Pristupačnost hromatina i ekspresija mikroRNA u nefronskim progenitornim ćelijama tokom razvoja bubrega

Za više informacija:ali.ma@wecistanche.com

Andrew Clugston^1,2,3, Andrew Bodnar^2,3, Débora Malta Cerqueira^2,3, Yu Leng Phua^2,5,6,Alyssa Lawler^8,9,10, Kristy Boggs⁷, Andreas Pfenning^8,10,Jacqueline Ho^2,3*i Dennis Kostka^1,4*

¹Odsjek za razvojnu biologiju, Medicinski fakultet Univerziteta u Pittsburghu, Pittsburgh, PA, SAD²Rangos Research Center, UPMC Children's Hospital of Pittsburgh, Pittsburgh, PA, SAD³Odsjek za pedijatriju, Odsjek za nefrologiju, Medicinski fakultet Univerziteta u Pitsburgu, PA, SAD⁴Odsjek za računarsku i sistemsku biologiju i Pittsburgh Centar za evolucijsku biologiju i medicinu, Medicinski fakultet Univerziteta u Pittsburghu, Pittsburgh, PA, SAD⁵Odjel za genetičku i genomsku medicinu, Odsjek za pedijatriju, UPMC Children's Hospital of Pittsburgh, Pittsburgh, PA, SAD⁶Odjel za patologiju, Laboratorija za kliničku biohemijsku genetiku, UPMC Children's Hospital of Pittsburgh, Pittsburgh, PA, SAD⁷Odsjek za pedijatriju, Odsjek za gastroenterologiju, hepatologiju i ishranu, Medicinski fakultet Univerziteta u Pittsburghu, Pittsburgh, PA, SAD.⁸računarska biologija,⁹biološke nauke i¹⁰Neuroscience Institute, Carnegie Mellon University, Pittsburgh, PA, SAD

Abstract

Nefroni sisara potječu iz populacije odnefronske progenitorne ćelije, a promjene u transkriptomima ovih stanica doprinose prestanku nefrogeneze, važne determinante broja nefrona. Da bismo okarakterizirali ekspresiju mikroRNA (miRNA) i identificirali navodne cis-regulatorne regije, sakupili smo ćelije progenitor nefrona od mišabubrezina embrionalni dan 14,5 i postnatalni dan nulti i ispitana ekspresija male RNK i hromatin koji je dostupan transpozazi. Otkrili smo ekspresiju 1.104 miRNA (114 sa promenama ekspresije) i 46.374 hromatinu pristupačnih regiona (2.103 sa promenama nedostupnim). U cijelom genomu, naši podaci ističu procese kao što su ćelijska diferencijacija, migracija stanica, interakcije ekstracelularnog matriksa i razvojni signalni putevi. Nadalje, oni identificiraju nove kandidate za cis-regulatorne elemente za Eya1 i Pax8, oba gena s ulogom u diferencijaciji nefronskih progenitornih stanica. Konačno, povezujemo miRNA koje mijenjaju ekspresiju, uključujući let-7-5p, miR-125b-5p, miR-181a-2-3p i miR{{ 20}}p, sa kandidatima cis-regulatornim elementima i ciljnim genima. Ove analize ističu nove pretpostavljene cis-regulatorne lokuse za miRNA u progenitorima nefrona.

Uvod

Funkcionalna jedinicabubregje nefron, koji služi za filtriranje otpada i održavanje normalne homeostaze vode, kiselinske baze i elektrolita u tijelu. Broj nefrona uvelike varira kod ljudi (obično između dvije stotine hiljada i više od milion nefrona (Hughson et al., 2003)) i utvrđen je prije rođenja kod ljudi (otprilike postnatalni dan 2-3 kod miševa (Hartman et al. ., 2007; Hinchliffe et al., 1991)). Nefroni se ne mogu regenerirati nakon rođenja, a smanjena obdarenost nefrona je povezana s povećanim rizikom od kronične bolesti bubrega i hipertenzije (Bertram et al., 2011). Broj nefrona je, pak, velikim dijelom određen populacijom ćelija tzvnefronske progenitorne ćelije(Cebrian et al., 2014b). U kasnijim fazamabubregrazvoja, progenitori nefrona povećavaju svoju sklonost diferencijaciji, što postupno iscrpljuje njihovu populaciju i označava konačan prestanak nefrogeneze (Hartman et al., 2007; Rumballe et al., 2011; Volovelsky et al., 2018). Razumijevanje mehanizama koji regulišu prestanak nefrogeneze ima značajne implikacije za određivanje obdarenosti nefrona i rizika od naknadne bolesti bubrega.

Tokombubregrazvoj, samoobnavljajući Cited1 plus /Six2 plus progenitori nefrona su inducirani da postanu prvobitni Cited1-/Six2 plus progenitori, a zatim se diferenciraju u Wnt4-ekspresirajuće bubrežne vezikule kao odgovor na Wnt9b/ -catenin (McMahon et al., 2016; Rumballe et al., 2011). Intrinzične promjene transkripcije u ranim i kasnim progenitorima nefrona uključuju gene i puteve koji utiču na starenje matičnih ćelija, posebno mTor i njegov represor hamartin (S. Chen et al., 2015; Volovelsky et al., 2018). Zaista se smatra da hamartin desenzibilizira progenitore nefrona na signale za samoobnavljanje i na taj način doprinosi prestanku nefrogeneze (S. Chen et al., 2015). U skladu s idejom da rani progenitori nefrona imaju veću tendenciju samoobnavljanja je zapažanje da je dostupnost hromatina obogaćena za mjesta vezivanja transkripcionih faktora ćelija core nefrona progenitor, uključujući Six2 i Wt1 u poređenju sa kasnim prethodnicima nefrona (Hilliard et al. , 2019.). Pokazalo se da ovi faktori transkripcije vezuju pojačivačke sekvence smještene u "regulatornim vrućim tačkama" u genomu (O'Brien et al., 2018). Do indukcije progenitora nefrona dolazi zbog porasta nivoa -katenina, što rezultira aktivacijom kompleksa Lef1/Tcf7 na genima spremnim za aktivaciju programa nefrogeneze (Park et al., 2012.), a predloženo je da se kompleksira s Tcf7l1 i Tcf7l2 uspostaviti i održavati regulatorne kromatinske petlje koje olakšavaju aktivaciju gena (Guo et al., 2021).

Kliknite zaCistanche tubulosa prah za liječenje bolesti bubrega

Nedavne studije su uključile mikroRNA (miRNA) u regulaciju prestanka nefrogeneze. miRNA su kratke, nekodirajuće RNA molekule koje ciljaju transkripte RNK glasnika (mRNA) za smanjenu translaciju ili pojačanu degradaciju preko RNA-induciranog kompleksa za utišavanje (RISC) (Bartel, 2009.). Protein Lin28b je poznati represor let-7familije miRNA (Heo et al., 2008). Ekspresija Lin28b se smanjuje u progenitorima nefrona kako nefrogeneza napreduje, a to se poklapa sa povećanjem ekspresije let-7 porodice miRNA (Yermalovich et al., 2019). Nadalje, uslovna indukcija ekspresije Lin28b u Wt1-lozi rezultira represijom let-7 miRNA, što je dovoljno da produži nefrogenezu (Yermalovich et al., 2019). Nije poznato da li druge miRNA reguliraju vrijeme nefrogeneze. Osim toga, dok su identificirani pojačivači koji reguliraju dugu nekodirajuću RNK ekspresiju tokom nefrogeneze (Nishikawa et al., 2019), nije se pokazalo da nijedan reguliše ekspresiju miRNA u progenitorima nefrona.

U ovoj studiji, nastojali smo da istovremeno identifikujemo novu miRNA koja doprinosi prestanku nefrogeneze, zajedno sa potencijalnim cis-regulatornim karakteristikama. Stoga, da bismo promatrali promjene u ekspresiji miRNA i dostupnosti hromatina između embrionalnog dana 14.5 (E14.5) i postnatalnog dana nultog (P0), proizveli smo podudarne mRNA-seq i ATAC-seq skupove podataka iz primarnih i nepasiranihnefronske progenitorne ćelijeu ova dva vremena. Identificirali smo 114 miRNA koje su različito eksprimirane unefronske progenitorne ćelijeizmeđu ovih dvovremenih tačaka, kao i 2.103 regije promjenjive dostupnosti hromatina koje nazivamo različito dostupnim regijama (DAR). Analize obogaćivanja predviđenih genskih ciljeva značajno promjenjive miRNA, kao i među genomskim lokacijama DAR-ova, impliciraju puteve koji utječu na diferencijaciju epitelnih stanica, migraciju stanica, interakcije ekstracelularnog matriksa i ključne razvojne signalne puteve kao što su Wnt, Notch i TGF-signalizacija . Uočavamo značajne promjene u dostupnosti hromatina i predstavljamo višestruke dokaze koji impliciraju dva genomska regiona kao navodne pojačivače gena Eya1 i Pax8 u ćelijama progenitorima nefrona. Konačno, identifikovali smo dosljednu dostupnost kromatina i promjene ekspresije miRNA za 33 para miRNA i DAR-ova, uključujući let-7-5p, miR-125b-5p, miR-181a{ {11}}p, i miR-9-3p, i predstavljaju pretpostavljene ciljne gene eksprimirane u progenitorima nefrona za različito eksprimirane miRNA.

