, odnos mase i zapremine je1 : 20.
[0008] U jednom aspektu, temperatura ekstrakcije je60–100 stepeni.
[0009] U jednom aspektu, temperatura ekstrakcije je80 stepeni.
[0010] U jednom aspektu, ekstrakcija se izvodi1–2 puta, 1 sat svaki put.
[0011] U jednom aspektu, filtracija se izvodi kroz80-meshfilter.
[0012] U jednom aspektu, brzina centrifugiranja je3000–4000 o/mina vrijeme je3–9 min.
[0013] U jednom aspektu, brzina centrifugiranja je3500 o/mina vrijeme je5 min.
[0014] U jednom aspektu, nakon centrifugiranja, filtrat se koncentriše na70 stepenito18%–28%početnog volumena.
[0015] U jednoj realizaciji, tokom ekstrakcije koncentrovanog rastvora, zapreminski odnos koncentrisanog rastvora i rastvarača za ekstrakciju je1 : (1–5).
[0016] U jednoj izvedbi, omjer je1 : 3.
[0017] U jednoj realizaciji, rastvarač za ekstrakciju sadrži najmanje jedan odpetrolej eter, etil acetat, n-heksan ili cikloheksan.
[0018] U jednoj izvedbi, ekstrakcija se izvodi sekvencijalno korištenjempetrolej eterpraćenoetil acetat.
[0019] U jednoj realizaciji, "koncentracija sa uklanjanjem nečistoća" znači koncentriranje donje faze ekstrakcije u pastu, njeno otapanje u300 mL 50 wt% vodenog etanolaza uklanjanje nečistoća i prilagođavanje1,0–1,5 g sirove biljke po mlkao rješenje za punjenje.
[0020] U jednom aspektu, koncentracija rastvora za punjenje je1,0–1,5 g sirove biljke/mL vode.
[0021] U jednoj varijanti, naknadna obrada uključuje propuštanje otopine za punjenje krozmakroporozna smola, a zatim eluiranjem uzastopno sadestilovana vodai anrastvor etanola.
[0022] U jednoj realizaciji, brzina protoka punjenja kroz makroporoznu smolu je1–5 mL/min.
[0023] U jednom aspektu, smola jeAB-8 makroporozna smolasa zapreminom smole od0.93 L.
[0024] U jednom aspektu, zapreminski odnos destilovane vode i smole je(5–10) : 1, a volumni odnos rastvora etanola i smole je(3–9) : 1.
[0025] U jednom aspektu, zapreminski odnos destilovane vode i smole je7 : 1, a odnos rastvora etanola i smole je6 : 1.
[0026] U jednom aspektu, rastvor etanola je80% (w/w) vodeni etanol.
Drugi aspekt: Ekstrakt
[0027] Pronalazak dalje pruža ekstrakt Cistanche pripremljen gore navedenim metodom.
[0028] U jednoj realizaciji, ukupan sadržaj ehinakozida i akteozida je25–30 tež.%, isključujući 25 tež%.
Treći aspekt: upotreba
[0029] Izum dalje pruža upotrebu ekstrakta Cistanche u pripremi proizvoda za poboljšanje mineralne gustine kostiju, gdje je koncentracija ekstrakta u proizvodu12,5–25 ug/mL.
Prednosti / korisni efekti
[0030] U poređenju sa prethodnim stanjem tehnike, pronalazak ima sledeće korisne efekte:
Ekstrakt Cistanche sadrži25–30 tež.%ukupni ehinakozid i akteozid, a bogat ješikimična kiselina, komponente tipa fenilpropionske kiseline, alkaloidi, imasne kiseline, omogućavajući mu dastabilnopodržavaju poboljšanje mineralne gustine kostiju.
U okviru12,5–25 ug/mLraspon koncentracija, ekstrakt potiče proliferacijuMC3T3-E1ćelije sa odličnim proliferativnim efektom.
Ekstrakt pokazuje isti trend vezan za dozu u promoviranju proliferacije stanica iALP aktivnost, i može stabilno promovirati proliferaciju i diferencijaciju. U promicanju mineralizacije osteoblasta, pokazuje bolji učinak od pozitivne kontrole17 -estradiol.
