Efekti Cistanchea na apoptozu dopaminergičkih neurona izazvanih neurotoksinom 1-metil-4 -fenilpiridinijumom (MPP)

Kontakt: Audrey Hu Whatsapp/hp: 0086 13880143964 Email:audrey.hu@wecistanche.com

Tian Jiyu, Chen Jianzong

(Centar za istraživanje tradicionalne kineske medicine i kineske Materia Medica bolnice Xijing, FMMU, Xi'an 710032)

Abstract

Cilj: Istražiti efekteCistanche na primarnoj kulturi dopaminergičkih neurona ćelije apoptoze izazvane 1-metil-4-fenilpiridinijumom (MPP plus). Metoda: Za pripremu zečjeg seruma koji se sastoji odCistanchekoristi metodu serumske farmakologije. Zatim ispitajte efekte Cistanchea na ćeliju apoptoze DA neurona izMPP plusinducirani modeli korištenjem morfološke, protočne citometrije, TUNEL bojenja.Rezultat: Tretman od 200 μmol/LMPP plusza 24 sata ili duže izazvanu apoptozu u DA neuronima. PoslijeMPP plustretirani, odnos apoptoze grupe koja sadrži ekvivalentnu dozu seruma Cistanche je 6,3 posto, grupaMPP plussamo tretiranih je 30,2 posto. Broj ćelija apoptoze B i C grupe je značajno manji od E grupe (P<0.05).>Zaključak: Sadrži serumCistanchezaštićena apoptoza DA neurona izazvanaMPP plus.

Ključne riječi: Cistanche;1-metil-4-fenilpiridinijum (MPP plus); dopaminergički neuroni; apoptoza

Trenutno je glavna terapija zaParkinsonova bolestje nadomjesna terapija pripravcima spoja levodope (L-dopa) koji ne mogu kontrolirati razvoj bolesti. Kako bolest napreduje, doza se povećava, a općenito se u roku od 3 do 5 godina smanjuje kurativni učinak, fluktuiraju motorički simptomi i pojavljuju se diskinezije uzrokovane lijekovima. Nedavne studije su otkrile da L-dopa ima efekat induciranja apoptoze na neuronima kultivisane in vitro [1, 2], a zatim je predloženo da neurotoksični efekat endogenog dopamina dovodi do gubitka dopaminergičkih neurona uParkinsonova bolest. Jedan od razloga [3]. U dugogodišnjoj kliničkoj praksi koristili smo kinesku medicinu zaishrana jetre i bubregau kombinaciji sa preparatima levodope za liječenje PD i postigao dobre rezultate [4-6]. Ovaj eksperiment istraživao je zaštitni učinak tradicionalne kineske medicine na apoptozu dopaminergičkih neurona i njen mehanizam na molekularnom i ćelijskom nivou.

1. Materijali i metode

1.1 Materijali

DMEM medij,1-metil-4-fenilpiridini um, MPP plus, fetalni goveđi serum kupljen od kompanije Gibco.Citarabin, poli-l-lizin, PLLkupljeni su od kompanije Sigma. 24-ploča za kulturu bunara, 25cm2

Plastične tikvice za kulturukupljeni su od kompanije NUNC.Kineska medicinakoristili smo je kupljen od Xi'an Decoction Piece Factory. Životinje koje smo koristili obezbjeđuje školski centar za životinje.https://www.xjcistanche.com/products

