Cistanche: Proizvodnja dušikovog oksida izazvana ehinakozidom u endotelnim stanicama: uloge androgenih receptora i PI3K-Akt put

Kontakt: Audrey Hu Whatsapp/hp: 0086 13880143964 Email:audrey.hu@wecistanche.com

LI GU, DANHONG LIAN, YIMEI ZHENG, WEI ZHOU, JINLEI GU i XIN LIU

Uvod

CistancheHoffmg. Et Link je višegodišnja parazitska biljka iz roda porodice Orobanchaceae. HerbaCistanche, stabljikaCistanche deserticolaY. c . MA iCistanche tubulosa(Schenk) R. Weight, korišćeni su kao tonik za lečenje nedostatka bubrega, impotencije, morbidne leukoreje i senilne konstipacije (1), što može biti posledica njegovog regulacionog efekta sličnog androgenu ili polnim hormonima (2).Echinacoside(EcH; c35H46O20;

molekulska težina, 786,73; Slika 1), jedan je od feniletanoidnih glikozida (PhG) izolovanih iz stabljike HerbeCistanche, i pokazuje višestruka biološka svojstva, uključujući antioksidativne, anti-aging, antiinflamatorne, hepatoprotektivne i neuroprotektivne efekte (3). Moderna farmakološka istraživanja su pokazala da različiti sastojci HerbeCistanche, uključujući EcH, akteozid, kankanozu, kankanozid F i cistanozid F, pokazuju vazorelaksantno djelovanje (4).

Endotel je kritični regulator vaskulature, a dušikov oksid (NO) je važan relaksirajući faktor koji oslobađaju endotelne stanice. Difuzijom u ćelije glatkih mišića, NO aktivira gvanilat ciklazu, povećava nivoe cikličkog gvanozin monofosfata (cGMP), a zatim aktivira cGMP zavisne protein kinaze (PKG) kako bi potaknuo relaksaciju glatkih mišića (5). Ranije je pokazano da EcH u 350-400 µM direktno djeluje na glatke mišiće krvnih žila i inhibira proliferaciju uzrokovanu hipoksijom u glatkim mišićnim ćelijama plućne arterije štakora (6), dok je 30-300 µM EcH uzrokovao akutnu vazorelaksaciju u endotelu- intaktni prstenovi na način ovisan o koncentraciji, i povećana proizvodnja cGMP u glatkim mišićima kavernoznog tijela aortnih prstenova kontrahiranih fenilefrin (7). Otvaranjem NO-cGMP-PKG-BKca kanala u ćelijama glatkih mišića, 100 ili 300 µM EcH potisnuo je noradrenalinom indukovanu kontrakciju u plućnim arterijama pacova, posebno u prstenovima bez endotela (8). Endotelne ćelije su ključni regulatori kardiovaskularne funkcije i, u nekoliko slučajeva, otkriveno je da je endotelno zavisna relaksacija posledica prenosive supstance, kao što je NO, koja se oslobađa iz endotela (9). Međutim, uzvodni molekularni mehanizam proizvodnje NO izazvane EcH u vaskularnim endotelnim stanicama zahtijeva dalje istraživanje.

U vaskularnom endotelu stvaranje NO primarno je posredovano endotelnom NO sintazom (eNOS). Nekoliko grupa je pokazalo da put fosfatidilinozitol 3-kinaze (PI3K) aktivira serin treonin protein kinazu B (Akt), što uzrokuje direktnu eNOS fosforilaciju na serin 1177 (Ser1177) (10). Androgeni receptor (AR) je član podfamilije nuklearnih receptora s3, koji kanonski modificira ekspresiju gena. Uključena je lokalizacija AR na kaveole u ćelijskoj membrani

negenomska regulacija funkcije endotelnih ćelija ili ekspresije gena pokretanjem c-Src/PI3K/Akt kaskade, što na kraju rezultira fosforilacijom eNOS i proizvodnjom NO (11). U ljudskim endotelnim ćelijama aorte, prijavljeno je da testosteron aktivira PI3K/Akt signalizaciju i brzo indukuje proizvodnju NO zbog direktne interakcije AR i p85 podjedinice PI3K na kardiovaskularnom sistemu (12). Prijavljeno je da EcH pogoršava simptome povezane s nedostatkom hormona i ispoljava svoje efekte slične androgenu zbog kompetitivnog vezivanja za AR umjesto testosterona (2). Stoga je ova studija pretpostavila da PI3K/Akt put može biti uključen u proizvodnju NO kroz AR-ovisnu fosforilaciju eNOS induciranu EcH. Cilj ove studije bio je procijeniti sljedeće efekte EcH: i) Indukcija proizvodnje NO i fosforilacije eNOS; ii) učešće AR-a u fosforilaciji eNOS-a; i iii) aktivacija PI3K/Akt puta u endotelnim ćelijama ljudske umbilikalne vene (HUVEcs), dobro poznati eksperimentalni model za proučavanje regulacije funkcija endotelnih ćelija i angiogeneze (13).