Rezultati

Izolacija populacija progenitorskih ćelija nefrona iz E14.5 i P0bubrezi

Progenitorne ćelije nefronaizolovani su pozitivnom selekcijom za Itg 8 na E14.5 ili na P0, a svaki uzorak je podijeljen da se izvrši mRNA-sek, ATAC-sek i kontrola kvaliteta (Dopunska slika 1 AB). Kvantitativni PCR (qRT-PCR) potvrdio je da su geni markeri nefrona progenitor Six2 i Cited1 (Huang et al., 2016) visoko eksprimirani u izolovanim uzorcima progenitora nefrona u odnosu na cijelibubreg, više nego markeri za druge tipove ćelija (uključujući ureterični pupoljak (Cebrian et al., 2{{10}}14a), endotelne ćelije (Pecan) (Kobayashi et al., 2008), bubrežna stroma (Pdgfr ) (S. Chen et al., 2015) i bubrežna vezikula (Lhx1) (Brunskill et al., 2014) (Dopunska slika 1 C). S obzirom na spol, leglo korišteno za uzorke E14.5 variralo je od 27% do 50% ženki, a legla za uzorke P0 kretala su se od 31% do 75% ženki.U prosjeku, uzorci E14.5 su bili 38% ženke, a uzorci P0 su bili 49% ženke (Dopunska slika 1 D). -podudarne populacije progenitornih ćelija nefrona omogućile su nam analizudostupnost hromatinai mala ekspresija RNK u istim fazama razvoja u dvostrukim tačkama (E14.5 i P0).

Rani i kasni progenitori nefrona imaju različite transkripcione profile miRNA

Sekvencioniranje male RNK otkrilo je 1,104 poznata miRNA transkripta i identificiralo 114 miRNA koje pokazuju značajnu promjenu u ekspresiji između uzoraka E14.5 i P{{10}} (stopa lažnog otkrića ( FDR)=0.05; Dodatna tabela 1). Polovina različito eksprimiranih miRNA pokazuje povećanu ekspresiju na P0 u poređenju sa E14.5, a analiza glavne komponente ističe veću homogenost u ekspresiji miRNA među uzorcima E14.5 u poređenju sa P0 (Slika 1A). Hijerarhijsko grupisanje otkriva jasno grupisanje miRNA u one sa rastućom i opadajućom ekspresijom između E14.5 i P0, respektivno (Slika 1B). Članovi let-7familije miRNA su među detektovanim najizraženijim miRNA, a primjećujemo da svi članovi porodice sa značajnim promjenama pokazuju povećanu ekspresiju na P0 (podaci nisu prikazani). Ovo je u skladu sa rezultatima koji pokazuju da smanjenje ekspresije Lin28b dovodi do širokog povećanja ekspresije porodice let-7 tokom nefrogeneze (Yermalovich et al., 2019). Ostale miRNA sa značajno većom ekspresijom na P0 uključuju miR-429-3p, člana porodice miR-200 za koje se zna da utiče na diferencijaciju podocita (Z. Li et al., 2016), i oba miR{{30 }}a-5p i miR-125b-5p. Poznato je da posljednja dva od njih potiskuju transkripte Lin28 u različitim ćelijskim okruženjima (Chaudhuri et al., 2012; Potenza et al., 2017). miRNA sa značajno nižom ekspresijom na P0 uključuje miR-126 koji promoviše angiogenezu- (S. Wang et al., 2008) i proliferaciju (Schober et al., 2014).

Alat DIANA miRPath omogućava analizu KEGG puta miRNA na osnovu njihovih genskih ciljeva, kako je predviđeno mikro T-CDS (Vlachos et al., 2015). Otkrili smo da su miRNA sa najvećim promjenama u ekspresiji između E14.5 i P0 (gore ili dolje) one koje regulišu puteve s ključnim ulogama u nefrogenezi (Slika 1C, Dodatna slika 2). Na primjer, Tgf- luče okolne stromalne stanice kako bi promovirale diferencijaciju progenitora nefrona (Rowan et al., 2{{50}}18), i primjećujemo smanjenu ekspresiju među miRNA progenitor nefrona koja cilja na niže efektore "TGF-signalni put" (KEGG put mmu04350, p-vrijednost 1,45e- 6). "MAPK signalni put" (mmu04010) utječe na organizaciju i pripremanje progenitora nefrona za diferencijaciju i reguliše njihovu interakciju sa ekstracelularnim matriksom (ECM) preko Itg 8 (Ihermann-Hella et al., 2018). Primjećujemo značajan broj gore i dolje reguliranih miRNA koje ciljaju različite gene u ovom MAPK signalnom putu (p-vrijednosti od 3,5e- 6 i 3,0e- 4 za gore i dole liste, respektivno) . Konačno, KEGG put "interakcija receptora ekstracelularnog matriksa (ECM)" (mmu04512) je najznačajniji identificiran put, a njegovi sastavni geni su daleko značajnije ciljani miRNA čija se ekspresija povećava tokom vremena (p-vrijednost od 7,4e{ {32}} među rastućom miRNA naspram 1.1e-2 među opadajućim). ECM povezani geni su ciljani nekim od najizraženijih i značajno rastućih miRNA koje otkrivamo, uključujući miR-196a-5p, miR-148a-3p, miR -125a-5p, i neka-7f-5p. Konkretno, miR-196a-5p je najviše eksprimirana miRNA u našim uzorcima i bilježi 8-putostruko povećanje između E14.5 i P0. Transkripti gena koji su bili predviđene mete miRNA (koristeći TargetScan (Agarwal et al., 2015)) sa povećanom ekspresijom na P0 uključuju Bach2, predloženu molekularnu vezu između MAPK/AP1 i Six2/-catenin puteva za samoobnavljanje i diferencijaciju u progenitorima nefrona, respektivno (Hilliard et al., 2019).

Da identifikujemo pretpostavljene mete različito eksprimiranih miRNA u progenitorima nefrona, koristili smo kompjutersku anotaciju miRNA koja se nalazi u miRDB (Y. Chen & Wang, 2020) i eksperimentalne interakcije miRNA-mRNA s anotacijom iz malterne baze (HY Huang et al., 2020.), u kombinaciji s našim prethodno generiranim E14.5 jednoćelijskim nizom podataka sekvenciranja RNK (Bais et al., 2020.). Tako smo napravili listu potencijalnih interakcija miRNA-mRNA na osnovu diferencijalne ekspresije miR između E14.5 i P0 u progenitorima nefrona sa odgovarajućom promjenom u ekspresiji ciljnog gena između samoobnavljajućih i primarnih progenitora nefrona, kao i prvobitnih i diferenciranje progenitora nefrona (slika 2). Naša analiza sugerira da su Meis2 i Hmga2 potencijalne mete let-7 porodice miRNA u progenitorima nefrona (slika 2), sa smanjenom ekspresijom Meis2 i Hmga2 povezanom sa povećanom ekspresijom let-7 članova porodice u diferencijaciji ili starenju nefronskih progenitora. Transkripcijski faktor Meis2 je snažno izražen u progenitorima nefrona i bubrežnoj stromi tokombubregrazvoj (Lam et al., 2014), a povezan je sa regulacijom proliferacije ćelija u drugim kontekstima (Abruzzese et al., 2019). Hmga2 je nehistonski protein koji veže hromatin, izražen je u matičnim ćelijama i povezan je sa raznim mezenhimskim tumorima (Fusco & Fedele, 2007; Lam et al., 2014). Slično, postoji povećana ekspresija Jag1 povezana sa smanjenjem ekspresije miR-34b-5p, miR-983p i miR-200a-3p u razlikovanju ili starenje progenitora nefrona (slika 2). Jag1 je ključni ligand u Notch signalizaciji čija se ekspresija povećava kako se progenitori nefrona diferenciraju (Chung et al., 2016). Sve predviđene ili označene miRNA mete za gene s promjenama u ekspresiji između samoobnavljajućih, pripremljenih i diferencirajućih progenitora nefrona dostupni su u Supplementalu.

Slika 1. Značajne promjene u ekspresiji miRNA između E14.5 i P0 progenitora nefrona.A) Analiza glavne komponente pokazuje da vremenska tačka razvoja glavni doprinosi varijacijama ekspresije miRNA. B) Toplotna karta koja prikazuje relativnu ekspresiju svih značajno promijenjenih miRNA. Kolone koje sadrže uzorke E14.5 na lijevoj strani su označene svijetlozelenom bojom, a kolone s P0 uzorcima na desnoj strani su označene tamnozelenom bojom. C) Obogaćivanje gena iz specifičnih KEGG puteva među predviđenim genskim ciljevima gore i dole regulisane miRNA (crvene i plave trake, respektivno). Minimalna uključena p-vrijednost je 1e-5.

