Polisaharid Cistanche Deserticola inhibira gubitak kostiju izazvan OVX kod miševa i osteoklastogenezu izazvanu RANKL

Molimo kontaktirajteoscar.xiao@wecistanche.comza više informacija

SAŽETAK

Osteoporoza je ozbiljna bolest kostiju koja pogađa stariju populaciju. Dokazano je da Cistanche deserticola (CD), tonik i medicinska hrana koja se široko koristi u Kini, pruža efikasan tretman za osteoporozu. Cistanche deserticola polisaharid (CDP), ekstrahovan iz CD-a, poseduje različita farmakološka svojstva, ali njegova uloga uosteoklastičnoformiranje i funkcija, kao i osteoporoza, ostaju nepoznati. Svrha ove studije bila je ekstrakcija i pročišćavanje CDP-a kako bi se dalje istražio njegov potencijalni mehanizam djelovanja na osteoporozu. Rezultati su pokazali da je CDP tretman spriječio osteoporozu izazvanu OVX-om i poboljšao gubitak koštane mase potiskivanjem aktivnosti i funkcije osteoklasta. Nadalje, CDP tretman značajno je inhibirao osteoklastogenezu izazvanu RANKL-om, resorpciju kostiju i ekspresiju gena specifičnu za osteoklaste. Mehanički, CDP je inhibirao RANKL-indukovanu aktivaciju NF-κB i MAPKs signalnih puteva i posljedično utjecao na nizvodnu aktivaciju NFATc1. Nalazi ove studije sugeriraju da je CDP potencijalno siguran lijek za liječenje osteoporoze. (10 prednosti koje Cistanche može dati)