Materijali i metode

Hemikalije i reagensi.EcH (čistoća, 92,5 posto) dobijen je iz Nacionalnog referentnog standarda za lijekove u Nacionalnom institutu za kontrolu hrane i lijekova. Antitela protiv p-Akt (Ser473; kat. br. ab8805), Akt (kat. br. ab81283), p-eNOS (Ser1177; kat. br. ab184154) i eNOS (kat. br. ab76198) su kupljena od Abcam-a. Inhibitori nilutamida i IcI 182780 su dobijeni od Sigma-Aldrich; Merck KGaA. L-NAME je kupljen od Adamas-Beta, Ltd., a wortmannin je kupljen od Pribolaba.

Cell kulture anddrug tretman.HUVEc su dobijeni od Sciencell Research Laboratories Inc. i uzgajani u mediju endotelnih ćelija (EcM; Sciencell Research Laboratories) sa 5 posto (v/v) fetalnog goveđeg seruma (FBS; Gibco, Thermo Fisher Scientific, Inc.) i 1 posto endotelnih stanica dodatak rasta (ECGS) na 37˚C (5 posto CO2 i 95 posto vlažnost) (14). Po postizanju konfluencije, ćelije su digestirane tripsinom i postavljene u EcM sa 1 posto FBS i 1 posto EcGS. Za sve eksperimente, HUVEc su stavljeni na ploče u koncentraciji od 1x104/ml i uzgajani do konfluencije. Prije tretmana s EcH ili drugim stimulatorima, ćelije su inkubirane u EcM bez fenol crvenog bez FBS i EcGS 6 h da bi se izazvalo

zaustavljanje rasta. U inhibitornim eksperimentima, HUVEc su prethodno inkubirani sa različitim antagonistima ili inhibitorima, uključujući 10 µM nilutamid, 10 µM IcI 182780, 0,5 mM L-NAME ili 5 µM vortmanina, tokom 30 minuta sa ili bez ECH, na 37˚C. U svim grupama, uključujući i kontrolnu, dMSO je korišten kao rastvarač u jednakim koncentracijama od 0,001 posto.

Measurementof intracelularno NOproduction.

Relativne promjene u citosolnoj koncentraciji NO u HUVEc praćene su pomoću fluorescentne NO sonde DAF-FM (Cayman Chemical Company), kao što je ranije objavljeno (12). Ukratko, ćelije su napunjene sa 5 µM DAF-FM diacetata 20 minuta na 37˚C u crnoj mikrotitarskoj ploči i isprane nekoliko puta sa PBS (pH 7,4). Fluorescencija je određena pri talasnim dužinama ekscitacije i emisije od 495 i 515 nm, respektivno, korišćenjem fluorescentnog čitača mikroploča (Biotek Synergy H4; BioTek Instruments, Inc.) i kompaktnog invertovanog mikroskopa (Nikon eclipse Ts2R; Nikon korporacija).

Western mrlja analiza.Kao što je ranije objavljeno (15), konfluentni monoslojevi ćelija su dva puta isprani u ledeno hladnom PBS-u i lizirani RIPA puferom (P0013d; Beyotime Institute of Biotechnology). Koncentracija proteina u supernatantu mjerena je metodom analize bicinhoninske kiseline (16). Nakon toga, 30 µg proteina je napunjeno po stazi, odvojeno korištenjem 10 posto poliakrilamidnih gelova i prebačeno na poliviniliden difluoridne membrane. Membrane su blokirane sa 5% obranog mlijeka 1 h na 25˚C. Nakon inkubacije sa monoklonskim antitijelima protiv Akt (1:1,000 razrjeđenje), p-Akt (1:500 razrjeđenje), eNOS (1:2,000 razrjeđenje) ili p-eNOS (1 :1,000 razrjeđenje) na 4˚C preko noći, membrane su isprane TBST-om (koji sadrži 0,1 posto Tween-20) 4 puta po ~15 min po pranju na 25˚C. Nakon toga, membrane su inkubirane sa sekundarnim antitijelima konjugiranim s peroksidazom hrena (1:5,000 razrjeđenje; anti-mišje antitijelo, kat. br. A0216, ili anti-zečje antitijelo, kat. br. A0208, Beyotime institut biotehnologije) tokom 1 h na 25˚C i detektovan korišćenjem kompleta za poboljšanu hemiluminiscenciju (kat. br. 32209, Thermo Fisher Scientific, Inc.). Intenzitet traka je kvantificiran korištenjem softvera za analizu gela Image J, verzija 1.8.0_112 (Nacionalni instituti za zdravlje).