1.2 Priprema i eksperimentalno grupisanje medicinskog seruma

Cistanche se priprema kao liofilizirani prah za konzerviranje i razrijeđen s destilovanom vodom kada se koristi. Životinjski serum pripremljen je od novozelandskog bijelog zeca s velikim ušimaserum, svi su bili zdravi mužjaci, težine 2.5-3.0 kg. Ekvivalentna doza životinja konvertuje se prema površini tijela i nasumično se dijeli na slijepi serum kontrolne grupe; 1/2 ekvivalentne doze grupnog seruma (doza gavažne doze Cistanche sirovog medicinskog materijala 0.8g/kg); grupa ekvivalentne dozeserum(Doza sonde je originalni medicinski materijal Cistanche cistanche 1,6g/kg); 2 puta veću od ekvivalentne dozeserum(doza gavaža je originalni medicinski materijal Cistanche 3,2g/kg). Gavaža dva puta dnevno ukupno 3 dana, 1 sat nakon zadnjeg uzimanja, karotidno puštanje krvi, preko noći na 4 stepena, centrifugiranje na 2500 o/min 25 minuta, pažljivo odvajanje seruma, inaktivacija na 56 stepena 30 minuta i usisavanje kroz membranu filtera od 0,22 μm. Filtrirajte bakterije i čuvajte na -20 stepenu. Pod istim uslovima, slepi kontrolni serum kunića pripremljen je gavažom sa jednakom zapreminom normalnog fiziološkog rastvora. Eksperiment je podijeljen u 5 grupa. Grupa A je bio prazan zecserumkontrolna grupa kulture; Grupa B je bila aserumska kultura plus MPPterapijska grupa koja sadrži 2 puta veću ekvivalentnu dozu; Grupa C je bila aserumska kultura plus MPPgrupa tretmana koja sadrži ekvivalentnu dozu; Grupa D je bila kontrolna grupa serumske kulture koja je sadržavala 1/2 ekvivalentne doze serumske kulture plus grupa tretirana MPP; E grupa je prazna serumska kultura kunića plus grupa tretmana MPP.

Cistanche benefit

1.3 Kultivacija dopaminergičkih neurona srednjeg mozga

Tri SD štakora od 14 dana trudnoće su odabrana i ubijena direktnim ubrizgavanjem zračne embolije u srce; embrionalni pacovi su izvađeni u aseptičnim uslovima i stavljeni u petrijevu posudu napunjenu ledenim D-Hanks rastvorom. Moždano tkivo fetusa štakora je secirano i odvojeno pod stereomikroskopom. Referentna metoda [7] je neznatno poboljšana. Meninge i vaskularno tkivo su oljušteni, a tkiva u A8, A9 i A1{7}} područjima ventralnog srednjeg mozga su odvojena. Dodajte 1 mL 0,125 posto pankreatina i stavite ga u inkubator na 37 stepeni oko 20 minuta, dodajte odgovarajuću količinu podloge za kulturu koja sadrži 10 posto fetalnog goveđeg seruma kako biste prekinuli probavu i upotrijebite aspiraciju

Odpipetirajte epruvetu u uniformnu suspenziju ćelija, centrifugirajte na 1500r/min 5 minuta na sobnoj temperaturi, pažljivo uklonite supernatant, pipetirajte 15 puta pipetom s tankim vratom i ostavite da odstoji 5 minuta. U 24-pločicu za kulturu sa lizinom, dodajte medijum za kulturu u svaku jažicu da podesite gustinu ćelija na 2×105 ćelija/mL, dodajte medijum za kulturu na 0,5 mL po jažici i dodajte citarabin nakon 3 dana kulture ( konačna koncentracija je 10 μmol/L), inhibiraju rast ne-neurona.

1.4 Imunocitokemijsko bojenje tirozin hidroksilazom (TH).

Koristeći SABC metodu, razrjeđivač antitijela sadrži goveđi serumski albumin 1g/100mL (Boster Company, Wuhan), 0,3 posto Triton-100 (Sigma, SAD), NaN3 80mg/ 100 mL, razblaženo sa PBS do 100 mL, podesite pH na 7,6. Kultura je prekinuta 7. dana, isprana sa D-PBS 5 min 3 puta, svježe pripremljeni 4 posto paraformaldehida je fiksiran na sobnoj temperaturi 30 min i ispran sa D-PBS 5 min 3 puta; sa 1:1:8 hidrogen peroksidom, metanolom i rastvorom PBS Inkubirajte 30 minuta na sobnoj temperaturi, isperite D-PBS 5 minuta, dodajte 5% blokirajući kozji serum 30 minuta na sobnoj temperaturi, isperite D-PBS 5 minuta minuta, i dodati kozje antimišje TH antitelo razblaženo razblaživačem antitela (1:1000 razblaživanje, Calbiochem)), preko noći na 4 stepena, isprati D-PBS 3 min 3 puta, dodati biotinilovani mišji anti-pacov IgG razblažen antitelom razblaživač (razrijeđen 1:200, Sigma USA), djelovati na sobnoj temperaturi 4 sata, ispirati sa D-PBS 3 min 3 puta, dodati HRP kompleks razrijeđen razblaživačem antitijela 2 sata na sobnoj temperaturi i isprati D-PBS po 3min 3 puta. Isperite DAB diluent 3 minute, dodajte DAB kromogeni reagens spreman za upotrebu (Wuhan Boster Company) u ćelije i promatrajte boju pod invertnim mikroskopom.https://www.xjcistanche.com/