Ekstrakt stimuliše faktore transkripcije specifične za osteoblastRunx2iOsx, pojačava diferencijaciju osteoblasta i potiče ekspresiju osteogenih markeraOPNiOCN, čime se potiče formiranje kostiju. Takođe se povećavaBmp2 mRNAekspresija za poboljšanje diferencijacije osteoblasta i formiranje nove kosti aktiviranjemBMP/Smad put; nadalje, regulacijomLrp5 mRNA, Lrp6 mRNA, iWnt3 mRNA, aktivira seWnt/ -catenin signalizacija, utiče na ekspresiju faktora transkripcije nizvodno i potiče diferencijaciju osteoblasta i formiranje kostiju.
Metodom pripreme dobije se ekstrakt koji sadrži feniletanoidne glikozide (ehinakozid i akteozid), šikimsku kiselinu i fenilpropionsku kiselinu, alkaloide i masne kiseline. Ove komponente zajedno omogućavaju ekstraktu da pokaže konzistentnu zavisnost od doze u proliferaciji, diferencijaciji i mineralizaciji, omogućavajući stabilne efekte koji podržavaju gustinu kostiju.
Kratak opis crteža
[0035] Fig. 1: Učinak ekstrakta (Primjer 1) na proliferaciju MC3T3-E1 stanica
Slika. 2: Učinak ekstrakta (Primjer 2) na proliferaciju MC3T3-E1 ćelija
Slika. 3: Učinak ekstrakta (Primjer 3) na proliferaciju MC3T3-E1 ćelija
Slika. 4: Učinak ekstrakta (Primjer 1) na ALP aktivnost
Slika. 5: Učinak ekstrakta (Primjer 2) na ALP aktivnost
Slika. 6: Učinak ekstrakta (Primjer 3) na ALP aktivnost
Fig. 7: Fotografije bojenja mineralizacije osteoblasta Alizarinom crvenom (Primjer 2)
Fig. 8: Kvantitativni rezultati mineralizacije osteoblasta (Primjer 2)
Slika. 9–12: Efekti primjera 2 na ekspresiju mRNA Runx2, Osx, Opn, Ocn
Slika. 13: Učinak primjera 2 na ekspresiju mRNA Bmp2 (BMP/Smad)
Slika. 14–16: Efekti primjera 2 na ekspresiju mRNA Lrp5, Wnt3, Lrp6 (Wnt/-katenin)
Slika. 17–18: Efekti primjera 2 na ekspresiju proteina Osx i RUNX2
Detaljan opis / izvedbe
Primjer 1
[0036] Metoda pripreme uključuje:
drobljenjeCistanche tubulosa, prolazeći kroz sito od 40 mesh da se dobije200 gsirovi prah;
vađenje sadestilovana voda 5× mase(kako je opisano), vađenje na75 stepeniza2 puta, po 1 h, koncentrirajući se na70 stepenina odnos koncentracije od1 : 2.2da se dobije koncentrovani rastvor;
dodavanje apsolutnog etanola u koncentrovanu otopinu za stepenasto taloženje etanola s konačnim masenim koncentracijama etanola od20%, 40%, 60%, 80%, taloženje na5 stepeni tokom 24 h, sakupljanje supernatanta nakon toga80 mas%taloženje etanola;
koncentriranje i sušenje na70 stepeniza dobijanje ekstrakta Cistanche, sa prinosom od20.75%.
Primjer 2
[0037] Metoda pripreme uključuje:
drobljenjeCistanche tubulosadobiti240 gsirovi prah;
ekstrakcija destilovanom vodom, filtriranje, centrifugiranje i koncentriranje da se dobije koncentrovani rastvor;
ekstrakcija koncentrovanog rastvora; koncentriranje donje faze za uklanjanje nečistoća; razrjeđivanje kako bi se dobila otopina za punjenje;
naknadna obrada otopine za punjenje; koncentriranje i sušenje na70 stepenida se dobije ekstrakt, sa prinosom od19.69%.
[0038] Sirovi prah prolazi kroz sito od 40 mesh.
[0039] Odnos mase i zapremine sirovog praha i destilovane vode je1 : 20.