Molimo kliknite ovdje da saznate više

Uvod

Osteoporoza—bolest koju karakteriše smanjena koštana masa, abnormalna mikrostruktura koštanog tkiva, povećana krhkost kostiju i fraktura (De Martinis, Di Benedetto, Mengoli i Ginaldi, 2006)— trenutno pogađa više od 200 miliona ljudi širom svijeta i predstavlja značajnu medicinsku i socioekonomsko opterećenje modernog društva (Strom et al., 2011). Klinički tretman osteoporoze uglavnom se fokusira na nadoknadu hormona,bisfosfonatili terapiju denosumabom. Ove metode su efikasne, ali predstavljaju dugoročne nuspojave kao što su potencijalni rizik od raka dojke i atipičnih prijeloma butne kosti (Black, Bauer, Schwartz, Cummings i Rosen, 2012; Rachner, Khosla, & Hof Bauer, 2011). Stoga postoji hitna potreba za istraživanjem lijekova koji ne samo da mogu inhibirati osteoporozu, već imaju i manje neželjenih nuspojava. Cistanche deserticola (CD), tonik i ljekovita hrana koja se široko koristi u Kini, poznata kao "pustinjski ginseng", je sušena sočna stabljika s ljuskavim lišćem C. deserticola YC Ma (Gu, Yang, & Huang, 2016.) i ima različite i efikasne farmakološke aktivnosti, kao što je regulacija imuniteta,antioksidacijai svojstva protiv osteoporoze (Hu et al., 2020; Li et al., 2012; Zhang et al., 2014). Prethodne studije o aktivnim supstancama CD-a u liječenju osteoporoze uglavnom su se fokusirale na feniletanoidne glikozide (Li, Jiang, & Gu, 2018; Xu, Zhang, Wang, Yao, & Ma, 2017). Međutim, CD sadrži i druge efikasne komponente kao što su iridoidi, lignani, polisaharidi (Wang, Zhang i Xie, 2012). Klinička primjena tradicionalne kineske medicine (TCM) uglavnom je dekotiranje vode. Polisaharidi su komponente rastvorljive u vodi i najverovatnije će biti glavne farmakodinamičke komponente TCM. Za polisaharide ekstrahovane iz TCM-a je poznato da imaju anti-osteoporozni efekat i nekoliko neželjenih nuspojava, koje se generalno koriste u klinikama (npr. polisaharidi ekstrahovani izEpimedium brevicornum(Zheng, He, Wu, Cai, & Wei, 2020), Achyranthes bidentata (Zhang, Zhang, Zhang, Wang i Yan, 2018) i Morinda officinalis (Yan et al., 2019)). Stoga smo to pretpostaviliPolisaharid Cistanche deserticola(CDP) ekstrahovan iz CD-a može biti potencijalno siguran lijek za liječenje osteoporoze. Tipično, resorpcija kostiju i formiranje kosti održavaju dinamičku ravnotežu tokom remodeliranja kosti u koordinaciji s nekoliko vrsta ćelija, uključujući osteoklaste,osteoblasti, ćelije obloge kostiju i osteociti (Kular, Tickner, Chim, & Xu, 2012). Kršenje ove ravnoteže može rezultirati raznim metaboličkim bolestima kostiju, kao što su osteoporoza (Zhu et al., 2018) i osteoskleroza (Ihde et al., 2011). Osteoklasti, kao krajnje diferencirane ćelije izvedene iz mononuklearne/makrofagne loze, jedine su ćelije sa funkcijom resorpcije kosti (Teitelbaum, 20{{106}}0). Postoje dva ključna citokina koji učestvuju u diferencijaciji i sazrijevanju osteoklasta (Koga et al., 2004): faktor stimulacije kolonije makrofaga (M-CSF) i receptorski aktivator liganda nuklearnog faktora κB (NF-κB) (RANKL). M-CSF posreduje u diferencijaciji hematopoetskih matičnih ćelija u progenitore osteoklasta i promoviše diferencijaciju osteoklasta tako što reguliše ekspresiju RANK receptora (Takayanagi, 2007). Vezivanje RANKL i RANK na površini ćelije osteoklasta rezultira sljedećim: (1) regrutacijom signalnih adapterskih molekula kao što je faktor 6 povezan s TNF receptorom (TRAF6); (2) aktivacija više nizvodnih ciljeva, uključujući NF-κB i protein kinaze aktivirane mitogenom (MAPK); i (3) povećanje nivoa ekspresije nuklearnog faktora aktiviranih T-ćelija, citoplazmatski 1 (NFATc1) (Liu et al., 2019; Yamashita et al., 2007). Aktivacija ovih signalnih puteva direktno reguliše ekspresiju gena za osteoklaste, uključujući kiselu fosfatazu 5 (Acp5) [kodiranje kisele fosfataze otporne na tartarat (TRAcP)], matriks metaloproteinazu 9 (MMP9) i katepsin K (CTSK) (Boyle, Simonet) , & Lacey, 2003). Stoga je inhibicija RANKL-induciranih signalnih puteva povezanih s diferencijacijom osteoklasta potencijalna terapijska metoda za osteoporozu. U ovoj studiji, imali smo za cilj da utvrdimo efekte tretmana CDP na mišji model osteoporoze izazvane ovariektomijom (OVX) in vivo i na aktivnost osteoklasta in vitro izazvanu RANKL, sa fokusom na ekspresiju gena specifičnih za osteoklaste i aktivaciju NFATc1 i NF-κB i MAPKs signalnih puteva. Naša otkrića mogu pružiti novi uvid u potencijal CDP-a kao sigurnog i efikasnog lijeka za liječenje osteoporoze. 2. Materijali i metode 2.1. CD sa hemikalijama i prikupljanjem uzoraka (br. 180801) kupljen je od Anhui Jishun Traditional Chinese Medicine Co., Ltd. (Anhui, Kina) i identifikovao ga je profesor Haibo Huang sa Fakulteta farmaceutskih nauka Univerziteta kineske medicine Guangdžou, Guangdžou, Kina . Tablete estradiol valerata kupljene su od Bayera (Leverkuzen, Sjeverna Rajna Vestfalija, Njemačka). Alfa-modifikovani minimalni esencijalni medij (-MEM) i fetalni goveđi serum (FBS) dobijeni su od Gibco-a (Thermo Fisher Scientific, Waltham, MA, SAD). Penicilin/streptomicin i TRAcP komplet za bojenje nabavljeni su od Solarbio (Peking, Kina). Rekombinantni mišji M-CSF i rekombinantni mišji RANKL nabavljeni su od R&D Systems (Minneapolis, MN, SAD). Ploče obložene hidroksiapatitom kupljene su od Corning Life Sciences (St. Lowell, MA, SAD). Primarna antitela za NFATc1 i CTSK (Santa Cruz Biotechnology, Santa Cruz, Kalifornija, SAD); IκB-, p65, P-p65, p38, P-p38, ERK1/2, P-ERK1/2, JNK i P-JNK (Tehnologija ćelijske signalizacije, Dan vers, MA, SAD); i -aktin (CWBIO, Peking, Kina) je takođe dobijen. Ostali reagensi korišćeni u ovoj studiji bili su analitičke čistoće, a voda je prečišćena Milli-Q sistemom za prečišćavanje vode (Millipore, Bedford, MA, SAD). 2.2. Ekstrakcija CDP-a CD je samleven u fini prah i tri puta pomešan sa petroleterom da bi se pobedio. Čvrsti ostatak je sakupljen filtracijom i zatim osušen na sobnoj temperaturi. Polisaharidi su ekstrahovani iz prethodno tretiranih uzoraka tri puta vodom po 2 h, koncentrirani, precipitirani dodatkom bezvodnog etanola do konačne koncentracije od 80 posto (v/v) i čuvani na 4 ◦C 24 h. Precipitati su sakupljeni centrifugiranjem na 3000 rpm u trajanju od 20 min, otopljeni u destilovanoj vodi i pročišćeni (uklanjanje slobodnih proteina) Sevag metodom (Zhao et al., 2019). Dobijeni polisaharidi su dijalizirani, osušeni i pohranjeni do daljnje upotrebe. Nadalje, rezultati hemijskog sastava su pokazali da je ukupan sadržaj šećera, uronske kiseline, sulfata i proteina u CDP bio 67,63 ± 0,98 posto, 21,05 ± 0,49 posto, 1,90 ± 0,24 posto i 8,81 ± 0,36 posto. Sastav monosaharida i infracrvena analiza CDP-a Fourierove transformacije prikazani su na dopunskim slikama 1 i 2. 2.3. Mišji model osteoporoze izazvan OVX Sve eksperimente na životinjama odobrio je Komitet za etiku na životinjama Univerziteta kineske medicine Guangzhou (odobren SYXK 2019-0202). Trideset 6-nedeljnih ženki C57BL/6 miševa je isporučeno iz Centra za eksperimentalne životinje sa Univerziteta kineske medicine Guangdžou. Nakon 1 sedmice aklimatizacije, jedna grupa miševa je podvrgnuta lažnoj operaciji (Sham grupa), dok su preostali miševi podvrgnuti operaciji ovariektomije (OVX grupa). Nakon operacije, miševima je dozvoljeno da se oporave 1-sedmicu. Zatim su uspješno modelirani miševi nasumično podijeljeni u 5 grupa, sa 6 miševa po grupi: (1) lažna grupa: tretirana destilovanom vodom, (2) OVX grupa: tretirana destilovanom vodom, (3) OVX plus E2 grupa (E2) : liječen tabletama estradiol valerata od 0,13 mg/kg, (4) OVX plus CDP grupa niske doze (CDP-L): liječena sa 300 mg/kg CDP, (5) OVX plus CDP grupa sa visokom dozom (CDP H): liječena sa 600 mg/kg CDP. Destilirana voda, E2 ili CDP davana je gavažom jednom dnevno. Svi miševi su žrtvovani nakon 12- sedmičnog perioda tretmana (slika 1A). Sakupljene su i izvagane materice, a lijeve tibije za naknadne preglede. Uzorci pune krvi su sakupljeni i centrifugirani na 5000 rpm tokom 15 minuta na 4 ◦C. Supernatanti seruma su aspirirani i čuvani na -80 ◦C do daljnje analize. 2.4. Analiza mikro-kompjuterskom tomografijom (mikro-CT) i histomorfometrija kosti Lijeve tibije su fiksirane sa 4 posto paraformaldehida na 48 h i potom stavljene u epruvete za centrifugiranje koje sadrže normalni fiziološki rastvor. Fiksni uzorci su skenirani Skyscan 1172 mikro-CT instrumentom (Bruker micro-CT, Skyscan, Kontich, Belgija) koristeći sljedeće postavke: napon, 80 kV; struja izvora, 100 μA; Al, filter 0,5 mm; veličina piksela, 9,76 μm; i korak rotacije, 0,6◦. Nekoliko parametara trabekularne kosti, uključujući mineralnu gustinu kosti (BMD), zapreminsku frakciju kosti (BV/TV), površinu kosti po ukupnom volumenu (BS/TV), trabekularni broj (Tb. N) i trabekularni razmak (Tb.Sp ) mjereni su pomoću softvera CT Analyser® (Bruker micro-CT, Skyscan). Trodimenzionalne slike su generisane korišćenjem softvera CTVol (Bruker micro-CT. Skyscan). Nakon mikro-CT analize, leve tibije su dekalcifikovane u 14-postotnom rastvoru EDTA i ugrađene u parafin za sečenje. Uzorci su isječeni na dijelove od 5 µm pomoću mikrotoma prije eksperimenata bojenja hematoksilinom i eozinom (H&E) i TRAcP. Obojeni preseci su pregledani i dokumentovani korišćenjem Olympus CX 31 mikroskopa (Olympus Optical Co., Ltd, Tokio, Japan). 2.5. Analiza seruma Koncentracije kalcijuma (Ca) i fosfora (P) određivane su prema instrukcijama kompleta koje je dizajnirao Nanjing Jiancheng Bioengineering Institute (Nanjing, Kina). Nivoi TRAcP-5b i RANKL u serumu su analizirani pomoću TRAcP-5b ELISA kompleta (CUSABIO, Wuhan, Kina) i RANKL ELISA kompleta (Cloud-CloneCorp., Wuhan, Kina), respektivno.