1.5 Rukovanje drogom

Morfološka promatranja kultiviranih neurona svakodnevno su vršena pod fazno-kontrastnim mikroskopom, a promjene su zabilježene fotografijama. Nakon 12 sati uzgoja, ćelije su promatrane pod invertnim mikroskopom i lijekovi su dodani neposredno prije spajanja. Sadržaj seruma u svakoj grupi bio je 10 posto. Nakon kultivacije u trajanju od 3 dana, MPP plus je dodan do konačne koncentracije od 200 μmol/L. Nakon inkubacije u inkubatoru od 37 stepeni, 5 posto CO2 tokom 24 sata, izvršite razne inspekcije.

Cistanche

1.6 Detekcija protočnom citometrijom

Liječenje lijekovima bilo je isto kao i prije. Nakon što je svaka grupa tretirana, adherentne PC12 ćelije su digestirane sa 0.125 posto tripsina, a ćelije su uzete oko 1×106 PBS. Ćelije su dva puta isprane i dodano je 490 μL pufera za vezivanje, a ćelije su dobro promešane i dodano je 5 μL aneksina V. FITC i 10 μL rastvorenog PI u ćelijskoj suspenziji, lagano promešati, staviti epruvetu na 4 stepena, inkubirati 10 min u mraku i testirati na COULTER EPICS protočnom citometru (Beckman Coulter, SAD).

1.7 In situ end labeling (TUNEL) za otkrivanje apoptoze ćelije

DNK in situ end obilježavanje kultiviranih neurona koristi Bosterov komplet za detekciju apoptoze (MK1022), a koraci su sljedeći: Uzmite ćelije dopaminergičkih neurona svake grupe nakon MPP plus tretmana (slajd prije primarne kulture prethodno kultivisan tretmanom polimerom lizinom), fiksiran sa 4{{30}}g/L paraformaldehida 1 h, svježom 3 posto octene kiseline (pH2,5) na sobnoj temperaturi 10 minuta, neutralizirati alkalnu fosfatazu, dodati 0,1mol/L TBS (pH7,5) 1:200 svježe razblaženu digestiju proteinaze K na 37 stepeni tokom 20 sekundi, dodati 1 μL TdT i DIG-d-UTP svakom stakalcu i 18 μL puferskog rastvora tokom 2 sata na 37 stepeni; dodati 50 μL rastvora za blokiranje svakom stakalcu, na sobnoj temperaturi 30 min ; Dodati 50 μL biotinilovanog anti-digoksigenin antitela razblaženog rastvorom za blokiranje; reagovati 30 min u mokroj kutiji na 37 stepeni; dodajte 50 μL SABC-AP razblaženog sa 0,1 mol/L TBS na svako staklo; BCIP/NBT (0,1 mol pH9,5/L TBS razblaženog 1:20) je dodat uzorku da razvije boju tokom 30 minuta; u isto vrijeme, alternativna kontrola (TdT pufer je korišten umjesto mješavine TdT/biotin-dUTP) za fotomikrografiju i mikroskop s invertiranom fazom (200×) Posmatrajte apoptotičke ćelije. Izbrojite pozitivne ćelije pod fazno-kontrastnim mikroskopom, izbrojite 5 polja po jažici u svakoj grupi, za ukupno 6 jažica.