[0040] Temperatura ekstrakcije je80 stepeni.
[0041] Ekstrakcija je izvedena1–2 puta, po 1 h.
[0042] Filtracija je kroz80-meshfilter.
[0043] Centrifugiranje je3500 o/min za 5 min.
[0044] Koncentracija nakon centrifugiranja: koncentrat na70 stepenito20%početnog volumena.
[0045] Tokom ekstrakcije, zapreminski odnos koncentrovanog rastvora prema rastvaraču je1 : 3.
[0046] Ekstrakcija se izvodi uzastopno sapetrolej eterietil acetat.
[0047] Donja faza je koncentrirana u pastu i otopljena u njoj300 mL 50 wt% vodenog etanolaza uklanjanje nečistoća.
[0048] Učitavanje koncentracije otopine:1,0 g sirove biljke/mL vode.
[0049] Naknadna obrada: proći kroz makroporoznu smolu, eluirati sa destilovanom vodom, a zatim rastvorom etanola.
[0050] Brzina protoka kroz smolu:3 mL/min.
[0051] Smola:AB-8, zapremina smole0.93 L.
[0052] Zapreminski omjer destilovane vode i smole:7 : 1. Omjer otopine etanola i smole:6 : 1.
[0053] Otopina etanola:80% (w/w)vodeni etanol.
Kliknite da saznate više detalja o fabrici cistanche
Primjer 3
[0053] Metoda pripreme uključuje:
drobljenjeCistanche tubulosa, prolazeći kroz sito od 40 mesh da se dobije120 gsirovi prah;
vađenje sa12× masaof50 tež% vodenog etanola, vađenje na70 stepeni, 2 puta, po 1 h, koncentrirajući se na70 stepenido omjera od1 : 2.5da se dobije koncentrovani rastvor;
dodavanjem vode za podešavanje koncentracije0,2 g sirove biljke/mL vode, centrifugiranje na3500 o/min za 5 min, uzimajući supernatant kao rastvor za punjenje;
prolaz kroz makroporoznu smolu; uzastopno eluiranje sa destilovanom vodom i rastvorom etanola; sakupljanje etanol elucije i koncentriranje/sušenje na70 stepenida se dobije ekstrakt sa prinosom od24.30%.
[0054] Smola:HPD750, zapremina smole0.93 L.
[0055] Omjer destilirane vode i smole:3 : 1. Omjer otopine etanola i smole:4 : 1.
[0056] Otopina etanola:30% (w/w)vodeni etanol.
Testiranje performansi
1.1. Test ćelijske proliferacije
[0057] Osteoblasti su glavne funkcionalne ćelije odgovorne za formiranje kostiju, uključujući proliferaciju preosteoblasta, proizvodnju koštanog matriksa i konačnu diferencijaciju. TheMC3T3-E1ćelijska linija se obično koristi za proučavanje osteogene aktivnosti. Diferencijacija osteoblasta uključuje proliferaciju, diferencijaciju i mineralizaciju koja se manifestuje kao povećan broj preosteoblasta, sazrijevanje u osteoblaste i formiranje novog koštanog matriksa.
alkalna fosfataza (ALP)je protein povezan s fenotipom osteoblasta koji se može otkriti tijekom proliferacije stanica i sazrijevanja matriksa i uobičajeno je korišten rani marker diferencijacije osteoblasta.
Stoga, procjenom proliferacije MC3T3-E1 i aktivnosti ALP, upoređena je aktivnost promicanja osteogeneze ekstrakata pripremljenih u primjerima 1-3.
MC3T3-E1 ćelije su oživljene i pasirane. Nakon stabilizacije, ćelije su digestirane, centrifugirane i sakupljene. Gustoća ćelija je podešena tako da svakih 100 μL sadrži 5×1035 \\ puta 10^35×103 ćelija i zasijano je u ploču sa 96 jažica. Nakon kultivacije preko noći, podloga je zamijenjena kompletnom podlogom koja je sadržavala ekstrakte Primjera 1-3 u koncentracijama od6,25, 12,5, 25 i 50 ug/mL, ili koji sadrži0,1 M estradiol(pozitivna kontrola) ili samo podloga (slijepa kontrola) i uzgajana za48 h. U uslovima zaštićenim od svetlosti, dodat je osnovni rastvor MTT (10%–20% zapremine jažice), inkubiran tokom4 hu CO₂ inkubatoru, medij uklonjen, i200 μL DMSOdodaje se da otopi formazan. OD vrijednosti su izmjerene na490 nm.