CD sa hemikalijama i prikupljanjem uzoraka (br. 180801) kupljen je od Anhui Jishun Traditional Chinese Medicine Co., Ltd. (Anhui, Kina) i identifikovao ga je profesor Haibo Huang sa škole Farmaceutske nauke, Univerzitet kineske medicine Guangdžou, Guangdžou, Kina. Tablete estradiol valerata kupljene su od Bayera (Leverkuzen, Sjeverna Rajna Vestfalija, Njemačka). Alfa-modifikovani minimalni esencijalni medij (-MEM) i fetalni goveđi serum (FBS) dobijeni su od Gibco-a (Thermo Fisher Scientific, Waltham, MA, SAD). Penicilin/streptomicin i TRAcP komplet za bojenje nabavljeni su od Solarbio (Peking, Kina). Rekombinantni mišji M-CSF i rekombinantni mišji RANKL nabavljeni su od R&D Systems (Minneapolis, MN, SAD). Ploče obložene hidroksiapatitom kupljene su od Corning Life Sciences (St. Lowell, MA, SAD). Primarna antitela za NFATc1 i CTSK (Santa Cruz Biotechnology, Santa Cruz, Kalifornija, SAD); IκB-, p65, P-p65, p38, P-p38, ERK1/2, P-ERK1/2, JNK i P-JNK (Tehnologija ćelijske signalizacije, Dan vers, MA, SAD); i -aktin (CWBIO, Peking, Kina) je takođe dobijen. Ostali reagensi korišćeni u ovoj studiji bili su analitičke čistoće, a voda je prečišćena Milli-Q sistemom za prečišćavanje vode (Millipore, Bedford, MA, SAD). 2.2. Ekstrakcija CDP-a CD je samleven u fini prah i tri puta pomešan sa petroleterom da bi se pobedio. Čvrsti ostatak je sakupljen filtracijom i zatim osušen na sobnoj temperaturi. Polisaharidi su ekstrahovani iz prethodno tretiranih uzoraka tri puta vodom po 2 h, koncentrirani, precipitirani dodatkom bezvodnog etanola do konačne koncentracije od 80 posto (v/v) i čuvani na 4 ◦C za 24 h. Precipitati su sakupljeni centrifugiranjem na 3000 o/min u trajanju od 20 min, rastvoreni u destilovanoj vodi i prečišćeni (uklanjanje slobodnih proteina) metodom Sevag (Zhao et al., 2019). Dobijeni polisaharidi su dijalizirani, osušeni i pohranjeni do daljnje upotrebe. Nadalje, rezultati hemijskog sastava su pokazali da je ukupan sadržaj šećera, uronske kiseline, sulfata i proteina u CDP bio 67,63 ± 0,98 posto, 21,05 ± 0,49 posto, 1,90 ± 0,24 posto i 8,81 ± 0,36 posto. Sastav monosaharida i infracrvena analiza CDP-a Fourierove transformacije prikazani su na dopunskim slikama 1 i 2. 2.3. Mišji model osteoporoze izazvan OVX Sve eksperimente na životinjama odobrio je Komitet za etiku na životinjama Univerziteta kineske medicine Guangzhou (odobren SYXK 2019-0202). Trideset 6-nedeljnih ženki C57BL/6 miševa je isporučeno od Centra za eksperimentalne životinje sa Univerziteta kineske medicine Guangdžou. Nakon 1 sedmice aklimatizacije, jedna grupa miševa je podvrgnuta lažnoj operaciji (Sham grupa), dok su preostali miševi podvrgnuti operaciji ovariektomije (OVX grupa). Nakon operacije, miševima je dozvoljeno da se oporave 1-sedmicu. Zatim su uspješno modelirani miševi nasumično podijeljeni u 5 grupa, sa 6 miševa po grupi: (1) lažna grupa: tretirana destilovanom vodom, (2) OVX grupa: tretirana destilovanom vodom, (3) OVX plus E2 grupa (E2) : liječen tabletama estradiol valerata od 0,13 mg/kg, (4) OVX plus CDP grupa niske doze (CDP-L): liječena sa 300 mg/kg CDP, (5) OVX plus CDP grupa sa visokom dozom (CDP H): liječena sa 600 mg/kg CDP. Destilirana voda, E2 ili CDP davana je gavažom jednom dnevno. Svi miševi su žrtvovani nakon 12- sedmičnog perioda tretmana (slika 1A). Sakupljene su i izvagane materice, a lijeve tibije za naknadne preglede. Uzorci pune krvi su sakupljeni i centrifugirani na 5000 rpm tokom 15 minuta na 4 ◦C. Supernatanti seruma su aspirirani i čuvani na -80 ◦C do daljnje analize. 2.4. Analiza mikro-kompjuterskom tomografijom (mikro-CT) i histomorfometrija kosti Lijeve tibije su fiksirane sa 4 posto paraformaldehida na 48 h i potom stavljene u epruvete za centrifugiranje koje sadrže normalni fiziološki rastvor. Fiksni uzorci su skenirani Skyscan 1172 mikro-CT instrumentom (Bruker micro-CT, Skyscan, Kontich, Belgija) koristeći sljedeće postavke: napon, 80 kV; struja izvora, 100 μA; Al, filter 0,5 mm; veličina piksela, 9,76 μm; i korak rotacije, 0,6◦. Nekoliko parametara trabekularne kosti, uključujući mineralnu gustinu kosti (BMD), zapreminsku frakciju kosti (BV/TV), površinu kosti po ukupnom volumenu (BS/TV), trabekularni broj (Tb. N) i trabekularni razmak (Tb. Sp ) mjereni su pomoću softvera CT Analyser® (Bruker micro-CT, Skyscan). Trodimenzionalne slike su generisane korišćenjem softvera CTVol (Bruker micro-CT. Skyscan). Nakon mikro-CT analize, leve tibije su dekalcifikovane u 14-postotnom rastvoru EDTA i ugrađene u parafin za sečenje. Uzorci su isječeni na dijelove od 5 µm pomoću mikrotoma prije eksperimenata bojenja hematoksilinom i eozinom (H&E) i TRAcP. Obojeni preseci su pregledani i dokumentovani korišćenjem Olympus CX 31 mikroskopa (Olympus Optical Co., Ltd, Tokio, Japan). 2.5. Analiza seruma Koncentracije kalcija (Ca) i fosfora (P) određene su prema uputama kompleta koje je dizajnirao Nanjing