Mala ometanje (si) RNA priprema i transfekcija.Duge dvolančane RNK su sintetizirane ciljnom mRNA AR i estrogenskim receptorom (ER) sa sekvencama prikazanim u Tabeli I. Uslovi za uništavanje siRNA uključivali su transfekciju HUVEC-a na 70 posto konfluence održavane u neantimikrobnom podloga za kulturu u posudama za kulturu prekrivenim kolagenom od 60 mm. Transfekcija 5 nM AR-siRNA ili 10 nM ER-siRNA sa Lipofectamine 3000 reagensom (Invitrogen; Thermo Fisher Scientific, Inc.) izvedena je odvojeno, prema protokolima proizvođača. Efikasnost transfekcije je procenjena kvantitativnom PcR analizom reverzne transkripcije (RT-qPcR), kao što je ranije objavljeno (17). Uslovi termocikliranja bili su sljedeći: 10 min na 95˚C; 40 ciklusa od 95˚C tokom 5 sekundi i 60˚C tokom 1 min, i kriva topljenja na 95˚C tokom 15 sekundi, 60˚C tokom 1 min i 95˚C tokom 15 sekundi; izvedene su tri nezavisne biološke replike za svaki uzorak. Naredni eksperimenti su sprovedeni 48 h nakon transfekcije. Parovi prajmera su dizajnirani pomoću softvera Primer Premier v5.0 (PREMIER Biosoft) sa sljedećim sekvencama: AR naprijed, 5'-GGTTAcAccAAAGGGcTAGAA-3' i obrnuto, 5'-GAcTTGTAGAGAGAcAGGGTAGA-3'; ER naprijed, 5'-ccAGTAccA ATGAcA AGG GAAG -3' i nazad, 5'-TcAcAGGAccAGAcTccATAA-3'; i GAPdH naprijed, 5'-cAGGGcTGcTTTTAAcTcTGGTAA-3' i nazad, 5'-GGGTGGAATcATATTGGAAcATGT-3'.

Statistički analiza.Svi podaci su predstavljeni kao srednja vrijednost ± standardna devijacija. Statistička poređenja između grupa vršena su korištenjem Kruskal-Wallis testa ili dvosmjerne ANOVA sa Tukeyjevim post hoc testom za višestruka poređenja. P<0.05 was="" considered="" to="" indicate="" a="" statistically="" significant="">

Rezultati

ECH indukuje NO proizvodnja i eNOSphosphorylation.Kao što je prikazano na slikama 2A i B, 1 µM ECH je značajno povećao intracelularnu proizvodnju NO u HUVEc u poređenju sa negativnim kontrolnim ćelijama, dok je stimulativni efekat EcH oslabljen na nivo kontrole prethodnom obradom sa L-NAME. Da bi se dobila optimalna koncentracija, eNOS fosforilacija je testirana 60 minuta nakon tretmana sa EcH u koncentracijama

od {{0}}, 0.01, 0.1, 1 i 10 µM. Rezultati su otkrili da EcH u koncentracijama od 0,01-10 µM može značajno inducirati fosforilaciju eNOS na Ser 1177 na način ovisan o koncentraciji, pri čemu je maksimalna fosforilacija eNOS uočena pri indukciji EcH od 10 µM (sl. 2c i d). Nadalje, eNOS fosforilacija na Ser1177 je ispitana Western blot analizom 0, 5, 15, 30, 60 i 120 minuta nakon inkubacije sa 1 µM EcH. Uočeno je da je fosforilacija eNOS brzo pokrenuta od strane EcH nakon 5 minuta, i da je nastavila da raste do 30 minuta inkubacije (sl. 2E i F). Nakon toga, uprkos tretmanu EcH, relativna veličina eNOS fosforilacije ostala je stabilna od 30 minuta nadalje; stoga, EcH nije uticao na ukupnu ekspresiju eNOS (sl. 2c i E).