2. Eksperimentalni rezultati

2.1 Morfološko promatranje kultiviranih neurona

Posmatrano OlympusIX70 fazno-kontrastnim mikroskopom: 5 h nakon inokulacije, većina ćelija prianja za zid, ćelije su raštrkane, telo ćelije je okruglo, jezgro je nevidljivo, a indeks prelamanja je jak. Nakon kultivacije u trajanju od 24 sata, ćelijske izbočine su rasle i postepeno se izdužile. U 48h, većina ćelija je protrudila sa razgranatim filamentoznim izbočinama. Morfologija ćelija bila je raznolika, koja je bila bipolarna, tripolarna i multipolarna, i postepeno je formirala rijetku mrežu. Tijelo ćelije je bilo uvećano, okruglo i eliptično. Nakon povrede MPP plus, ćelije su prvo nabubrile, indeks loma se povećao, ćelije su bile u degenerativnom stanju, a ćelije su se konačno smanjile i otpale. Različite doze seruma koji sadrži kinesku medicinu imaju zaštitne efekte na MPP plus ozljede. Nakon što je kultura obojena TH imunim ćelijama, vidjelo se da su TH-pozitivne ćelije smeđe boje sa izrastanjem neurita. Nakon dodavanja ekvivalentne doze seruma tradicionalne kineske medicine, udio TH-pozitivnihneuronamože doseći 55 posto -60 posto .

2.2 Analiza rezultata testa protočne citometrije (vidi sliku 1)

Fosfatidilserin (PS) koji se nalazi unutar ćelijske membrane u ranoj fazi apoptoze migrira na vanjsku stranu ćelijske membrane. Fosfatidil vezujući protein V (aneksin V) je protein koji vezuje fosfolipide zavisan od kalcijuma, koji ima visok afinitet za PS. Stoga se Aneksin V može koristiti kao sonda za otkrivanje PS izloženog na površini ćelijske membrane. Istovremeno, u kombinaciji sa metodom isključenja PI za duplobojenjeapoptotičkih ćelija, apoptotičke ćelije se mogu otkriti protočnom citometrijom. U donjem desnom kvadrantu slike 1 (FITC plus /PI-), prikazani su detalji apoptoze svake grupe. Udio ćelija, stopa apoptoze svake grupe iznosila je 4,1 posto, 5,8 posto, 6,3 posto, 28,6 posto, 30,2 posto.

2.3 Analiza rezultata bojenja TUNEL-om

One sa plavo-ljubičastim česticama u jezgru su pozitivne ćelije, odnosno apoptotičke ćelije. Udio apoptotičkih ćelija u svakoj grupi je izbrojan pod svjetlosnim mikroskopom. Broj apoptotičkih ćelija po vidnom polju u svakoj grupi bio je: Grupa A 2.13±0.34; Grupa B 4.92±{7}}.67; Grupa C 6,20±1,47; Grupa D 10,33±1,51; Grupa E 12,74±2,51. Poslijet-test analiza,B i C grupe su upoređene sa E grupom (P<0.05). the="">rezultatesu u osnovi u skladu sarezultati protočne citometrije.