Institut za bioinženjering Jiancheng (Nanjing, Kina). Nivoi TRAcP{{0}}b i RANKL u serumu analizirani su pomoću TRAcP-5b ELISA kompleta (CUSABIO, Wuhan, Kina) i RANKL ELISA kompleta (Cloud-CloneCorp., Wuhan, Kina) , odnosno. 2.6. In vitro test osteoklastogeneze BMM su izolovani iz tibije i femura 6-nedeljnih ženki C57BL/6 miševa. Izolirane ćelije su uzgajane u -MEM mediju koji sadrži 25 ng/mL M-CSF, 10 posto FBS i 1 posto penicilina/streptomicina. Po dostizanju konfluencije, BMM-ovi (1 × 104 ćelije/bažirić) su posađeni u 96-ploče sa jažicom i tretirani sa CDP u prisustvu 50 ng/mL RANKL. Medij i CDP su zamijenjeni svaka 2 dana. Nakon 7 dana, ćelije su fiksirane sa 4 posto paraformaldehida i obojene na prisustvo tragova. Broj osteoklasta, definisanih kao TRAcP pozitivne ćelije sa tri ili više jezgara, prebrojan je i dokumentovan pomoću svetlosnog mikroskopa. 2.7. Test ćelijske proliferacije BMM (1 × 104 ćelije/jažici) su zasijani u 96-ploču i inkubirani preko noći. Nakon toga, ćelije su tretirane različitim koncentracijama CDP-a (0, 0,625, 1,25, 2,5, 5, 10, 20 i 40 µg/mL) tokom 48 h. Spajanje ćelija je detektovano i analizirano korišćenjem IncuCyte ZOOM® (Essen BioScience, Ann Arbor, MI, SAD), dugotrajnog sistema za dinamičko snimanje živih ćelija u realnom vremenu. 2.8. Test resorpcije hidroksiapatita BMM (1 × 104 ćelije/jažici) zasijani su u ploču obloženu hidroksiapatitom, tretirani CDP u naznačenim koncentracijama (0, 5 i 10 µg/mL) i kultivisani u kompletnom -MEM-u koji sadrži 25 ng/ mL M-CSF i 50 ng/mL RANKL. Nakon 7 dana, ćelije su isprane 10-postotnom otopinom izbjeljivača kako bi se uklonile ćelijske komponente. Slike područja resorpcije hidroksiapatita snimljene su korištenjem IncuCyte ZOOM® i analizirane korištenjem softvera ImageJ (NIH, Bethesda, MD, USA) (Abramoff, Magelhaes, & Ram, 2003). 2.9. Izolacija RNK i kvantitativna PCR analiza reverzne transkripcije u realnom vremenu (RT-qPCR) BMMs (1 × 105 ćelija/jažici) su posađene u ploču 6-jažice i stimulirane sa RANKL i M-CSF u prisustvu CDP u različitim koncentracijama (0, 5 i 10 µg/mL) tokom 5 dana. Ukupna RNK je izolovana iz ćelija ili koštanog tkiva miševa pomoću TRIzol reagensa (Sigma Aldrich). Komplementarna DNK je sintetizirana iz 2 µg ukupne RNK pomoću kompleta reverzne transkriptaze (TransGen Biotech, Peking, Kina). RT-qPCR reakcije su pripremljene korišćenjem PerfectStart™ Green qPCR SuperMix (TransGen Biotech) i detektovane pomoću ABI 7500 sistema (Applied Biosystems, Thermo Fisher Scientific, Inc., Waltham, MA, SAD). Parametri ciklusa za PCR su postavljeni na sljedeći način: 95 ◦C u trajanju od 5 minuta, nakon čega slijedi 40 ciklusa od 95 ◦C tokom 15 s i 60 ◦C tokom 30 s. Korišteni specifični prajmeri prikazani su u Tabeli 1, a količina svakog ciljnog gena je normalizirana na GAPDH (interna kontrola).