AR posreduje ECH-indukovana NO proizvodnja i eNOSinterferirajući efekti AR-siRNA-1 i ER-siRNA-2 bili su najuspješniji u inhibiciji ekspresije AR i ER u HUVEc u ovoj studiji (slika 3). Nakon toga, antagonist za analizu inhibicije funkcije AR i siRNA za analizu gubitka funkcije AR primijenjeni su za procjenu uključenosti AR u EcH-induciranu eNOS aktivaciju i proizvodnju NO. Kao što je prikazano na slici 4A, 1 µM ECH značajno povećava proizvodnju NO u HUVEc (P<0.05). pretreatment="" with="" the="" ar="" antagonist="" nilutamide="" (10="" µm)="" abolished="" ech-induced="" no="" production,="" whereas="" ici182789="" (an="" er="" antagonist)="" did="" not="" exert="" the="" same="" effects.="" furthermore,="" the="" effects="" of="" sirna-mediated="" ar="" knockdown="" on="" no="" production="" were="" examined="" in="" cultured="" cells,="" indicating="" that="" no="" production="" was="" diminished="" by="" transfection="" with="" ar="" sirnas;="" however,="" it="" was="" not="" affected="" by="" er="" sirnas="" or="" control="" random="" sirnas="" (fig.="" 4b).="" representative="" western="" blots="" and="" semi-quantitative="" analysis="" (fig.="" 4c="" and="" d)="" revealed="" that="" the="" phosphorylation="" of="" enos="" induced="" by="" ech="" was="" inhibited="" by="" nilutamide="" and="" ici182789,="" and="" that="" the="" inhibitory="" effect="" of="" nilutamide="" on="" ech-induced="" enos="" activation="" was="" significantly="" higher="" compared="" with="" that="" of="" ici182789,="" which="" indicated="" that="" inhibi-="" tion="" of="" ar="" function="" had="" a="" greater="" impact="" than="" er="" on="" enos="" phosphorylation="" induced="" by="" ech.="" similarly,="" the="" phosphoryla-="" tion="" of="" enos="" induced="" by="" ech="" was="" reduced="" significantly="" in="" cells="" transfected="" with="" ar-sirna="" and="" er-sirna="" compared="" with="" the="" control="" random="" sirna;="" the="" inhibitory="" effect="" of="" ar‑sirna="" on="" ech‑induced="" enos="" activation="" was="" significantly="" stronger="" compared="" with="" that="" of="" er-sirna="" (fig.="" 4e="" and="" f).="" therefore,="" the="" aforementioned="" results="" suggested="" that="" ech="" may="" cause="" ar-dependent="" activation="" of="" enos="" to="" induce="" no="" production="" in="">

ECH aktivira the PI3K/Akt put.U ovoj studiji, Akt fosforilacija na Ser473 je testirana 60 min nakon EcH inkubacije pri koncentracijama 0, 0.01, 0.1 , 1 i 10 µM. Rezultati su pokazali da EcH (0.01-10 µM) može značajno inducirati Akt fosforilaciju. Relativni nivoi ekspresije p-Akt dostigli su maksimum na 1 i 10 µM tretmana EcH (sl. 5A i B). Nadalje, Akt fosforilacija je ispitana Western blot analizom na 0, 5, 15, 30, 60 i 120 minuta nakon dodavanja 1 µM EcH u HUVEc kulture. Kao što je prikazano na slikama 5c i d, EcH je brzo povećao Akt fosforilaciju nakon 5 minuta inkubacije, a maksimalni nivo proteina p-Akt je uočen nakon 60 minuta. Nasuprot tome, EcH nije uticao na ukupnu ekspresiju Akt (slike 5A i c). Štaviše, da bi se istražio potencijalni efekat PI3K puta na fosforilaciju eNOS, HUVEc su prethodno tretirani PI3K inhibitorom vortmaninom pre primene EcH. Utvrđeno je da Wortmannin smanjuje proizvodnju NO izazvanu EcH na početne nivoe (slika 5E). Sličan fenomen je uočen korištenjem fluorescentne mikroskopije prilikom ispitivanja fluorescencije DAF-FM izazvane EcH (slika 5F). Nadalje, wortmanin može imati sposobnost da ukine brzu fosforilaciju eNOS u HUVEcs (sl. 5G i H). Gore navedeni rezultati sugeriraju da EcH može aktivirati fosforilaciju eNOS i proizvodnju NO putem PI3K/Akt puta.