Slika 2. Interakcije miRNA-mRNA sa mogućom ulogom u starenju i diferencijaciji ćelija progenitor nefrona. Prikazane su miRNA (krugovi) i mRNA (kvadrati). miRNA sa povećanom ekspresijom između E14.5 i P0 su prikazane crvenom bojom, a miRNA koje se smanjuju su prikazane plavom bojom. Označeni ciljni geni (iz mirDB i mir TarBase) sa sve većom ekspresijom između samoobnavljajućih, primarnih ili diferencirajućihnefronske progenitorne ćelije(Bais et al., 2020) prikazane su crvenom bojom, mRNA sa opadajućom ekspresijom plavom bojom. Rubovi iz mirDB i mirTarDB koji nisu u skladu s uočenim promjenama izraza su izostavljeni, ali su uključeni u Dodatnu tabelu 2.

Rani i kasni progenitori nefrona imaju različita hromatinska okruženja

ATAC-seq podaci iz E14.5 i P0 nefronskih progenitora omogućili su nam da identifikujemo 46,374 regiona dostupnog hromatina (sa nesmanjivom stopom otkrića (Boleu et al., 2015) pragom od {{ 22}}.1, vidi (Dopunska slika 3 C, Dodatna tabela 3), kombinovana između uzoraka i vremenskih tačaka. Napominjemo da su naši podaci u skladu sa ATAC-seq smjernicama ENCODE projekta (ENCODE, nd) (Dopunska slika 3 A, B) i da uočavamo povećane stope očuvanja među IDR pikovima nego što se vidi u randomiziranim kontrolama (Dopunska slika 3 D). Među IDR-ovima koje izvještavamo, 3.576 sadrži pojačivače dokumentovane u VISTA (Visel et al., 2007.) i/ili FANTOM5 (de Rie et al., 2017.) baze podataka pojačivača, a 13.495 sadrže sekvence DNK sa predviđenim regulatornim ulogama u najmanje jednom mišjem tkivu ili tipu ćelije prema EnhancerAtlas 2.0 (Gao & Qian, 2020).

Analiza glavnih komponenti (prilagođena spolnim razlikama između uzoraka) otkrila je jasno grupisanje uzoraka prema vremenskoj tački razvoja (Slika 3A). Da bismo identificirali genomske lokuse s promjenama u dostupnosti hromatina, uporedili smo ATAC-seq signal između E14.5 i P0 uzoraka. Uočili smo 2,103 DAR-a, kontrolirajući FDR na 10 posto. Od njih 1323 (55 procenata) pokazalo je povećanu dostupnost na P0 u poređenju sa E14.5, a hijerarhijsko grupisanje je otkrilo jasnu razliku između DAR-ova koji se otvaraju i zatvaraju između E14.5 i P0, respektivno (Slika 3B).

Otisci faktora transkripcije su identifikovani pomoću HINT-a i upareni sa proteinima koji se vezuju za DNK koristeći motive iz baze podataka HOCOMOCO 11 (Kulakovskiy et al., 2018). Među 431 testiranim motivom, DAR-ovi koji sadrže otiske nekoliko proteina faktora transkripcije povezanih s nefrogenezom pokazuju povećanje pristupačnosti između E14.5 i P0. Među otiscima koji se nalaze u DAR-ovima koji u prosjeku povećavaju dostupnost, prvih šest pripada otiscima faktora transkripcije koji se podudaraju sa Pax8 ({{10}}.15), Six2 (0.14), Cebpd (0.13), Six4 (0.13), Jun (0.12) i Fos (0.11). Otisci stopala označeni u završnim DAR-ovima uključuju faktore transkripcije E2F2 i E2F4, za koje je poznato da utiču na progresiju ćelijskog ciklusa (Gaudet et al., 2011) i da promovišu proliferaciju ćelija (D. Wang et al., 2000) u drugim ćelijskim kontekstima (dodatna slika 4).

Da bismo procijenili biološki kontekst otvaranja i zatvaranja DAR-ova, koristili smo alat za obogaćivanje anotacija genomskih regija (GREAT) (McLean et al., 2010.) kako bismo istakli skupove gena uz obogaćivanje povezanih promjenjivih hromatinskih regija. Ovim pristupom identifikujemo biološke procese genske ontologije (GO) koji su usko povezani s razvojem progenitora nefrona: posebno, najvažniji proces među početnim DAR-ovima je "regulacija diferencijacije epitelnih ćelija" (GO:0030856, binomna Q-vrijednost {{3 }}.5e-5), a "Pozitivna regulacija diferencijacije epitelnih ćelija" (GO:0030858, binomna Q-vrijednost=5e-3) je među prvih 10 najznačajnije obogaćenih ( Dodatna slika 5). Oba su u skladu s povećanjem sklonosti progenitora nefrona da se podvrgnu prijelazama mezenhima u epitel (MET) dok se razlikuju (S. Chen et al., 2015). Drugi značajno obogaćeni putevi uključuju "pozitivnu regulaciju signalnog puta Notch" (GO:0045747, binomna Q-vrijednost=2e-5), što je u skladu s ulogom koju signalizacija Notch igra u promoviranju diferencijacije nefrona progenitora ( Chung et al., 2016.). Otkrivena 10.083 DAR-a na zatvaranju nisu otkrila značajne GO termine na osnovu GREAT-ovih zadanih kriterijuma za značaj (vidi Dodatnu sliku 5).

Slika 3. Razlike u dostupnosti hromatina karakterišu E14.5 u odnosu na P0nefronske progenitorne ćelije.A) Analiza glavnih komponenti ATAC-seq uzoraka ističe razvojne vremenske tačke kao glavni izvor varijacija. B) Toplotna karta koja pokazuje značajno promjenjive IDR regije u ATAC-seq uzorcima. E14.5 uzorci/kolone su označeni svijetlozelenom bojom, a P0 uzorci/kolone su označeni tamnozelenom bojom. C) GO termini biološkog procesa obogaćeni za genomske regije koje se otvaraju između E14.5 i P0 prema GREAT, rangirane po binomskoj P-vrijednosti, FDR manji od ili jednak 0.001.

Zatim smo istraživalidostupnost hromatinau regionima genoma koji sadrže promotere i pojačivače za gene sa objavljenom ulogom u diferencijaciji nefronskih progenitorskih ćelija. Među njima, faktor transkripcije Six2 je kritičan za održavanje multipotencijenefronske progenitorne ćelije(Self et al., 2006.), au svim uzorcima smo uočili pristupačan kromatin koji okružuje njegov promotor i poznati Six2 pojačivač ~50 kb uzvodno od Six2 transkripcije start site (TSS) (O'Brien et al., 2018.) (Slika 4A, B, plavo osenčena područja). Također primjećujemo regije pristupačnog kromatina na promotoru i objavljeni pojačivač za protein Gdnf (Slika 4D, E), koji luče progenitori nefrona kako bi promovirali grananje pupoljaka uretera (Sanchez et al., 1996; Vega et al., 1996. ). Ovaj pojačivač se nalazi ~113kb uzvodno od promotora gena i poznato je da reaguje na Wnt signalizaciju u kontekstu razvoja progenitora nefrona (Park et al., 2012). Dok se promotor za Gdnf ne mijenja značajno tokom vremena, označeni pojačivač značajno povećava nepristupačnost. Također primjećujemo regije pristupačnog hromatina koje okružuju objavljen pojačivač aktivan u progenitorima nefrona za Eya1 koji se nalazi ~325 kb uzvodno od TSS gena (Park et al., 2012.) (dodatna slika 6). Eya1 je faktor transkripcije koji stupa u interakciju sa Six2 kako bi održao multipotentnost progenitora nefrona (J. Xu et al., 2014).

Uočavamo nekoliko DAR-ova koji se ne preklapaju s poznatim regulatornim karakteristikama, ali obuhvataju regije za koje se predviđa da imaju pojačivače aktivnosti za specifične gene u različitim tipovima mišjih ćelija kao što je navedeno u EnhancerAtlas 2.0 (Gao & Qian, 2020). Pored objavljenog pojačivača Eya1 (Park et al., 2012.) (Dopunska slika 6), završni DAR u jednom od Eya1 introna (Slika 5A-B) obuhvata regiju za koju se predviđa da ima aktivnost pojačivača na genu Eya1 kod miša neuralne progenitorne i granulocitno-monocitne progenitorske ćelije (Gao & Qian, 2020). U skladu sa smanjenjem aktivnosti pojačivača, ranije smo primijetili da je ekspresija Eya1 smanjena u diferencijaciji progenitora nefrona koristeći podatke scRNA-seq E14.5 (Dopunska slika 7) (Bais et al., 2020). Ovo je u skladu s objavljenim ChIP-seq podacima u primarnim E16.5 progenitorima nefrona koji pokazuju nedostatak oznake aktivnog pojačivača, H3K27ac, i nedostatak vezivanja od Ctnnb1, Lef1, Six2 i Tcf7 (Slika 5) (Guo et al. ., 2021.). Ovaj potencijalni pojačivač takođe sadrži otiske transkripcionog faktora za Hoxd10 u svom vrhuncu, faktor transkripcije koji je neophodan za diferencijaciju i integraciju progenitora nefrona tokom mezenhimalnih u epitelne tranzicije (MET) (Yallowitz et al., 2011).