2.10. Western blot analiza BMM-ovi (5 × 105 ćelija/jažici) su zasijani u 6-ploču sa jažicom. Za eksperimente kratkog vremenskog toka, ćelije su prethodno inkubirane sa različitim koncentracijama CDP (0, 5 i 10 µg/mL) 1 h, a zatim tretirane sa 5{{ 58}} ng/mL RANKL tokom 30 min. Dugotrajno, ćelije su stimulisane sa 50 ng/mL RANKL 3, 5 i 7 dana u prisustvu CDP (0, 5 i 10 µg/mL). Ukupni proteini su ekstrahovani korišćenjem RIPA pufera za lizu (CWBIO). Proteini su odvojeni sa 10 posto SDS-PAGE i prebačeni u PVDF membrane. Membrane su blokirane 5% obranog mlijeka na sobnoj temperaturi 2 h, inkubirane sa primarnim antitelima preko noći na 4 ◦C, a zatim sa odgovarajućim sekundarnim antitelima 1,5 h. Membrane su razvijene korišćenjem ECL reagensa (Millipore Corp., Billerica, MA, SAD), a slike su snimljene korišćenjem Tanon 5200 Chemiluminescence Imaging System (Tanon Science and Technology, Šangaj, Kina). 2.11. Detekcija translokacije NFATc1 korišćenjem imunofluorescentnog testa BMM je zasejan na 12-pokrivna stakala, stimulisan sa RANKL i M-CSF i tretiran sa 10 µg/mL CDP tokom 5 dana. Ćelije su fiksirane sa 4 posto paraformaldehida u trajanju od 15 minuta, isprane tri puta sa PBS i permeabilizirane sa 0,1 posto Triton X-100 tokom 10 minuta. Ćelije su pomiješane sa 10 posto kozjeg seruma (CWBIO) i inkubirane 2 h. Nakon toga, ćelije su inkubirane sa primarnim antitelom preko noći na 4 ◦C, a zatim sa Alexa Fluor 488 kozjim antimišjim sekundarnim antitelom (Abcam, Cambridge, MA, USA) u mraku 1 h. Poklopci su oprani PBS-om, postavljeni u Prolong Gold Antifade Reagens sa 4′, 6-diamidino-2-fenil in-dolom (DAPI) (Solar), i pregledani pomoću Zeiss LSM 800 sa Airyscan konfokalnim mikroskopom ( Carl Zeiss, Oberkochen, Njemačka). 2.12. Statistička analiza Svi eksperimentalni podaci analizirani su pomoću statističkog softvera SPSS 25.0 (IBM Corporation, Armonk, NY, USA). Podaci za studije na životinjama i ćelijama izraženi su kao srednja vrednost ± SEM i sredina ± SD, respektivno. Rezultati su korištenjem jednosmjerne analize varijanse ili Studentovog t-testa. Vrijednosti p < 0,05="" smatrane="" su="" statistički="" značajnim.="" 3.="" rezultati="" 3.1.="" cdp="" sprečava="" gubitak="" koštane="" mase="" izazvan="" ovx="" in="" vivo="" koristili="" smo="" mišji="" model="" osteoporoze="" izazvane="" ovx="" da="" bismo="" istražili="" efekte="" tretmana="" cdp="" na="" osteoporozu="" in="" vivo.="" u="" poređenju="" sa="" sham="" grupom,="" tjelesna="" težina="" ovx="" miševa="" se="" značajno="" povećala,="" dok="" je="" indeks="" uterusa="" smanjen,="" što="" ukazuje="" da="" je="" model="" osteoporoze="" uspješno="" konstruiran="" (sl.="" 1b="" i="" d).="" mikro-ct="" analiza="" tibije="" u="" ovx="" grupi="" pokazala="" je="" veliki="" gubitak="" kosti.="" u="" poređenju="" sa="" ovx="" grupom,="" broj="" koštanih="" trabekula="" je="" povećan="" u="" cdp-l="" grupi,="" dok="" je="" povećanje="" u="" cdp-h="" i="" e2="" grupama="" bilo="" značajnije,="" a="" trabekule="" u="" poslednje="" dve="" grupe="" su="" postale="" grublje="" i="" jaz="" je="" postao="" manji="" (="" slika="" 1c).="" kvantitativna="" analiza="" je="" potvrdila="" da="" nekoliko="" histomorfometrijskih="" parametara="" kostiju,="" uključujući="" bmd,="" bv/tv,="" bs/tv="" i="" tb.="" n="" je="" imao="" značajno="" povećane="" vrijednosti,="" dok="" je="" tb.="" sp="" je="" pokazao="" smanjene="" vrijednosti="" u="" cdp-h="" grupi="" (sl.="" 1e="" i="" f).="" njegovo="" patološko="" ispitivanje="" h&e="" bojenjem="" pokazalo="" je="" da="" je="" broj="" koštanih="" trabekula="" u="" cdp-h="" i="" e2="" grupama="" značajno="" veći="" nego="" u="" ovx="" grupi,="" dok="" nije="" bilo="" značajnog="" poboljšanja="" u="" cdp-l="" grupi="" (slika="" 1g).="" dodatno,="" tracp="" bojenje="" je="" pokazalo="" da="" se="" broj="" osteoklasta="" značajno="" povećao="" u="" ovx="" grupi,="" ali="" se="" smanjio="" u="" cdp-h="" i="" e2="" grupama="" (slika="" 1h).="" cdp-l,="" cdp-h="" i="" e2="" grupe="" su="" pokazale="" da="" inhibiraju="" ovx-indukovano="" povećanje="" sadržaja="" p,="" ali="" povećavaju="" sadržaj="" ca="" u="" krvnom="" serumu.="" markeri="" koštane="" apsorpcije,="" rankl="" i="" tracp-5b="" pokazali="" su="" opadajući="" trend="" u="">