Diskusija

EcH je prirodno jedinjenje izolovano iz HerbeCistanche, sa različitim farmakološkim svojstvima. Ranije je pokazano da EcH ispoljava efekat vaskularne relaksacije ovisan o endotelu otvaranjem NO-cGMP-PKG-BKca kanala u ćelijama glatkih mišića krvnih sudova (7,8). Trenutni nalazi pružaju dokaz da je ECH izvršio AR-zavisnu aktivaciju eNOS-a kako bi inducirao proizvodnju NO uz uključivanje PI3K/Akt signalnog puta u vaskularnim endotelnim ćelijama.

Kao unutrašnji sloj zida žila, endotel može brzo osjetiti i reagirati na promjene u protoku krvi, što zauzvrat dovodi do prijenosa signala u osnovne ćelije glatkih mišića kako bi regulirao vaskularni tonus (18). Opširno je objavljeno da postoji više endotelnih vazodilatacijskih jedinjenja, s najprototipijom tvaribudući da je NO, formiran iz endotelne izoforme eNOS-a, što rezultira fosforilacijom (19). U normalnim uslovima, eNOS ostaje neaktivan kada se veže za kaveolin i aktivira se sledećim nizom događaja u endotelućelije: i) eNOS se odvaja od kaveolina-1 i povezuje sa ca2 plus /caM; ii) protein toplotnog šoka (HSP)90 promoviše eNOSdimerizacija i pogoduje steričnoj formaciji za regrutovanje Akt; i iii) kalcineurin defosforiliše Thr495 kako bi pojačao stanje aktivacije (20). U ovoj studiji, proizvodnja NO je značajno povećana u HUVECs tretiranim sa 1 µM ECH. Ovaj fenomen je bio sličan prethodnim rezultatima, gdje je EcH povećao oslobađanje NO i stimulirao sintezu cGMP u prstenovima torakalne aorte štakora (7). Nadalje, čini se da su dva mjesta fosforilacije, Ser1177 i Thr495, posebno važna za regulaciju aktivnosti eNOS (20), a ova studija je otkrila da je EcH inducirao akutnu fosforilaciju eNOS u Ser1177 na način ovisan o koncentraciji. Osim toga, stimulansi povezani s efektima na nivoe eNOS proteina uglavnom određuju stabilnost eNOS mRNA, a ako se stimulus održava duži vremenski period, dolazi do transkripcije eNOS mRNA preko protein kinaze aktivirane mitogenom i nuklearnog faktora κB (20). Uzeti zajedno, ova zapažanja pokazuju da je aktivacija eNOS-a na Ser1177 odgovorna za sintezu NO izazvanu EcH.

Nadalje, sve veći broj studija je pokazao da se AR eksprimira u endotelnim stanicama u brojnim ljudskim tkivima, što ukazuje na potencijalnu ulogu androgena i njihovih analoga, koji djeluju kroz AR-posredovane procese, u modulaciji ljudskog endotela. ćelijska homeostaza (21). U neklasičnom PI3K/Akt putu, AR može aktivirati PI3K direktnom interakcijom sa PI3K regulatornom podjedinicom p85 (22). Ova studija je pokazala da AR antagonist ili AR siRNA smanjuje proizvodnju NO i fosforilaciju eNOS izazvanu EcH u HUVEcs. Ranije je objavljeno da estrogeni indukuju fosforilaciju eNOS i stimulišu proizvodnju NO putem klasične aktivacije ER u endotelnim ćelijama (23), a davanje ECH značajno pojačava ekspresiju ER u materici (24). Međutim, u ovoj studiji, efekat AR-a bio je izraženiji u poređenju sa ER na EcH-indukovanu aktivaciju eNOS-a i proizvodnju NO. Osim toga, uočeno je da je EcH izazvao akutnu proizvodnju NO u roku od nekoliko minuta putem AR uključene eNOS aktivacije u HUVEcs, što je u skladu s negenomskom prirodom odgovora u endotelnim stanicama. AR je povezan sa proteinima skele, uključujući HSP90, HSP70 i kinazu Src, u citoplazmi, i može se transportovati do membrane iz AR kompleksa u roku od 5 minuta od tretmana testosteronom (23). Na osnovu strategije 'ciljanog ribolova', HSP90 je identificiran kao PhGs-vezana meta, što ukazuje da EcH može olakšati disocijaciju AR-a od proteina skele (25). Druga studija je sugerirala da se EcH u hipotalamusu može kombinovati sa AR džepom kod aminokiselina Met-894 i Val-713 i inhibirati transport citoplazmatskog AR u jezgro (26). Međutim, osnovni mehanizam kroz koji EcH posreduje citoplazmatsku AR translokaciju na membranu zahtijeva dalje istraživanje. Stoga su potrebna daljnja istraživanja kako bi se razjasnio mehanizam putem kojeg EcH postiže AR-ovisnu aktivaciju eNOS-a i kako to može biti povezano s vezivanjem za HSP90 u vaskularnim endotelnim stanicama.