Rezultati: sl. 1 (primjer 1), sl. 2 (primjer 2), sl. 3 (primjer 3).
[0058] Stopa proliferacije ćelije (%)=OD(Primjer 1–3)−OD(Prazan)OD(Prazan)×100%\\frac{OD(\\text{Primjer 1–3}) - OD(\\text{Prazan})}{OD(\\text{Prazan})} \\times ODEx(lank) \\times OD10B 1–3)−OD (prazno)×100%
[0059] Kao što je prikazano na slici . 1-3, pozitivna kontrola je promovirala proliferaciju MC3T3-E1. Primer 1 je promovisao proliferaciju na 6,25, 12,5 i 25 ug/mL; stopa proliferacije pri 12,5 ug/mL bila je 1,4 puta veća od pozitivne kontrole, ali bez značajne razlike (P > 0,05). Primjer 2 je promovirao proliferaciju na 6,25, 12,5, 25 i 50 ug/mL; pri 12,5, 25 i 50 ug/mL njegovi efekti su bili bolji od pozitivne kontrole (P < 0,01 ili P < 0,001), sa stopama proliferacije 2,55×, 3,46× i 2,59× u odnosu na pozitivnu kontrolu. Primer 3 je promovisao proliferaciju na 6,25, 12,5, 25 i 50 ug/mL; pri 12,5, 25 i 50 ug/mL bio je superiorniji u odnosu na pozitivnu kontrolu (P < 0,01 ili P < 0,001), sa stopama proliferacije 1,40×, 1,76× i 0,93× u odnosu na pozitivnu kontrolu. Ovo ukazuje da je Primjer 2 imao najbolji učinak na promociju proliferacije MC3T3-E1.
1.2 Analiza ALP aktivnosti
[0060] Aktivnost ALP je izmjerena korištenjem kompleta za analizu ALP. Osnovna koncentracija p-nitrofenola bila je 10 mM, a standardne koncentracije krivulje bile su 0, 0,02, 0,04, 0,08, 0,12, 0,16, 0,2 i 0,25 mM, pripremljene gradijentom razblaživanja puferom za detekciju.
Za svaku jažicu uzorka u ploči sa 96 jažica dodano je 49 μL pufera za detekciju, 1 μL proteina ekstrahiranog iz tretiranih ćelija MC3T3-E1 (iz odjeljka 1.1) i 50 μL kromogenog supstrata (dodatog posljednjeg). Reakcija je trajala 30 min u inkubatoru zaštićenom od svjetlosti, prekinuta dodavanjem 100 μL stop otopine i mjerenjem apsorpcije pri405 nm. ALP aktivnost je izračunata iz standardne krive.
Rezultati: sl. 4 (primjer 1), sl. 5 (primjer 2), sl. 6 (primjer 3).
[0061] ALP aktivnost (U/L)=(relativna molarna koncentracija proteina) × 1000 × 100 / 30
(1000 za konverziju molarne jedinice; 100 za ukupni volumen reakcije; 30 za vrijeme reakcije od 30 minuta)
ALP je rani marker diferencijacije MC3T3-E1. Slika . 4–6 pokazuje da je pozitivna kontrola povećala aktivnost ALP. Primjer 1 nije promovirao ALP aktivnost. Primer 2 je povećao aktivnost ALP na 12,5, 25 i 50 ug/mL; kod 25 i 50 ug/mL razlike u odnosu na slijepo ispitivanje bile su značajne (P < 0,01). Primjer 3 povećao je aktivnost ALP na 12,5 i 25 ug/mL (P < 0,001), ali s povećanjem koncentracije, poboljšanje se smanjilo. Ovo ukazuje da su samo primjeri 2 i 3 povećali aktivnost ALP i podržali diferencijaciju.