grupi bez statističke razlike, dok su oni značajno smanjeni u grupi CDP-H (slika 1I). Nadalje, ispitali smo učinak CDP-a na ekspresiju gena markera osteoklasta u koštanom tkivu pomoću RT-qPCR. Nivoi mRNA NFATc1, Acp5, Mmp9 i CTSK u OVX grupi bili su značajno viši od onih u Sham grupi. CDP-H grupe su pokazale smanjenje nivoa mRNA NFATc1, Acp5 i CTSK za 1.74-, 1.70- i 2.00- puta, u poređenju sa OVX grupom. (Sl. 1J). 3.2. CDP potiskuje osteoklastogenezu izazvanu RANKL in vitro Pratili smo ćelijsku proliferaciju CDP-tretiranih BMM-a koristeći dugotrajni dinamički analizator živih ćelija u realnom vremenu. U poređenju sa kontrolnom grupom, konfluencija ćelija u grupama tretiranim CDP nije se promenila pri dozi<10 µg/ml,="" but="" was="" significantly="" reduced="" at="" the="" 20="" and="" 40="" µg/ml="" dosages="" (fig.="" 2a).="" to="" investigate="" the="" effect="" of="" cdp="" on="" ranklinduced="" osteoclastogenesis,="" bmms="" were="" stimulated="" with="" rankl="" and="" mcsf="" in="" the="" presence="" of="" cdp="" for="" 7="" days.="" tracp,="" a="" characteristic="" enzyme="" of="" osteoclasts,="" is="" considered="" as="" an="" indicator="" of="" osteoclast="" function="" (minkin,="" 1982).="" tracp="" staining="" showed="" that="" the="" osteoclasts="" treated="" with="">1,25 µg/mL CDP je pokazao značajno smanjenu veličinu i broj (sl. 2B i C). Ovi rezultati su pokazali da CDP efikasno inhibira očekivanu osteoklastogenezu izazvanu RANKL bez uticaja na vitalnost ćelija. 3.3. CDP inhibira RANKL-indukovanu aktivnost osteoklastične resorpcije i ekspresiju gena specifičnu za osteoklaste. Dalje smo utvrdili efekte tretmana CDP-om na resorpcionu aktivnost osteoklasta pomoću ploča obloženih hidroksiapatitom. Resorpcija kosti je glavna funkcija i standard za mjerenje aktivnosti i sposobnosti osteoklasta (Novack & Faccio, 2011). Rezultati su pokazali da CDP može značajno smanjiti resorptivno područje kostiju osteoklasta na način ovisan o dozi, što ukazuje da je CDP inhibirao aktivnost resorpcije kosti induciranu RANKL (sl. 3A i B). Konkretno, osteoklastično resorptivno područje kosti se smanjilo na približno 6,3 posto nakon tretmana sa 10 µg/mL CDP. Da bismo bolje shvatili smetnju CDP-a na osteoklastogenezu, izmjerili smo nivoe transkripcije gena povezanih s osteoklastima. Bez tretmana sa CDP-om, indukcija sa RANKL je podstakla ekspresiju gena NFATc1, CTSK, Acp5, Atp6v0d2 i Mmp9. Naprotiv, istovremena primena CDP i RANKL značajno je smanjila regulaciju ovih pet gena (sl. 3C i D).

3.4. CDP inhibira RANKL-indukovanu aktivaciju NFATc1. TRAcP bojenje je otkrilo da tretman CDP-om značajno smanjuje očekivano povećanje broja zrelih osteoklasta nakon RANKL stimulacije tokom 3-7 dana (Slika 4A i B). Nadalje, istražili smo može li liječenje CDP-om djelotvorno narušiti diferencijaciju osteoklasta inhibiranjem ekspresije NFATc1. Rezultati su pokazali da je NFATc1 bio visoko eksprimiran nakon RANKL stimulacije tokom 5 dana, što je značajno inhibirano nakon CDP tretmana (sl. 4C i D). Pored toga, tretman CDP-om potisnuo je nivoe ekspresije CTSK, proteina potrebnog za normalno formiranje i funkciju osteoklasta (Bossard et al., 1996) (Slika 4E i F). Odabrali smo trenutni prikaz RANKL stimulacije tokom 5 dana kako bismo dalje istražili učinak tretmana CDP od 10 µg/mL na translokaciju NFATc1. Kao što se i očekivalo, tretman CDP-om značajno je inhibirao RANKL-indukovanu nuklearnu translokaciju NFATc1 (sl. 4G i H).