PI3K/Akt put je jedna od najvažnijih signalnih kaskada, čija je aktivacija indukovana proizvodnjom fosfatidilinozitol-3,4,5-trifosfata za vezanje N-terminalnog homološkog domena pleckstrina Ser/ Thr kinase Akt. Ovo olakšava regrutaciju Akt-a na plazma membranu (27). PI3K/Akt put može igrati važnu ulogu u kontroli relaksacije zavisne od NO izazvane EcH.

Ova studija je otkrila da je proizvodnja NO izazvana EcH značajno smanjena kada su ćelije inkubirane sa PI3K inhibitorom vortmaninom. Prethodni izvještaj je pokazao da 15 mg/kg EcH aktivira PI3K/Akt signalni put u ćelijama koštane srži suprimiranim 5-fluorouracilom (28). U ovoj studiji, PI3K inhibitori su značajno smanjili EcH-indukovanu fosforilaciju eNOS na Ser1177. Štaviše, aktivnost Akt je bila pretežno regulisana uzvodnim regulacionim putevima, posebno fosforilacijom zavisnom od PI3K na Ser473 (20). U ovoj studiji, EcH je inducirao Akt fosforilaciju na Ser473 na način ovisan o dozi; Slično tome, prethodna studija je pokazala da 5, 10 ili 20 µM EcH ispoljava kardioprotektivni efekat protiv tretmana anoksije/reperfuzije na način ovisan o dozi, potencijalno povećavajući p-Akt i SLc8A3 (29). Regulacija transkripcije Akt gena ostaje uglavnom nepoznata (30); stoga, ova studija se fokusirala na post-transkripcione regulatorne efekte EcH na Akt. Uzimajući u obzir gore navedene nalaze, zaključeno je da primjena EcH na HUVEcs može dovesti do aktivacije PI3K/Akt puta, koji fosforiliše eNOS i, nakon toga, povećava proizvodnju NO.

Zaključno, EcH je prirodni proizvod koji je uglavnom izoliran iz HerbeCistanche.Potencijalni mehanizam koji leži u osnovi EcH-indukovane proizvodnje NO u endotelnim ćelijama može uključivati ​​sljedeće (slika 6): i) EcH djeluje kao funkcionalni ligand AR koji je lokaliziran na kaveolama u ćelijskoj membrani; ii) PI3K se vezuje za hidrofobni domen Akt na Ser473 i olakšava regrutaciju Akt-a na ćelijsku membranu; iii) regrutovanje PI3K/Akt kaskada pokreće AR-ovisnu eNOS fosforilaciju; i iv) stvaranje NO je posredovano eNOS u endotelnim ćelijama. Opažanje da EcH inducira proizvodnju NO kroz AR-zavisnu fosforilaciju eNOS-a uz uključivanje PI3K/Akt puta može doprinijeti daljem razumijevanju vazorelaksantnih efekata EcH. Nadalje, EcH koji cilja na NO puteve izvedene iz endotela može biti posljedica negenomskih efekata. Stoga, ova studija može pomoći u razjašnjavanju mehanizama kroz koje EcH ispoljava svoje farmakološke efekte u prevenciji kardiovaskularnih bolesti.

Priznanja

Nije primjenjivo.

Finansiranje

Ova studija je podržana od strane Nacionalne fondacije za prirodne nauke Kine (grant br. 81503333).

Dostupnost of podaci i materijala

Skupovi podataka generisani i analizirani tokom ove studije dostupni su od odgovarajućeg autora na razuman zahtjev.

autori doprinosi

LG i XL su osmislili i dizajnirali eksperimente. dL i YZ su izveli eksperimente. WZ i JG analizirali su podatke. LG je izradio rukopis. XL je pregledao i uredio rukopis. Svi autori su pročitali i odobrili konačni rukopis.

1202 GUet al: ECHINACOSID INDUCIRA PROIZVODNJU DUŠIČNOG OKSIDA PUTEM PI3K/AKT OVISNE AR

Etika odobrenje i saglasnost to učestvovati

Nije primjenjivo.