[0062] Sveukupno, samo Primjer 2 pokazao je dozu pozitivnu korelaciju u proliferaciji MC3T3-E1 i aktivnosti ALP na 12,5 i 25 ug/mL. Primjer 3 pokazao je dozno pozitivnu korelaciju za proliferaciju, ali dozno negativnu korelaciju za ALP. Komparativno, primjer 2 je pogodniji za poboljšanje mineralne gustine kostiju.
1.3 Mineralizacija (crveno bojenje alizarinom) primjera 2
[0063] Pošto je Primer 2 pokazao najbolju korelaciju aktivnosti i doze u poređenju sa Primerima 1 i 3, sprovedeni su eksperimenti mineralizacije da bi se dalje procenio njegov efekat.
[0064] MC3T3-E1 ćelije su tretirane nakon 72 h kulture sa ekstraktom Primjera 2 na12,5, 25 i 50 ug/mL, inkubirano na 37 stepeni za14 days(zasnovano na formiranju kalcijumovih čvorića), sa srednjim promjenama svaka 2 dana. Izvršeno je bojenje Alizarin Red: uklonjen je podloga, ćelije fiksirane sa 10% neutralnog formalina (300 μL/bažirić) 30 minuta, isprane, obojene sa 0,1% Alizarin Red (300 μL/Jažirić) 30 minuta (sobna temperatura, zaštićeno od svjetlosti) i isprane dok ne ostane crvena boja. Slike su snimljene. Zatim je dodan 10% rastvor cetilpiridinijum hlorida (400 μL/bažici) i mućkan 1 h da bi se rastvorili kalcifikovani noduli. Otopljeni rastvor je prebačen na ploču sa 96 jažica (100 μL/jažici) i OD je izmeren na562 nmza izračunavanje stepena mineralizacije. Fotografije: Fig. 7; kvantitativni rezultati: sl. 8.
[0065] Stopa mineralizacije (%)=OD(Primjer 2)−OD(Prazno)OD(Prazno)×100%\\frac{OD(\\text{Primjer 2}) - OD(\\text{Prazno})}{OD(\\text{Prazno})} \\puta 100\\%OD(ExBlank) 2)−OD (prazno)×100%
[0066] Sl Sl Budući da mineralizirani noduli predstavljaju završnu fazu diferencijacije osteoblasta, ovi rezultati dodatno potvrđuju učinak primjera 2 koji podržava gustinu kostiju i pokazuje njegovu stabilnu aktivnost. Primjer 2 bio je bolji od estradiola, što ukazuje na potencijalnu vrijednost proizvoda za zdravlje kostiju.
Ekspresija gena i mehanizam puta (primjer 2)
[0067] Ekstrakt Primera 2 (12,5, 25, 50 ug/mL) je primenjen na MC3T3-E1 ćelije tokom 3 dana. Ekstrakcija RNK, kvantifikacija, reverzna transkripcija (20 μL sistem; 800 ng RNA ulaz) i qRT-PCR su sprovedeni da se kvantifikuju relativni nivoi ekspresijeRunx2 mRNA, Osx mRNA, Opn mRNA i Ocn mRNA. Rezultati: Slika. 9–12.
[0068] Runx2 i Osx su ključni nizvodni regulatori u BMP signalizaciji, indukujući diferencijaciju osteoblasta. Runx2 je važan u ranoj fazi predaje, dok Osx funkcionira u terminalnoj diferencijaciji. OPN i OCN su važni indikatori za aktivnost osteoblasta i mineralizaciju tkiva. Slika . 9–12 pokazuje da je Primjer 2 povećao relativnu ekspresiju ovih markera, podržavajući poboljšanu diferencijaciju osteoblasta i formiranje kostiju.
[0069] Primjer 2 reguliran navišeBmp2 mRNA(Slika. 13), što ukazuje na aktivacijuBMP/Smad put, koji podržava diferencijaciju osteoblasta i formiranje nove kosti.
[0071] Primjer 2 povećao je relativnu ekspresijuLrp5 mRNA, Lrp6 mRNA i Wnt3 mRNA(Slika. 14–16), podržava aktivacijuWnt/ -catenin signalizacija, što je usko povezano s proliferacijom osteoblasta, diferencijacijom i formiranjem kostiju.