DAR koji povećava nedostupnost na hromozomu 24 preklapa regiju hromatina sa predviđenom aktivnošću pojačivača za faktor transkripcije Pax8 u ćelijama uzgojenim iz mišjeg bubrega, crijevnog epitela i materice (Gao & Qian, 2020). Pax8 je djelimično redundantan sa Pax2, ali je najmanje jedan od ova dva faktora transkripcije potreban u progenitorima nefrona zabubregrazvoj (Bouchard et al., 2002; Narlis et al., 2007). Prethodno smo primijetili da se ekspresija Pax8 povećava u diferenciranim i diferenciranim progenitorima nefrona (dopunska slika 7), i primjećujemo značajno povećanje pristupačnosti u DAR-u koji obuhvata ovu regulatornu karakteristiku. Ovaj region je takođe povezan sa oznakom aktivnog pojačivača, H3K27ac, i vezivanjem Ctnnb1, Lef1, Six2 i Tcf7 u objavljenim ChIP-seq podacima iz primarnih E16.5 nefronskih progenitora (Slika 5) (Guo et al., 2021). Uočavamo brojne otiske faktora transkripcije koji spadaju u visoko očuvani vrh pristupačnosti ovog DAR-a, uključujući dva za Sall1, nuklearni faktor za koji se zna da utječe na nefrogenezu (Kanda et al., 2014.) i sedam blisko grupiranih otisaka za cink prst povezan s MYC protein (Maz), faktor transkripcije za koji se pokazalo da ima efekte zavisne od dozebubregrazvoj kod ljudi i miševa (Haller et al., 2018). Dodatna tabela 3 sadrži kompletnu listu pristupačnih regiona koje nalazimo, kao i njihovu odgovarajuću diferencijalnu dostupnost statistiku, napomene za gene, egzone i promotere koje se preklapaju, i liste ključnih identifikovanih otisaka transkripcionih faktora povezanih sa nefrogenezom.

Slika 4. ATAC-seq profili na poznatim i pretpostavljenim regulatornim lokusima. Za svaki panel od vrha do dna, fasete označavaju obogaćivanje naboradostupnost hromatinau uzorcima E14.5 i P0, sa IDR-ovima i DAR-ovima identificiranim kao istaknuti dio plave (nepromjenjivi IDR) i zelene boje (otvaranje DAR-a). i crvena (zatvara DAR). Sljedeći aspekt prikazuje napomene gena, nukleozomske pozicije (sivo) i regije bez nukleozoma (crvene) mjerene u objedinjenim E14.5 i P0 uzorcima, i PhastCon60 rezultate očuvanja (crna označava 1{{ 12}}0 posto očuvanja, bijeli 0 posto očuvanih A) Promotor i gensko tijelo faktora transkripcije Six2. B) Enhancer za Six2 u izdanju Park et. al. C) Diferencijalno dostupan pojačivač za Gdnf sa povećanom dostupnošću na P0. D)Promoter za Gdnf.

Slika 5. DAR-ovi koji se preklapaju sa potencijalnim novim pojačivačima za gene povezane sa nefrogenezom. A i C) Paneli prikazuju mapu 1MB regiona koji okružuje gen od interesa, sa genima koji kodiraju protein u zelenoj boji i predloženom interakcijom pojačivač/promotor kao crna petlja . B i D) Od vrha do dna, paneli prikazuju obogaćenje naboradostupnost hromatinamjereno u uzorcima E14.5 i P0, sa IDR-ovima označenim zelenom (otvaranje) i crvenom (zatvaranje), nakon čega slijede mjerenja ChIP-seq u ovim regijama koje su izmjerili Guo et. al. u primarnom progenitoru nefronaćelije(Guo et al., 2021). Treći panel prikazuje oznake gena (plavi) i predviđene regulatorne elemente iz Enhancer Atlas 2.0 (crveni), a četvrti panel označava otiske faktora transkripcije identifikovane u ATAC-seq podacima. Peti panel prikazuje nukleozome (sivi) i NFR (crveni), a donji panel označava očuvanje. A) 1MB regija koja sadrži tijelo gena za Eya1 i potencijalni Eya1 pojačivač otprilike 325 kb uzvodno. B) Region od 4,5 kb koji sadrži potencijalni Eya1 pojačivač. C) 1MB region koji sadrži lokus gena Pax8 i predviđeni pojačivač. D) Region od 4,5 kb koji sadrži predviđeni pojačivač i njegov DAR koji se preklapa.

Topološki povezani domeni pomažu u identifikaciji potencijalnih pojačivača—miRNA odnosa

Topološki pridruženi domeni (TAD) su regije megabazne skale organizacije hromatina višeg reda koje su rezultat pakiranja hromatina u jezgro u trodimenzionalnom prostoru (Dixon et al., 2012), a interakcije pojačivača i promotora obično su ograničene na elemenata unutar istog TAD-a (Symmons et al., 2014). Aproksimirali smo TAD iz nefronskih progenitora koristeći napomene generirane iz mišjih embrionalnih matičnih ćelija (ESC) (Y. Wang et al., 2018). Kako bismo pregledali moguće cis-regulatorne regije miRNA, povezali smo promjene udostupnost hromatinasa različito izraženom miRNA unutar istog TAD-a. Sve u svemu, 42,778 jedinstvenih pristupačnih regiona (oko 92 procenta) nalazi se unutar označenih TAD-ova, a od njih 30,626 (oko 72 procenta) se ne preklapaju sa poznatim promoterom. Ovo uključuje 2.103 DAR-a, sa 1.180 i 923 otvaranja i zatvaranja tokom vremena, respektivno. Petnaest otvarajućih DAR-ova dijeli TAD sa jednom ili više miRNA sa povećanom ekspresijom između E14.5 i P0, a devet DAR-ova zatvaranja dijeli TAD sa jednom ili više miRNA sa smanjenom ekspresijom. Slika 6 rezimira ovaj pristup i ilustruje udaljenosti između DAR-ova i njihove uparene miRNA, koje se kreću od 27 kb do preko 1 mb (prosjek: 447 kb). Tabela 1 daje detalje skupova mogućih DAR – miRNA odnosa, s jednim DAR-om navedenim po podudarnoj miRNA.

Među navedenim parovima pojačivača miRNA, primjećujemo tri od posebnog interesa. Prvo, identifikovan je početni DAR 120 kb nizvodno od let-7c-5p i 73 kb nizvodno od miR-125b-5p, koji je povezan sa Six2 mjesto vezivanja u ranije objavljenom skupu podataka ChIP-seq progenitor E16.5 nefrona (Slika 7A) (Guo et al., 2021.). Let-7c-5p je jedna od najizraženijih let-7 miRNA koje otkrivamo, a poznato je da porodica let{17}} potiskuje Lin28b transkripte (Slack & Ruvkun, 1997; Zhu et al., 2011). Napominjemo da su Hmga2 i Meis2 također identificirani kao potencijalni novi ciljevi porodice let-7 u progenitorima nefrona (slika 2). Također se pokazalo da miR-125b-5p potiskuje transkripte Lin28 u hematopoetskim i progenitorskim tipovima mišjih ćelija (Chaudhuri et al., 2012). Drugo, miR-9-3p je obrnuti komplement miR-9-5p, miRNA za koju se nedavno pokazalo da štiti odbubregfibroza ciljanjem metaboličkih puteva (Fierro-Fernández et al., 2020). Otkrili smo više od 10-putostruko smanjenje miR-9-3 transkripta između E14.5 i P0 progenitora nefrona, i identifikovali smo potencijalni regulatorni element udaljen otprilike 249 kb (Slika 7B). Promatramo otiske faktora transkripcije za Snai1 i Snai2 u povezanom DAR-u, za koje se pokazalo da promovišu epitelno-mezenhimalne tranzicije (EMT) (Sundararajan et al., 2019.). Konačno, uporedili smo miR-181a-2-3p sa mogućim intergenskim cis-regulatornim lokusom 131kb uzvodno na hromozomu 2, gdje bilježimo otisak transkripcionog faktora za faktor transkripcije Wt1, ključni regulator progenitora nefrona preživljavanje (Kreidberg et al., 1993.) i vezivanje Six2 u objavljenom skupu podataka ChIP-seq progenitor E16.5 nefrona (Slika 7C) (Guo et al., 2021.).