Pacijent saglasnost za publikacija

Nije primjenjivo.

Takmičenje interesovanja

Autori izjavljuju da nemaju suprotstavljene interese.

Reference

1. Komisija kineske farmakopeje:CistancheHerba. U: Farmakopeja Narodne Republike Kine 1. chin. Med. Sci. Press, Peking, str. 135, 2015.

2. Jiang Z, Wang J, Li X i Zhang X: Echinacoside iCistanche tubulosa(Schenk)R. wight poboljšava oštećenje testisa i spermatozoida izazvano bisfenolom A kod pacova putem steroidogenih enzima reguliranih osovinom gonada. J Ethnopharmacol 193: 321-328, 2016.

3. Liu J, Yang L, Dong Y, Zhang B i Ma X: Echinacoside, neprocjenjiv prirodni proizvod u liječenju neuroloških i drugih poremećaja. Molekuli 23: piiE1213, 2018.

4. Yoshikawa M, Matsuda H, Morikawa T, Xie H, Nakamura S i Muraoka O: Feniletanoidni oligoglikozidi i acilirani oligošećeri sa vazorelaksansnom aktivnošću izCistanche tubulosa. Bioorg Med chem 14: 7468-7475, 2006.

5. Arnold WP, ​​Mittal cK, Katsuki S i Murad F: Dušikov oksid aktivira gvanilat ciklazu i povećava nivoe guanozin 3':5'-cikličkog monofosfata u različitim preparatima tkiva. Proc Natl Acad Sci USA 74: 3203-3207, 1977.

6. Gai XY, Tang F, Ma J, Zeng KW, Wang SL, Wang YP, Wuren TN, Lu dX, Zhou Y i Ge RL: Antiproliferativni efekat ehinakosida na ćelije glatkih mišića plućne arterije pacova pod hipoksijom. J Pharmacol Sci 126: 155-163, 2014.

7. He WJ, Fang TH, Ma X, Zhang K, Ma ZZ i Tu PF: Ehinakozid izaziva opuštanje zavisnu od endotela u prstenovima aorte pacova putem NO-cGMP puta. Planta Med 75: 1400-1404, 2009.

8. Gai XY, Wei YH, Zhang W, Wuren TN, Wang YP, Li ZQ, Liu S, Ma L, Lu dX, Zhou Y i Ge RL: Echinacoside inducira vazorelaksaciju plućne arterije štakora otvaranjem NO-cGMP-PKG- BKca kanali i smanjenje intracelularnog ca2 plus nivoa. Acta Pharmacol Sin 36: 587-596, 2015.

9. Maruhashi T, Kihara Y i Higashi Y: Procjena vazodilatacije nezavisne od endotela: Od metodologije do kliničke perspektive. J Hypertens 36: 1460-1467, 2018.

10. Ahmad KA, Ze H, chen J, Khan FU, chen X, Xu J i derivat na endotelnim stanicama ljudske pupčane vene protiv ozljede izazvane oksidativnim stresom: Uključivanje antioksidacije i PI3k/Akt/eNOS/NO signalnih puteva. Biomed Pharmacother 106: 1734-1741, 2018.

11. Yu J, Akishita M, Eto M, Koizumi H, Hashimoto R, Ogawa S, Tanaka K, Ouchi Y i Okabe T: Src kinaza-posreduje negenomsku aktivaciju signalne kaskade zavisnu od androgenog receptora koja dovodi do endotelne sintaze dušikovog oksida . Biochem Bioph Res commun 424: 538-543, 2012.

12. Yu J, Akishita M, Eto M, Ogawa S, Son B, Kato S, Ouchi Y i Okabe T: Androgen receptor zavisna aktivacija endotelne sintaze dušikovog oksida u vaskularnim endotelnim ćelijama: Uloga fosfatidilinozitola {{3} }kinase/Akt pathway.Endocrinology 151: 1822-1828, 2010.

13. Pittarella P, Squarzanti dF, Molinari c, Invernizzi M, Uberti F i Reno F: NO-ovisna proliferacija i migracija izazvana vitaminom d u HUVEc. J Steroid Biochem 149: 35-42, 2015.

14. He Y, Luan Z, Fu X i Xu X: Prekomjerna ekspresija odspojnog proteina 2 inhibira apoptozu endotelnih ćelija ljudske pupčane vene izazvane visokom glukozom. Int J Mol Med 37: 631-638, 2016.