3. Diskusija

Parkinsonova bolestpripada kategoriji "sindroma tremora" u kineskoj medicini. Tradicionalna kineska medicina smatra da je početak PD-a uglavnom niz manifestacija postepenog iscrpljivanja jetre i bubrega kod starijih osoba i gubitka ishrane meridijana moždane srži. Glavni tretman je danjeguju jetru i bubrege, smiruju jetru i eliminišu vjetar. Tradicionalna kineska medicina može imati svrhu "smanjenje toksičnosti i povećanje efikasnosti"u liječenjuParkinsonova, ali mehanizam njegovog djelovanja trenutno nije jasan. Veliki broj eksperimentalnih dokaza u savremenoj medicini ukazuje da je oksidativni stres jedan od faktora koji uzrokuju smrt nervnih ćelija PD [3]. Studije su otkrile da ukupni glikozidi cistanchea mogu efikasno ukloniti različite reaktivne slobodne radikale kisika i zaštititi DNK od oksidacije uzrokovane OH[8]. Cistanche ekstrakt tubulozida B može ublažiti citotoksičnost izazvanuMPP plus,oslabe nakupljanje reaktivnih vrsta kiseonika u ćeliji i imaju antagonistički efekat na apoptozu i oksidativni stres izazvanMPP plus[9]. Tradicionalna kineska medicina može aktivirati i ojačati vlastiti zaštitni signalni put, oduprijeti se vanjskim oštećenjima i vratiti ravnotežu. To je jedan od ciljeva modernizacije tradicionalne kineske medicine. Nakon terapije zamjene dopamina, ljudi danas općenito cijene neuroprotektivnu terapiju, koja se naziva drugom revolucijom u liječenjuParkinsonova bolest. U ovom eksperimentu, izolovane dopaminergičke nervne ćelije srednjeg mozga uzgajane su kineskom medicinom koja sadrži serum i ustanovljeno je da Cistanche ima određeni neuroprotektivni efekat. U ovom eksperimentu korištene su dvije metode detekcije protočne citometrije i TUNEL bojenja kako bi se istovremeno utvrdilo da ekvivalentna doza grupnog seruma i 2 puta ekvivalentna doza grupnog seruma kulture seruma s lijekom Cistanche mogu smanjiti primarno kultivirani dopaminski živac srednjeg mozga uzrokovanMPP plusBroj apoptotičkih ćelija ima određeni zaštitni efekat na apoptotičke ćelije. Tradicionalna kineska medicina može zaštititi dopaminergičke neurone od oštećenja u ranoj fazi, što je važnija mjera od drugih terapija. U tom smislu, holistički tretman kineske medicine je lijek za osnovni uzrok i može se smatrati jednim od neuroprotektivnih tretmana koje ljudi danas cijene.

Reference

1. Ziv I, Zilkha-Falb R, Offen D, et al. Levodopa inducira apoptozu u kultivisanim neuronskim ćelijama - mogući akcelerator nigrostriatalne degeneracije kod Parkinsonove bolesti? Mov Disord, 1997, 12(1):17

2. Jenner PG, Brin MF. Neurotoksičnost levodope: eksperimentalne studije u odnosu na kliničku relevantnost. Neurology,1998,50(6 Suppl 6): S39

3. Maruyama W, Naoi M. Ćelijska smrt u Parkinsonovoj bolesti. J Neurol, 2002, 249 (Suppl 2): ​​II6

4. Chen Jianzong, Jiang Wen, Shi Jian, et al. Klinička opservacija o liječenju Parkinsonove bolesti s funkcijom jetre i bubrega: izvještaj o 60 slučajeva. Časopis Chengdu univerziteta tradicionalne kineske medicine, 1999, 22(3): 14

5. Chen Jianzong, Chen Xiaoli, Li Junchang, itd. Klinička opservacija na 40 slučajeva Parkinsonove bolesti liječenih metodom ishrane jetre i bubrega. Istraživanja u kineskoj medicini, 1998, 14(3): 10

6. Chen Jianzong, Jiang Wen, Wu Baron, et al. Pingchan br. 1 oralna tečnost u liječenju 40 slučajeva Parkinsonove bolesti. Journal of Anhui College of Traditional Chinese Medicine, 1999, 18(2): 9

7. Shimoda K, Sauve Y, Marini A, et al. Visok procenat prinosa ćelija pozitivnih na tirozin hidroksilazu iz kulture mezencefalnih ćelija štakora E14. Brain Res, 1992, 586 (2):319

8. Wang Xiaowen, Jiang Xiaoyan, Wu Liya Yiming, et al. In vitro uklanjanje slobodnih radikala i zaštitni efekti na oštećenje DNK izazvano OH izazvanim ukupnim glikozidima cistanhe. Chinese Pharmaceutical Journal, 2001, 36(1): 29

9. Sheng G, Pu X, Lei L, et al. Tubulozid B iz Cistanche salsa Spašava PC12 neuronske ćelije od 1-Metil-4-fenilpiridinijum-indukovane apoptoze i oksidacije.Stress.Planta Med,2002,68(11):966