Tabela 1. Promjene ekspresije miRNA, uparene s jednim ili više DAR-a u istom TAD-u.

Slika 6. Pronalaženje kandidata pojačivača—cilja-miRNA parova.A) Dijagram toka koji pokazuje kako su regioni pristupačnosti bili prioritetni za moguću regulaciju ekspresije miRNA. B) Genomske lokacije svake skrinirane miRNA u odnosu na njihov kandidat pojačivača (narandžasta vertikalna traka). Skala njihove log2 puta promjene je prikazana na y-osi, a miRNA sa povećanjem ili smanjenjem ekspresije označene su zelenom, odnosno crvenom bojom.

Slika 7. Četiri potencijalna pojačivača—cilja miRNA para.TAD-ovi su označeni sivom bojom, poravnati prema početnim tačkama i nacrtani u istoj skali kako bi se ilustrovala relativna veličina. Poznati geni iz Ensembla prikazani su ljubičastom bojom, a tamnije regije označavaju egzone. Relativna pristupačnost na E14.5 i P0 prikazana je kao dijagrami iznad i ispod horizontalne crne linije, respektivno, kao i na umetnutim dijagramima koji ilustruju nagomilavanje u navedenom DAR-u zajedno sa podacima ChIP-seq koje su objavili Guo et. . al. (Guo et al., 2021). Otisci faktora transkripcije identifikovani sa HINT su navedeni u narandžastim banerima. Trakasti grafikoni u odvojenim panelima na desnoj strani ukazuju na ekspresiju miRNA (zelena) i normalizovane događaje umetanja Tn5 u predloženim regionima pojačivača (narandžasto). A) Član porodice let-7 let{8}}c-5p je veoma izražen unefronske progenitorne ćelijei podudara se sa "peak_54636" udaljenom 119 kb u međugenskoj regiji. B) miR-9-3p se podudara sa DAR-om udaljenim 249 kb. C) miR-181a 2-3p se nalazi 131kb udaljen od "peak_5887", mogućeg međugenskog pojačivača.

Diskusija

U ovoj studiji, nastojali smo da istovremeno identifikujemo novu miRNA koja doprinosi prestanku nefrogeneze, zajedno sa potencijalnim cis-regulatornim karakteristikama. Identifikovali smo 114 miRNA koje su različito eksprimirane u progenitornim ćelijama nefrona, kao i 2,103 DAR-a, u E14.5 u poređenju sa P0bubrezi. Uočavamo više karakteristika koje predviđaju nove navodne pojačivače za gene Eya1 i Pax8 innefronske progenitorne ćelije. Konačno, identifikovali smo dosljednostdostupnost hromatinai promjene ekspresije miRNA za 33 para miRNA i DAR-ova, uključujući let-7-5p, miR-125b-5p, miR-181a-2-3p, i miR-9-3p, i predstavljaju navodne ciljne gene eksprimirane u progenitorima nefrona za različito eksprimirane miRNA. Zajedno, naši podaci pokazuju da se promjene svojstvene progenitorima nefrona i ovisno o stadiju nefrogeneze odražavaju u hromatinskom okruženju progenitorske ćelije i u njenom miRNA transkriptomu.

Među promjenama koje uočavamo u transkriptomu miRNA progenitor nefrona, primjećujemo široka povećanja ekspresije u porodici let{{0}} kako preci stari. Ovo je u skladu s prethodnim izvještajima: Lin28b protein i let-7 porodica miRNA su međusobno antagonistički i formiraju bistabilni prekidač koji upravlja let-7 ekspresijom kod sisara (Zhu et al., 2011.) i progenitora nefrona, prelazak na povećanu ekspresiju let-7 direktno utiče na vrijeme prestanka nefrogeneze (Yermalovich et al., 2019). Također primjećujemo povećanu ekspresiju miR-125b-5p, za koju je poznato da potiskuje ekspresiju Lin28b u drugim ćelijskim kontekstima (Chaudhuri et al., 2012; Potenza et al., 2017). Porodica let-7 i miR-125b-5p spadaju među 114 miRNA koja je različito eksprimirana između E14.5 i P0 u progenitorima nefrona, što sugerira ulogu miRNA u razvoju progenitora nefrona nije ograničeno na let-7/Lin28b. Na primjer, miRNA koje smanjuju ekspresiju uključuju dva člana porodice miR-200, za koju se navodi da igra ulogu u diferencijaciji podocita (Z. Li et al., 2016): miR-200b -3p i miR-429-3p. Dalje, uočavamo smanjenje ekspresije miR-126a 5p, za koji je poznato da promoviše vaskulogenezu (Schober et al., 2014; S. Wang et al., 2008). Ovo može odražavati zajedničku mezenhimsku lozu vaskulogenih i nefronskih progenitora, i opredijeljenost podskupine ovih stanica da postanu progenitori nefrona.

Analize puteva predviđenih genskih ciljeva mijenjanja miRNA pomoću DIANA miRPath (Vlachos et al., 2015.) pokazuju obogaćivanje MAPK i TGF signalizacije, oba ključna regulatora nefronskih progenitora (Hilliard et al., 2019.; Ihermann-Hella et al., 2018. ). Nekoliko drugih KEGG puteva je također previše zastupljeno među predviđenim genskim ciljevima pojačano reguliranih miRNA, uključujući puteve vezane za ekstracelularni matriks, aktinski citoskelet i fokalnu adheziju: svi ključni aspekti ćelijske migracije, diferencijacije, grananja, vezivanja, polarizacije i proliferacije (Rozario & Desimone, 2010). ECM povezani geni su ciljani nekim od najizraženijih i značajno rastućih miRNA koje otkrivamo, uključujući i transkript s najvećom ekspresijom koji detektiramo: miR-196a-5p. Poznato je da miR-196a-5p cilja Col1a1, Col1a2 i Col3a1—gene koji su regulirani u pax{19}}nefronskim progenitorima koji prolaze kroz transdiferencijaciju u bubrežnu stromu (Naiman et. al., 2017). Stoga, povećana miR-196a-5ekspresija može imati ulogu u jačanju granica loze kako stari preci. Nadalje, identificirali smo nove potencijalne ciljne interakcije miRNA-mRNA koje mogu doprinijeti prestanku nefrogeneze, uključujući i regulaciju let-7 porodice koja može ciljati Hmga2 i Meis2 (povezana sa proliferacijom ćelija) (Abruzzese et al. ., 2019; Fusco & Fedele, 2007; Lam et al., 2014; Mugford et al., 2009) kao starenje progenitora nefrona. Hmga2 nema poznatu ulogu ububregrazvoj. Međutim, smatra se da se Meis2 funkcionalno preklapa sa srodnim faktorom transkripcije Meis1, za koji se zna da je potreban za razvoj bubrega (Hisa et al., 2004). Također primjećujemo smanjenje miR-ova (miR-34b-5p, miR-983p i miR-200a-3p) koje mogu ciljati Jag1, za koji je poznato da je pojačano reguliran i važan u diferencijaciji nefrona (Chung et al., 2016).

Zajedno sa promjenjivim miRNA transkriptomom, istovremeno smo mjerili promjene u hromatinskom okruženju nefronske progenitorske ćelije između E14.5 i P0. Opisujemo dva navodna nova pojačivača za Eya1 i Pax8, na osnovu (i) njihove blizine ovim genskim promotorima, (ii) njihovih odgovarajućih promjena udostupnost hromatinatokom razvoja u skladu sa pseudovremenskim promenama ekspresije gena tokom diferencijacije, (iii) otisci stopalabubregrazvojni transkripcijski faktori, (iv) očuvanje sekvence, (v) dokaz funkcije pojačivača u drugim tkivima/tipovima ćelija iz Enhancer Atlas2.0 (Gao & Qian, 2020.) i (vi) ChIP-seq podaci u E16 .5 progenitori nefrona za oznaku aktivnih pojačivača (H3K27ac) i vezivanje faktora transkripcije Ctnnb1, Lef1, Six2 i Tcf7. Uočavamo smanjenje dostupnosti hromatina za Eya1 pojačivač, što je u skladu s ulogom Eya1 u promicanju multipotencije nefrona progenitora i sa izvještajima da gubitak Eya1 rezultira ranom epitelizacijom progenitorske populacije (J. Xu et al., 2014; PX Xu et al., 1999). Pax8 i njegov homolog Pax2 doprinose specifikaciji loze progenitora nefrona (Bouchard et al., 2002), a nefronski progenitori bez barem jednog od ovih gena neće biti podvrgnuti MET (Narlis et al., 2007). Povećana dostupnost hromatina koju otkrivamo za navodni pojačivač Pax8 u skladu je sa povećanom ekspresijom Pax8 u bubrežnom epitelu kako se nefroni diferenciraju.