15. Xiao-Hong d, chang-Qin X, Jian-Hua H, Wen-Jiang Z i Bing S: Icariin odgađa endotelno starenje ćelija uzrokovano homocisteinom, uključujući aktivaciju PI3K/AKT-eNOS signalnog puta. Pharm Biol 51: 433-440, 2013.

16. Smith PK, Krohn RI, Hermanson GT, Mallia AK, Gartner FH, Provenzano Md, Fujimoto EK, Goeke NM, Olson BJ i Klenk dc: Measurement of protein using bicinchoninic acid. Anal Biochem 150: 76-85, 1985.

17. Gu L, Zhong X, Lian d, Zheng Y, Wang H i Liu X: Biosinteza triterpenoida i transkripcijski odgovor izazvan dušičnim oksidom u potopljenoj fermentacijiGanoderma lucidum. Process Biochem 60: 19-26, 2017.

18. Ellinsworth dc, Sandow SL, Shukla N, Liu Y, Jeremy JY i Gutterman dd: Hiperpolarizacija i koronarna vazodilatacija izvedena iz endotela: raznolike i integrirane uloge epoksi-ikozatrienske kiseline, vodikovog peroksida i praznina. Mikrocirkulacija 23: 15-32, 2016.

19. Freed JK i Gutterman dd: komunikacija je ključna: Mehanizmi intercelularne signalizacije u vazodilataciji. J cardiovasc Pharm 69: 264-272, 2017.

20. Quillon A, Fromy B i Debret R: Senziranje mikrookruženja endotela koji dovodi do vazodilatacije posredovane azotnim oksidom: Pregled nervnih i biomehaničkih signala. Azot oksid 45: 20-26, 2015.

21. Torres-Estay V, Carreno dV, Francisco IF, Sotomayor P, Godoy AS i Smith GJ: Androgeni receptor u ljudskim endotelnim ćelijama. J Endocrinol 224: 131-137, 2015.

22. deng Q, Zhang Z, Wu Y, Yu WY, Zhang J, Jiang ZM, Zhang Y, Liang H i Gui YT: Negenomsko djelovanje androgena je posredovano brzom fosforilacijom i regulacijom trgovine androgenim receptorima. Cell Physiol Biochem 43: 223-236, 2017.

23. de Oliveira TS, de Oliveira LM, de Oliveira LP, costa RMd, Tostes Rc, Georg Rc, costa EA, Lobato NS, Filgueira FP i Ghedini Pc: Aktivacija PI3K/Akt puta posredovanog receptorima estrogena objašnjava estronom indukovanu vaskularna aktivacija cGMP signalizacije. Vascul Pharmacol 110: 42-48, 2018.

24. Li F, Yang X, Yang Y, Guo c, Zhang c, Yang Z i Li P: Antiosteoporotska aktivnost ehinakozida kod pacova sa ovariektomijom. Fitomedicina 20: 549-557, 2013.

25. Zeng KW, Liao LX, Wan YJ, Jiang Y i Tu PF: Identifikacija farmakoloških ciljeva i analiza efikasnosti feniletanoidnih glikozida izCistanchesHerba zasnovana na strategiji 'ciljanog ribolova'. chin Tradit Herbal drugs 49: 173-178, 2018.

26. Jiang Z, Zhou B, Li X, Kirby GM i Zhang X: Ehinakozid povećava količinu sperme kod pacova ciljajući hipotalamski androgeni receptor. Naučni predstavnik 8: 3839-3850, 2018.

27. Coffer PJ, Jin J i Woodgett JR: Protein kinaza B (c-Akt): multifunkcionalni medijator aktivacije fosfatidilinozitol 3-kinaze. Biochem J 335, 1-13, 1998.

28. Wang S, Zheng G, Tian S, Zhang Y, Shen L, Pak Y, Shen Y i Qian J: Echinacoside poboljšava hematopoetsku funkciju kod 5-FU-indukovane mijelosupresivne miševe. Life Sci 123: 86-92, 2015.

29. chen M, Wang X, Hu B, Zhou J, Wang X, Wei W i Zhou H: Zaštitni efekti ehinakozida protiv ozljede anoksije/reperfuzije u ćelijama H9c2 putem pojačane regulacije p-AKT i SLc8A3. Biomed Pharmacother 104: 52-59, 2018.

30. Abeyrathna P i Su Y: Kritična uloga Akt-a u kardiovaskularnoj funkciji. Vascul Pharmacol 74: 38-48, 2015.