Ekspresija proteina (primjer 2)
[0073] Western blot analiza je pokazala da je Primjer 2 povećanOsxiRUNX2ekspresija proteina (Slika. 17-18), što ukazuje na regulaciju i na transkripcijskom i na translacijskom nivou kako bi se promovirala diferencijacija osteoblasta.
[0075] Ovi testovi aktivnosti pokazuju da je Primjer 2 pružio najbolji efekat proliferacije i da je bio jedini sa dosljednom korelacijom doze i za proliferaciju i za ALP. Primjer 2 je također bio superiorniji od estradiola u promociji proliferacije i mineralizacije MC3T3-E1, sa uporedivim efektima diferencijacije, što sugerira optimalni potencijal podrške gustini kostiju.
Ispitivanje hemijskog sastava
6.1 Sadržaj feniletanoidnih glikozida
[0076] Pozivajući se na "Cistanche" metodu analize u Kineskoj farmakopeji, izmjeren je sadržaj ehinakozida i akteozida u Primjerima 1-3 (rezultati prikazani u Tabeli 1). Na osnovu ehinakozida, akteozida i ukupnih PhG, trend je bio dosljedan: Primjer 3 > Primjer 1 > Primjer 2, a akteozid u Primjeru 3 bio je 3,85× i 4,27× u odnosu na primjere 1 i 2, respektivno. Kombinacija rezultata aktivnosti i sadržaja ukazuje da sami ehinakozid i akteozid ne određuju direktno osteogene efekte.
Tabela 1. Sadržaj ehinakozida i akteozida u ekstraktima Cistanche (%)
| Uzorak (Primjer) | ehinakozid (%) | akteozid/verbaskozid (%) | Ukupno (%) |
|---|---|---|---|
| Primjer 1 | 28.68 | 1.63 | 30.31 |
| Primjer 2 | 26.27 | 1.47 | 27.74 |
| Primjer 3 | 30.39 | 6.27 | 36.66 |
6.2 Ostale komponente (UPLC/Q-TOF/MS)
[0078] UPLC/Q-TOF/MS je korišten za poređenje hemijskih komponenti između primjera 1-3. Vrijednosti odgovora prikazane su u tabeli 2.
[0079] Pored ehinakozida i akteozida, Primjer 2 je sadržavao dodatnekomponente tipa šikiminske kiseline i fenilpropionske kiseline, i takođeralkaloidi. U poređenju sa Primerima 1 i 3, Primer 2 je imao 11 komponenti povezanih sa fenilpropionskom/šikimskom kiselinom sa najvišim odgovorima, uključujući:
Tabela 2. UPLC/Q-TOF/MS vrijednosti odgovora ključnih komponenti u ekstraktima Cistanche (Primjeri 1–3)
注:原表为"响应值(vrijednost odgovora)";我保留为纯数值,不加单位(与图表一致).表内分为:2:Derivati šikimske kiseline i fenilpropionske kiseline(莽草酸及苯丙酸类)与 Alkaloidi(生物碱).