Analiza obogaćivanja (McLean et al., 2010.) DAR-ova otkrila je "regulaciju epitelne diferencijacije" kao najznačajnije obogaćeni termin među otvorima hromatinskih regija, što ukazuje da DAR-ovi koje otkrijemo mogu sadržavati regulatorne karakteristike koje pokreću ili odgovaraju na signale za diferencijaciju i razvojnefronske progenitorne ćelijeu tipove epitelnih ćelija. Notch signalizacija je među najznačajnije obogaćenim GO terminima identificiranim među početnim DAR-ovima, a u progenitorima nefrona, poznato je da ovaj put potiskuje ekspresiju Six2 i promovira diferencijaciju nefronskih progenitorskih stanica (Chung et al., 2016). Među impliciranim genima ovog puta je Jag1, ključni ligand u Notch signalizaciji čija je ekspresija u inverznoj korelaciji sa ekspresijom Six2 i Hes1 (Chung et al., 2016). Napominjemo da je Jag1 označena meta za tri miRNA sa rastućom ekspresijom (miR34b-5p, miR98-3p i miR200a-3p, slika 2). Konačno, primjećujemo obogaćivanje gena povezanih s remodeliranjem krvnih žila i morfogenezom u otvaranju DAR-ova, iako se čini da je to posljedica gena zajedničkih između ovih razvojnih puteva i diferencijacije epitelnih stanica, uključujući Jag1, Eya1, Hes1, Foxc1 i Hey2.

Promjene udostupnost hromatinameđunefronske progenitorne ćelijemjerene su u prethodnim studijama (Guo et al., 2021; Hilliard et al., 2019).

Sve u svemu, naši rezultati su u skladu sa ovim prethodnim studijama, ističući gene srodne Notchsignaling i Pax{0}}. Međutim, potrebno je napomenuti da postoje neke eksperimentalne razlike u ovim prethodnim studijama u poređenju sa ovim izvještajem. Izolacija progenitora nefrona koji eksprimiraju GFP korištenjem ćelije aktivirane fluorescencijom iz Six2-TGC transgenskog reporter miša je potencijalno zbunjena nalazom da ovaj alel ima zabilježeno smanjenje broja nefrona od približno 45 posto (Hilliard et al. , 2019; Volovelsky et al., 2018). Pored toga, pokazalo se da kultivisani progenitori nefrona (uzgajani sa niskom ili visokom dozom CHIR) imaju različite transkriptome od primarnih nefronskih progenitora, što sugeriše da bi njihova dostupnost hromatinu takođe bila drugačija (Guo et al., 2021; Hilliard et al., 2019). Budući da je cilj našeg istraživanja bio razumjeti kako promjene u kromatinskom pejzažu utiču na ekspresiju miRNA u ranim i kasnim progenitorima nefrona, bila je neophodna analiza primarnih nefronskih progenitora.

Cistanche je bolji za bubrege

Kombinovanjem ovih uočenih promena u okruženju hromatina sa podudarnim promenama u ekspresiji miRNA, mi impliciramo nekoliko novih navodnih parova pojačivača miRNA u prestanak nefrogeneze za dalje proučavanje. MiRNA miR-125a-5p i let{3}}c-5p, na primjer, vide značajno povećanje ekspresije između E14.5 i P0 , a to je rekapitulirano sve većom nedostupnošću DAR-a (chr16:77,719,058 77,720,407) u istom TAD-u. Ovaj DAR je također povezan sa Six2 veznim mjestom (Guo et al., 2021) i može označavati pojačivač koji utiče na ekspresiju miR-125a-5p i/ili let{{18} }c-5p, što bi zauzvrat moglo promovirati diferencijaciju putem potiskivanja Lin28b. Slično tome, uočavamo mogući pojačivač za miR 181a, za koji je poznato da modulira ekspresiju renina kod ljudi (Marques et al., 2015) i smatra se terapijskim ciljem za smanjenje nefrotoksičnosti zbog svoje sposobnosti da potisne BIRC6 i apoptozu (Liu et al., 2015.) al., 2018). Konačno, uočavamo završni DAR povezan sa miR-9-3p koji ima otiske faktora transkripcije za proteine ​​koji reaguju na Wnt signalizaciju Snai1 i Snai2.miR-9-3p obrnuti komplement, miR-9-5p, poznato je da štiti odbubregfibroza (Fierro‐Fernández et al., 2020), Snai1 i Snai2 su pokazali da potiču metastaze karcinoma u ćelijama raka kože miša (Olmeda et al., 2008) i da promovišu epitelne-mezenhimalne tranzicije (EMT) kod pacijenata sa rakom (Sundararajan et al., 2019), dok je poznato da miR-9 promovira angiogenezu i migraciju endotelnih ćelija tumora (Zhuang et al., 2012). Može postojati mehanizam u kojem povećana Wnt signalizacija rezultira smanjenom ekspresijom Snai1 i Snai2, što zauzvrat smanjuje ekspresiju miR-9-3p kako bi podržala diferencijaciju progenitora nefrona.

Naša studija je sveobuhvatno identifikovala promene u hromatinskom pejzažu i miRNA transkriptomu nefronskih progenitora tokom embrionalnog razvoja, i identifikovali smo kandidate za cis-regulatorne regione i miRNA koji mogu igrati ulogu u prestanku nefrogeneze. Analize obogaćivanja i za mRNA-seq i za ATAC-seq podatke pružaju primamljive naznake o mehanizmima koji mogu biti uključeni, kao što su putevi koji reguliraju diferencijaciju progenitora nefrona, uključujući Notch i TGF-. Također izvještavamo o dva nova pretpostavljena regulatorna elementa za Eya1 i Pax8, gene za koje se zna da su važnibubregrazvoj i potencijalne regulatorne sekvence za ključne miRNA koje su uključene u prestanak nefrogeneze.

Metode

Sojevi miševa

Trudne ženke divljeg tipa CD-1 nabavljene su od Charles River Laboratories, Inc. (Wilmington, MA, SAD, RRID: MGI:5659424) ibubrezisakupljeni su iz legla na dan embriona E14.5 ili P0. Sve životinje su bile smještene u vivariju u Istraživačkom centru Rangos pri UPMC Children's Hospital u Pittsburghu (Pittsburgh, PA, SAD) i svi eksperimenti na životinjama su izvedeni u skladu sa politikama Institucionalne komisije za brigu o životinjama i korištenje na Univerzitetu u Pittsburgh. Pol za svaki embrion ili štene je identifikovan izvođenjem PCR-a na genomskoj DNK izolovanoj iz isječenog repa koristeći sljedeće prajmere za gen Y-hromozoma Sry: SryF 5ʹ-GATGATTTGAGTGGAAATGTGAGGTA-3ʹ i SryR 5ʹ-CTTATGTTTATAGGCATG{6} ranije objavljeno (McFarlane et al., 2013).

Sekvenciranje i analiza male RNK

Ukupna RNK izolirana iznefronske progenitorne ćelijepreostala nakon uklanjanja ATAC-seq ćelijske frakcije dostavljena je jezgru za sekvenciranje zdravstvenih nauka u UPMC Children's Hospital u Pittsburghu na pripremu biblioteke koristeći QIAseq miRNA komplet za pripremu biblioteke (Qiagen 3315{{10}}2). Jednostrano sekvencioniranje mRNA-seq biblioteka je izvedeno na Illumina NextSeq500, a biblioteke su sekvencionirane do dubine od približno 50 miliona jednostranih čitanja po biblioteci. Sekvencionirana očitanja su zatim usklađena s mišjim mm10 genomom pomoću paketa Rsubread (Liao et al., 2019) (verzija 2.0.1) i označena poznatom miRNA navedenom u miRBase (verzija 22) (Kozomara & Griffiths-Jones, 2014) sa funkcijom featureCounts paketa Rsubread. Diferencijalna ekspresija poznate miRNA je mjerena korištenjem DESeq2 R paketa (verzija 1.26.0) (Love et al., 2014). Frakcija usklađenih očitavanja označena poznatom miRNA, kao i frakcija ženskih embriona po uzorku, uključeni su kao kofaktori u model testiranja dostavljen DESeq2. Diferencijalno izražena miRNA je zatim identificirana uz kontrolu stope lažnog otkrivanja od 5 posto, a njihov smjer promjene (povećanje nasuprot opadanju) određen je na osnovu njihove vrijednosti promjene puta („povećanje“ ukazuje na veću ekspresiju na P0 u poređenju sa E14.5) . Obogaćivanje regulatornih puteva među predviđenim genskim ciljevima miRNA sa značajno povećanjem i smanjenjem ekspresije izračunato je pomoću DIANA alata miRPath verzija 3.0 (Vlachos et al., 2015). Predviđeni ciljni transkripti za miRNA su preuzeti iz TargetScan (Agarwal et al., 2015) i miRDB (Y. Chen & Wang, 2020) spremišta.