Slika 4. CDP potiskuje RANKL-indukovanu aktivaciju NFATc1. (A) BMM su posađene u 6- ploču i stimulirane sa RANKL i M-CSF u prisustvu CDP (0, 5 i 10 µg/mL) za naznačene dane. Reprezentativne slike koje pokazuju TRAcP-pozitivne višenuklearne ćelije. Uvećanje, ×100. Skaliranje {{10}} μm. (B) Kvantifikacija TRAcP-pozitivnih višejezgarnih ćelija (jezgre veće ili jednake 3). (CF) Western blot analiza ekspresije NFATc1 i CTSK proteina, u BMM, stimulisana sa M CSF i RANKL tokom 3-7 dana u prisustvu CDP. (G) BMM su tretirani sa 10 ug/mL CDP i stimulisani M-CSF i RANKL tokom 5 dana, zatim imuno obojeni sa NFATc1 (zeleno) i DAPI (plavo) i posmatrani konfokalnim mikroskopom. Uvećanje, ×200. Skaliranje=20 μm. (H) Intenzitet fluorescencije je analiziran pomoću Image-Pro Plus. Vrijednosti su izražene kao srednje vrijednosti ± SD (n=3). *p < 0,05,="" **p="">< 0,01,="" ***p="">< 0,001="" u="" odnosu="" na="" kontrolnu="" grupu;="" #p="">< 0,05,="" ##p="">< 0,01,="" ###p="">< 0,001="" u="" odnosu="" na="" rankl="" grupu.="" 3.5.="" cdp="" inhibira="" rankl-indukovanu="" aktivaciju="" nf-κb="" i="" mapks="" signalnih="" puteva="" da="" bismo="" razjasnili="" mehanizme="" uključene="" u="" cdp-indukovanu="" inhibiciju="" diferencijacije="" osteoklasta,="" ispitali="" smo="" uticaj="" tretmana="" cdp="" na="" puteve="" nf-κb="" i="" mapks.="" rezultati="" su="" otkrili="" da="" tretman="" cdp-om="" ima="" supresivne="" efekte="" na="" iκb-razgradnju="" i="" fosforilaciju="" p65="" na="" način="" ovisan="" o="" dozi="" (sl.="" 5a="" i="" b).="" povećana="" je="" fosforilacija="" tri="" člana="" porodice="" mapk,="" posebno="" kinaze="" regulisane="" ekstracelularnim="" signalom="" (erk),="" c-jun="" n-terminalne="" kinaze="" (jnk)="" i="">