A. Derivati šikimske kiseline i fenilpropionske kiseline
| Compound | Primjer 1 | Primjer 2 | Primjer 3 |
|---|---|---|---|
| izodanfenolna kiselina B (异丹酚酸B) | 1,514,590.932 | 5,985,000.378 | 5,279,315.212 |
| p-hidroksifenilpropionska kiselina (对羟基苯丙酸) | 2,897,237.374 | 6,144,507.902 | 1,139,582.918 |
| Šikimična kiselina (莽草酸) | 6,539,932.014 | 8,883,034.928 | 7,442,038.152 |
| (2R)-2-[(E)-3-[3-[(1R)-1-karboksi-2-(3,4-dihidroksifenil)etoksi]karbonil-2-(3,4-dihidroksifenil)-7-hidroksi-2,3-dihidrobenzofuran-4-il]prop-2-enoil)prop-2-enoil]ofenoksi kiselina | 1,514,590.932 | 5,985,000.378 | 5,279,315.212 |
| benzoilaceton (苯甲酰丙酮) | 4,235,952.540 | 4,526,539.189 | 4,297,281.060 |
| Epipinorezinol 4′-O- -D-glukozid (表丁香树脂酚 4′-O- -D-葡萄糖苷) | 2,758,386.748 | 4,338,477.068 | 1,182,637.856 |
| Yangmei Changshan glikozid* (杨梅常山苷) | 713,259.014 | 9,202,359.822 | 841,791.016 |
| Jionoside A1 (焦地黄苯乙醇苷A1) | 2,184,856.679 | 3,736,929.302 | 3,098,713.743 |
| 3,4-dimetilbenzojeva kiselina (3,4-2甲基苯甲酸) | 585,269.7562 | 1,386,349.28 | 1,400,433.204 |
| Robustaside D | 1,693,753.421 | 3,272,248.064 | 4,236,657.164 |
| 7-[(2S,3R,4S,5S,6R)-3,4,5-trihidroksi-6-[[(2S,3R,4S,5R)-3,4,5-trihidroksitetrahidropiran-2-il]oksimetil]tetrahidropiran-2-il]oksihromen-2-on | 4,489,728.765 | 1,167,879.841 | 824,633.4 |
B. Alkaloidi
| Compound | Primjer 1 | Primjer 2 | Primjer 3 |
|---|---|---|---|
| verticin (野百合碱) | 1,306,481.28 | 524,919.97 | 4,057,704.757 |
| dihidrokoptizin (氢化可他宁碱) | 6,406,217.365 | 9,533,850.521 | 4,649,410.535 |
| timin (胸腺嘧啶) | 2,658,397.084 | 2,715,160.269 | 554,956.4602 |
| gelsemin (钩吻碱) | 3,698,263.919 | 1,554,195.385 | 5,144,366.562 |
| johimbin (育亨宾) | 3,929,806.438 | 1,286,932.427 | 9,431,924.132 |
izodanfenolna kiselina B,
p-hidroksifenilpropionska kiselina,
(2R)-2-[(E)-3-[3-[(1R)-1-karboksi-2-(3,4-dihidroksifenil)etoksi]karbonil-2-(3,4-dihidroksifenil)-7-hidroksi-2,3-dihidrobenzofuran-4-il]prop-2-enoil)prop-2-enoil]ofenoksi kiselina
benzoilaceton,
epipinorezinol 4′-O- -D-glukozid,
glikozid vezan za miricetin (kao što je navedeno),
jonozid A1,
3,4-dimetilbenzojeva kiselina,
robustaside D,
7-[(2S,3R,4S,5S,6R)-3,4,5-trihidroksi-6-[[(2S,3R,4S,5R)-3,4,5-trihidroksitetrahidropiran-2-il]oksimetil]tetrahidropiran-2-il]oksihromen-2-on.
Takođe je sadržavao 5 alkaloida, uključujući:
verticin,
dihidrokoptizin (kao što je navedeno),
timin,
alkaloid vezan za gelsemin (kao što je navedeno),
yohimbine.
[0080] Na osnovu komparativnih rezultata proliferacije/aktivnosti ALP, testova feniletanoidnih glikozida i hemijskog profilisanja, može se zaključiti da feniletanoidni glikozidi (ehinakozid i akteozid), šikimske/fenilpropionske kiseline, alkaloidi i konstitutivni ekstrakt zgloba čine specifičan sastav terpenoida 2. zavisnost od doze (12,5-25 ug/mL) kroz proliferaciju, diferencijaciju i mineralizaciju, omogućavajući stabilne efekte koji podržavaju gustinu kostiju.
[0081] Tabela 2: vrijednosti odgovora komponenti.
[0082] Pronalazak, kroz proces iz Primjera 2, obezbjeđuje ekstrakt Cistanchea sa ukupnim ehinakozidom + akteozid > 25% i obogaćenim šikim/fenilpropionskim kiselinama i alkaloidima, omogućavajući stabilne efekte koji podržavaju gustinu kostiju. Unutar 12,5-25 ug/mL, potiče proliferaciju, diferencijaciju i mineralizaciju MC3T3-E1 na način koji povećava dozu uz dosljednu korelaciju doze, podržavajući bolje i stabilnije zdravstvene rezultate kostiju i omogućavajući upotrebu u proizvodima koji se odnose na poboljšanje mineralne gustoće kostiju.