Izolacija progenitora nefrona

Bubrezisecirani su iz legla {{0}} E14.5 embriona ili P0 mladunaca, a svako leglo se smatralo jednim uzorkom. Jedan bubreg po uzorku je korišten za izolaciju ukupne RNK da bi se koristio kao "kontrola cijelog bubrega" u narednim analizama (vidi dolje). Ukupno su prikupljena tri uzorka u svakoj vremenskoj tački. Kortikalne ćelije su zatim izolovane iz svakog uzorka korišćenjem magnetno aktiviranog sortiranja ćelija (MACS) kao što je ranije objavljeno (Brown et al., 2011). Ukratko, bubrezi su podvrgnuti parcijalnoj probavi sa 2 mM kolagenaze A (Roche 11088793001) i 3,5 mM pankreatina (Sigma P1625) u fiziološkom rastvoru puferovanom fosfatom (PBS) tokom 15 minuta na 37 stepeni. Reakcija digestije je zaustavljena upotrebom hladnog 100 posto fetalnog goveđeg seruma (FBS), a suspenzija ćelija je sakupljena i resuspendovana u hladnom Dulbeccovom fiziološkom rastvoru puferovanom sa fosfatom (DPBS) sa 1mM inhibitorom proteaze fenilmetilsulfonil fluorida (PMSF) (Sigma10831700909). Ćelije su isprane i resuspendirane u ledeno hladnom puferu za izolaciju koji se sastojao od 2 procenta FBS-a u PBS-u, zatim inkubirane sa magnetnim kuglicama (Dynabeads FlowComp Flexi kit, ThermoFisher 11061D) biotiniliranim do antitijela za Integrin alpha 8, R&D768 koristeći DSB-X komplet za označavanje proteina biotinom (ThermoFisher D-20655). Progenitori nefrona vezani za ove kuglice izolovani su kao što je prethodno objavljeno (Hemker et al., 2020) i spojeni preko bubrega za svaki uzorak. Alikvot od 50,000 nefron progenitor ćelija je odmah obrađen krozdostupnost hromatinaprotokol pripreme biblioteke (vidi dolje), a ukupna RNK je ekstrahirana iz preostale ćelijske suspenzije korištenjem Qiagen miRNeasy Mini Kit (Qiagen 217004).

Za potvrdu obogaćivanjanefronske progenitorne ćelijeU odnosu na druge tipove ćelija, ukupna RNK je izolovana iz nefronskih progenitora kao i iz celinebubrezi(cijela kontrola bubrega, vidi gore), i urađena je kvantitativna PCR reverzne transkripcije (qRT-PCR) za sljedeće markere: markere progenitor nefrona Six2 i Cited1 (L. Huang et al., 2016), a za Lhx1, Pdgfr, Pecan i Caleb koji obilježavaju bubrežne vezikule (Brunskill et al., 2014), bubrežnu stromu (S. Chen et al., 2015), endotel (Kobayashi et al., 2008) i ureterni pupoljak (Cebrian et al., 2014a ) ćelije, respektivno; također vidi Dodatnu sliku 1. Gapdh (Barber et al., 2005) je korišten kao gen za održavanje kućanstva, a relativna kvantifikacija je izračunata pomoću 2-ΔΔCt metode (Livak & Schmittgen, 2001). Prajmeri za ove transkripte su uključeni u tabelu 2.

Tabela 2. RT-PCR prajmeri.

Pristupačnost hromatinapriprema biblioteke

Približno 50,000nefronske progenitorne ćelijekorišteni su za generiranje svake biblioteke sekvenciranja za ATAC-seq koristeći Nextera DNA Flex Library Prep Kit (Illumina FC-121-1030) sa modifikacijama prema prethodno objavljenoj metodi (Buenrostro et al., 2013). Ukratko, ćelije su suspendovane u ledeno hladnom nejonskom puferu za lizu koji se sastojao od 10 mM Tris, 10 mM NaCl, 3 mM MgCl2, 1 mM PMSF inhibitora proteaze i 0,05 posto Triton X-100 po zapremini tokom 10 minuta da bi se lizirale ćelije membrane ostavljajući nuklearne membrane netaknute. Intaktna progenitorna jezgra nefrona su resuspendovana u transpozicionom puferu koji sadrži enzim transpozazu i inkubirana na 37 stepeni 30 minuta. Slobodna genomska DNK oslobođena postupkom transpozicije je pročišćena korištenjem MinElute PCR Purification kita (Qiagen 28004), a zatim indeksirana korištenjem prajmera naprijed (i7) i obrnutog (i5) indeksa iz Nextera Index Kit (Illumina FC-121-1011). Ligacija indeksa i amplifikacija fragmenta postignuti su korištenjem termalnog ciklusnog programa PCR amplifikacije ove metode.

Da bi se odredio optimalan broj ciklusa amplifikacije koji je potreban za ATAC-seq biblioteku, izvedena je qPCR nuspojava pomoću SsoAdvanced SYBR Supermix (BioRad 1725274) i 96-jažice C100 Thermal Cycler (Bio-Rad) za izračunavanje normaliziranog reporterska vrijednost (Rn) za svaki ciklus. Broj ciklusa pri kojem je reakcija dostigla jednu trećinu svoje maksimalne fluorescencije identificiran je kao optimalan broj preostalih ciklusa amplifikacije, a preostali volumen indeksirane reakcije ATAC-seq transpozicije podvrgnut je tom broju dodatnih ciklusa u konačnom pojačavanju program. Konačne biblioteke su pročišćene pomoću Ampure XP magnetnih perli (Beckman Coulter A63881).

Pristupačnost hromatinasekvenciranje

Sekvenciranje uparenog kraja ATAC-seq biblioteke izvedeno je na Illumina NextSeq500 od strane Health Science Sequencing Core u UPMC Children's Hospital u Pittsburghu, multipleksirano sa koncentracijama biblioteke za koje se očekuje da će dati 90 miliona čitanja uparenih krajeva po uzorku . Čitanja su kvalitetno skraćena korištenjem TrimGalore (BabrahamLab, 2014) (verzija 0.4.3) u "--uparenom" načinu i sa inače zadanim postavkama. Čitanja su usklađena sa genomom mm10 (Church et al., 2011) korištenjem Bowtie2 (Langmead et al., 2009) (verzija 2.3.1) sa postavkama "--local -q -X 2000 -- m". Čitanja koja su rezultat PCR duplikata istog fragmenta DNK označena su pomoću funkcije MarkDuplicates (verzija 2.10.9) Picard Tools-a (Broad Institute, 2016.) sa zadanim postavkama. Čitanja koja su se dvosmisleno mapirala na više od jedne lokacije u genomu nasumično su dodijeljena jednoj od ovih lokacija ako je bilo manje od četiri mogućnosti, a inače su eliminirana (ENCODE, nd) (pomoću Python skripte dostupne na https://github. com/kundajelab/atac_dnase_cijevovodi, (Lee, 2017) sa postavkama "--paired-end -k"). Samtools (H. Li et al., 2009) (verzija 1.3.1) korišten je za filtriranje dupliciranih, nemapiranih, bez roditelja i mitohondrijalnih čitanja, kao i za sortiranje i indeksiranje BAM datoteka. Kontrola kvaliteta ATAC-seq podataka slijedila je ATAC-seq smjernice projekta ENCODE (ENCODE, nd), a biblioteke uzoraka su nasumično smanjene na niže uzorkovanje kako bi svaka sadržavala 31 milion čitanja uparenih krajeva kako bi se normalizirale razlike u veličinama biblioteka.

Cistanche može spriječiti infekciju bubrega

Identifikacija pristupačnih hromatinskih regiona

BAM fajlovi koji sadrže filtrirana čitanja ATAC-seq konvertovani su u BED format uparenog kraja koristeći Bedtools' (Quinlan & Hall, 201{{20}}) (verzija 2.26.0) 'bombed ' funkcija sa postavkama "- krevet pe -mate1". Regije pristupačnog hromatina su identifikovane korišćenjem alata za analizu ChIP-seq zasnovanog na modelu (MACS2, verzija 2.1.1.20160309) širokog vrha algoritma za pozivanje (Zhang et al., 2008), sa postavkama "--format BEDPE {{ 18}}g mm -p 0.01 --široki --pomak 37 --veličina teksta 75 --zadrži sve --model“. Da bi se identifikovala pristupačna područja s visokom pouzdanošću, obavljena su poređenja u parovima (svake kombinacije replika iz date vremenske tačke) i izračunata je stopa neponovljivog otkrića (IDR) (Q. Li et al., 2011.) korištenjem javno dostupnog Python implementacija (GitHub https://github.com/nboley/idr) (Boleu et al., 2015) sa postavkama "--input-file-type široki vrh --rank p.value {{ 35}}soft-IDR-threshold 0.1 --output-file-type bed". Konkretno, za svaku vremensku tačku konkatenirani BED fajl svih dostupnih regija je dostavljen kroz argument "--peak-list" za svako poređenje (na primjer, kada se upoređuje dva uzorka E14.5, svi E14.5 široki vrhovi između sve tri replike se koriste). Regije pristupačnosti koje su bile konzistentne prema IDR-u u najmanje dva poređenja u parovima (sa najmanje 20 posto preklapanja) kombinovane su u jedinstveni skup visokopouzdanih pristupačnih regiona („regije IDR“).