Diskusija

Osteoporoza je česta i degenerativna bolest kostiju. Trenutno postoji mnogo lijekova za kemijsku sintezu koji se koriste u kliničkom liječenju osteoporoze, kao što su estrogen i bisfosfonat. Međutim, dugotrajna upotreba ovih lijekova postepeno će oslabiti kliničku učinkovitost i čak uzrokovati mnoge ozbiljne nuspojave, uključujući povećan rizik od raka jajnika, dojke i endometrija i osteonekroze vilice (Beral, 2003 Khan et al., 2009., Lacey et al., 2002.). Dok smo u ovoj studiji odabrali CDP, efikasnu komponentu ekstrahovanu iz CD-a, kao terapeutsko sredstvo i pokazali da CDP ima zaštitni efekat protiv gubitka kosti kod OVX miševa i inhibira formiranje i funkciju osteoklasta izazvanog RANKL-om. U međuvremenu, prema teoriji tradicionalne kineske medicine "kost koja upravlja bubrezima", gubitak koštane mase pripisuje se nedostatku bubrega. Kao medicinska hrana koja tonificira bubrege, dokazano je da CD pruža efikasan tretman za osteoporozu (Fan et al., 2019; Jiang, Wang, Li i Zhang, 2016). Stoga je CDP ekstrahovan iz ove prirodne biljke bolja i sigurnija opcija za lijek. Trenutno, OVX model miša je klasičan model postmenopauzalnog gubitka koštane mase kod žena, koji istražuje uzroke gubitka koštane mase i provodi intervenciju (Wehrle et al., 2015.). U skladu s tim, izveli smo bilateralnu ooforektomiju na ženkama miševa C57BL/6J kako bismo konstruirali model osteoporoze. U prethodnim studijama, doze CDP-a davane životinjama bile su 50-200 mg/kg (niska doza) i 1800 mg/kg (visoka doza) (Guo et al., 2016; Zhang et al., 2018). Ovdje je visoka doza CDP-a kod miševa bila 600 mg/kg, što je zasnovano na visokoj kliničkoj dozi od 30 g CD-a u dekociji; stoga je sličan trenutnoj kliničkoj praksi. U ovoj studiji, tretman sa CDP je značajno inhibirao povećanje telesne težine izazvano OVX, što je uobičajena pojava uočena kod OVX miševa (Davis et al., 2019). Koristeći mikro-CT skeniranje i 3D rekonstrukciju, otkrili smo da je OVX doveo do primjetnog smanjenja BMD, BV/TV, BS/TV i Tb.N i povećanja Tb.Sp, dok je CDP tretman poništio sve ove promjene . Konkretno, u poređenju sa pozitivnim lijekom, CDP bi mogao značajno poboljšati BMD OVX miševa, što je važan marker kvaliteta kostiju i koristi se za odraz stepena osteoporoze (Fuggle et al., 2019), što ukazuje da CDP ima prednost nad pozitivnim lijekom u poboljšanju BMD. Nadalje, histološki rezultati su pokazali da liječenje CDP-om može smanjiti povećanu količinu TRAcP-pozitivnih osteoklasta izazvanih OVX-om. Ovi rezultati sugeriraju da je primjena CDP-a efikasno ublažila gubitak koštane mase kod osteoporoze izazvane OVX, vjerovatno inhibicijom formiranja osteoklasta. U skladu s gore navedenim rezultatima, otkrili smo da je CDP ovisno o dozi inhibirao formiranje i funkciju osteoklasta izazvanog RANKL-om, dok je CDP imao mali utjecaj na proliferaciju stanica prekursora osteoklasta inducirane M-CSF u našim in vitro eksperimentima. Vezivanje RANKL i RANK može dovesti do regrutacije TRAF6 i naknadne aktivacije nekoliko nizvodnih signalnih puteva, kao što su NF-κB i MAPK (Boyle et al., 2003; Huang et al., 2006). NF-κB signalni put igra važnu ulogu u regulaciji diferencijacije osteoklasta, a utišavanje gena koji kodiraju ključne proteine ​​na ovom putu može dovesti do abnormalnog razvoja kostiju (Leibbrandt & Penninger, 2008). Dobro je utvrđeno da je NF-κB prisutan u citoplazmi nestimulisanih ćelija u kompleksu sa IκB, ali brzo ulazi u jezgro nakon RANKL stimulacije (Boyle et al., 2003). Oslobođeni IκB se zatim brzo razgrađuje, dok NF-κB aktivira specifičnu transkripciju gena, posljedično promovirajući diferencijaciju osteoklasta, sazrijevanje i apoptozu (Abdelmagid et al., 2015). U ovoj studiji, rezultati su pokazali da tretman CDP-om potiskuje RANKL induciranu aktivaciju NF-κB signalnog puta, što je pokazano inhibicijom degradacije IκB i fosforilacije p65 na način ovisan o dozi, što može uključivati ​​njegov anti-osteoklastogeni učinak. . Osim toga, signalni put MAPK, uključujući ERK, JNK i p38, usko je uključen u osteoklastogenezu izazvanu RANKL (Li et al., 2002). Nadalje, dominantni inhibitori p38 i JNK mogu spriječiti osteoklastogenezu izazvanu RANKL (Chang et al., 2008; Kim et al., 2019), dok ERK igra značajnu ulogu u preživljavanju osteoklasta (Miyazaki et al., 2000). Dobro je utvrđeno da RANKL aktivira signalni put MAPKs povećanjem fosforilacije ERK, JNK i p38 (Mizukami et al., 2002). U našoj studiji, pokazali smo da CDP potiskuje RANKL-indukovanu fosforilaciju ključnih proteina u MAPKs signalnom putu. Uzeti zajedno, ovi rezultati pokazuju da inhibicija aktivacije NF-κB i MAPKs signalnih puteva doprinosi inhibitornom efektu CDP-a na osteoklastogenezu. Aktivacija NF-κB i MAPKs signalnih puteva promovira ekspresiju nekoliko ključnih faktora transkripcije, kao što su ćelijski onkogen fos, aktivator protein 1 i NFATc1 (Huang et al., 2006; Wagner & Matsuo, 2003). NFATc1, važan član porodice NFAT, uključen je u terminalnu diferencijaciju osteoklasta kao glavni regulator transkripcije (Asagiri et al., 2005). Prijavljeno je da embrionalne matične ćelije s nedostatkom NFATc1- ne mogu da se diferenciraju u osteoklaste pod stimulacijom RANKL-a, a ektopična ekspresija NFATc1 uzrokuje da se prekursorske stanice podvrgnu diferencijaciji zaobilazeći RANKL signalizaciju, što sugerira da NFATc1 ima ključnu ulogu u diferencijacija osteoklasta (Takayanagi et al., 2002). Rezultati našeg istraživanja pokazali su supresivni efekat CDP-a na ekspresiju NFATc1 i njegovog pratećeg proteina CTSK. Zanimljivo je da smo primijetili da se nivo ekspresije proteina NFATc1 prvo povećava, a zatim smanjuje, dostižući najviši nivo 5. dana nakon RANKL stimulacije. Ovo je bilo u skladu sa rezultatima Baek et al. (2014), koji su uočili da M-CSF inducira degradaciju NFATc1 tokom kasne faze osteoklastogeneze kroz Cbl-indukovanu ubikvitinaciju NFATc1 na način ovisan o Src kinazi. Rezultati imunofluorescentnog testa su dosledno podržavali inhibitorni efekat CDP na aktivaciju transkripcije NFATc1. Nadalje, geni specifični za osteoklaste, uključujući CTSK, Acp5, Mmp9 i Atp6v0d2, su svi direktno regulirani NFATc1 (Y. Kim et al., 2005.), bili su potisnuti CDP-om. Ovi nalazi ilustruju da je NFATc1 meta inhibitornog efekta CDP na signalne puteve NF-κB i MAPKs.

Zaključak

Ukratko, ekstrahirali smo i pročistili aktivni polisaharid iz CD-a i pokazali da je CDP pokazao zaštitni učinak na osteoporozu izazvanu OVX i poboljšao gubitak kostiju potiskivanjem aktivnosti i funkcije osteoklasta. Nadalje, CDP može inhibirati diferencijaciju i funkciju osteoklasta induciranu RANKL ometajući signalne puteve NF-κB i MAPKs i posljedično utječući na nizvodnu aktivaciju NFATc1. Zaključno, naša otkrića pružaju osnovu za širenje i primjenu CDP-a u liječenju osteoporoze.

Ovaj članak dolazi s popisa sadržaja dostupnih na početnoj stranici časopisa ScienceDirect Journal of Functional Foods: www.elsevier.com/locate/jff