Promjene u pristupačnim regijama hromatina

Pristupačnost svakog IDR regiona unutar datog uzorka kvantifikovana je brojanjem broja događaja transpozicije koji se dešavaju tokom normalizacije za sekvencu GC-sadržaja u uzorcima. Ovo je postignuto upotrebom prilagođene skripte (dostupne u pratećem softverskom spremištu, pogledajte dodatne podatke). Promjene u ovoj dostupnosti su zatim određene poređenjem ovih vrijednosti u vremenskim tačkama korištenjem softverskog paketa Limma-voom (verzija 3.42.2) (Ritchie et al., 2006). Da bi se objasnio spol embrija, frakcija ženskih embriona u svakom uzorku je uključena kao kofaktor u linearne modele koji se koriste za diferencijalnu analizu pristupačnosti, a uklonjen je kao skupni efekat u vizualizacijama korištenjem funkcije uklanjanja serije paketa Limma. Smatralo se da se različito pristupačne regije kromatina (DAR) značajno otvaraju (povećana pristupačnost između E14.5 i P0) ili zatvaraju (smanjena pristupačnost između E14.5 i P0) kada se kontrolira stopa lažnog otkrivanja od 10 posto . Analize funkcionalnog obogaćivanja otvaranja i zatvaranja genomskih regija određene su podnošenjem odgovarajućih koordinata alatu za obogaćivanje anotacija genomskih regija (GREAT, dostupan na http://great.stanford.edu/public/html/) (McLean et al., 2010. ). Napomene poznatih i predviđenih pojačivača preuzete su iz skladišta FANTOM5 (Andersson et al., 2014.), VISTA (Visel et al., 2007.) i EnhancerAtlas 2.0 (Gao & Qian, 2020.).

Otisci faktora transkripcije

Otisci faktora transkripcije su identifikovani objedinjavanjem svih BAM fajlova iz iste vremenske tačke, a zatim pokretanjem Hmm-baziranog softvera za identifikaciju TF otisaka (HINT) iz Regulatory Genomics Toolbox-a (verzija 0.12.3), posebno modela otiska za ATAC -seq podaci (dostupni na www.regulatory-genomics.org) (Z. Li et al., 2018). Ovaj softver je pokrenut s postavkama "right-hint footprinting --organizam=mm10 --at-seq --paired-end". Otisci stopala su zatim označeni poznatim motivima vezivanja miša iz baze podataka HOCOMOCO 11 (Kulakovskiy et al., 2018) koristeći HINT-ovu funkciju podudaranja motiva s postavkama "analiza desnog motiva koja odgovara --organizmu=mm10". Otisci stopala sa HINT rezultatom ispod 10 su isključeni. Konačno, obrasci diferencijalne aktivnosti između otisaka stopala koji se podudaraju s motivom mjereni su korištenjem diferencijalne funkcije programa RGT-HINT, sa postavkama "diferencijal desno-hint --organizam=mm10 --bc {{27} }NC 12 --izlazni profili". Nivoi aktivnosti koji se značajno mijenjaju su identifikovani na osnovu granične vrijednosti p-vrijednosti od 0,05 (Friedman-Nemeny metoda).

Cistanche može poboljšati funkciju bubrega

Nukleosomska konfiguracija

Poravnana očitavanja iz iste vremenske tačke su objedinjena u jednu BAM datoteku, a NucleoATAC paket (verzija 0.3.4) je korišten za identifikaciju obrazaca u dužinama čitanja koji sugeriraju i na vezane nukleozomske dijade i na regije bez nukleozoma ( NFR) (Schep et al., 2015). Ovaj softver je pokrenut korištenjem zadanih postavki. Nukleozomi su označeni kao region od 146 bp usredsređen oko svake nazvane nukleosomska dijada.

Ekspresija jednoćelijske RNA

Podaci o ekspresiji gena za jednu ćeliju obrađeni su za prethodni rukopis (BioRxiv https://www.biorxiv.org/content/10.1101/2020.09.16.300293v1) (Bais et al., 2020.) i preuzeti su iz Omnibusa genske ekspresije (GEOID GSE158166). Obrađeni podaci uključeni u Dodatnu sliku 7 uključuju tipove ćelija, nivoe ekspresije gena, niskodimenzionalne (tSNE) ugradnje i pseudovremenske napomene u odnosu na putanju uspostavljenu između klastera proliferirajućih i diferencirajućih progenitora nefrona. Podacima se pristupilo i organizirano pomoću paketa SingleCellExperiment R (Lun & Risso, 2019.).

Interakcije miRNA-mRNA u starenju i diferencijaciji nefronskih progenitornih stanica

Geni sa promjenjivim izrazom između samoobnavljanja, pražnjenja i razlikovanjanefronske progenitorne ćelijedobijeni su iz Dodatnih tabela 3 i 4 koje su objavili Bais et al.. (FDR< 0.1="" for="" all="" genes,="" 99="" genes="" total).="" mirtarbase="" v8.0="" for="" the="" mouse="" was="" downloaded="" (https://mirtarbase.cuhk.edu.cn/~mirtarbase/mirtarbase_2022/cache/download/8.0/mmu_mt="" i.xls)="" while="" mirdb="" version="" 6.0="" predictions="" were="" obtained="" from="" the="" mid="" b="" website="" (y.="" chen="" &="" wang,="" 2020);="" high-quality="" mirna-to-target-gene="" predicted="" interactions="" with="" a="" minimum="" score="" of="" 90="" were="" considered.="" annotated="" mir="" target="" genes="" and="" differentially="" expressed="" genes="" were="" then="" intersected="" using="" the="" r="" programming="" environment="" to="" generate="" figure="" 2="" and="" supplemental="" table="">

Sekvenciranje imunoprecipitacije hromatina u primarnim progenitorima nefrona

Podaci sekvencioniranja imunoprecipitacije hromatina (ChIP-seq) za vezivanje -catenin, Lef1, Six2 i Tcf7 u primarnim progenitorima nefrona preuzeti su iz BedGraph datoteka u GEO repozitorijumu (GSE131119) za Guo et al., prosječne vrijednosti signala F iz 2021. godine. preko replika uzoraka.

Skrining za regulatorne elemente koji utiču na ekspresiju miRNA

Da bismo pregledali potencijalne pojačivače miRNA, označili smo miRNA i DAR-ove topološki povezanim domenima (TAD) u kojima se nalaze na osnovu mm10 napomena iz matičnih ćelija miša embriona, preuzetih iz 3D Genome Browser-a (dostupno na http://3dgenome). .fsm.northwestern.edu/) (Y. Wang et al., 2018). Regions ofdostupnost hromatinai miRNA su se smatrali kandidatima za pojačivače—miRNA parovi ako su zauzimali isti TAD i pokazali dosljedne promjene u pristupačnosti i ekspresiji (povećavajuća dostupnost sa povećanjem ekspresije miRNA i obrnuto). DAR-ovi su smatrani mogućim "regulatornim karakteristikama" samo ako se ne preklapaju sa poznatim promotorom ili krajem eksona. Potencijalni parovi miRNA i navodnih regulatornih elemenata bili su prioritet ako 1) spadaju u isti TAD i 2) doživljavaju značajne promjene između E14.5 i P0 (povećanje ekspresije miRNA i povećanje pristupačnosti IDR regije, i obrnuto) .

Priznanja

Shelby Hemker i Abha Bais doprinijeli su eksperimentalnom dizajnu. Sekvenciranje za ATAC-seq i mRNA-seq izvršilo je jezgro za sekvenciranje zdravstvenih nauka u UPMC Children's Hospital u Pittsburghu.

Konkurentni interesi

Nisu prijavljeni konkurentni interesi

Finansiranje

AC je podržan grantovima Nacionalnog instituta za dijabetes i probavu iBubregBolesti prema Nacionalnom institutu za zdravlje (T32DK061296-17). DK je podržan grantovima Nacionalnog instituta za opšte medicinske nauke u okviru Nacionalnog instituta za zdravlje (R01GM115836). JH je podržan grantovima Nacionalnog instituta za dijabetes i bolesti probave i bubrega u okviru Nacionalnog instituta za zdravlje (R01DK103776 i 125015). DMC je podržan od strane Nagrade za razvoj karijere Mreže za proučavanje nefrotskog sindroma (NEPTUNE) i postdoktorske stipendije Dječije bolnice u Pittsburghu. YP je podržan grantovima UPMC dječje bolnice u Pittsburghu i Sjevernoameričkog konzorcijuma za mitohondrijalnu bolest.

Dostupnost podataka

Predviđeni pojačivači miša preuzeti su iz FANTOM5 (DOI: 10.1038/nature12787; datoteka dostupna ovdje), Vista (DOI: 10.1093/var/gkl822; datoteka dostupna ovdje) i EnhancerAtlas (DOI: 10.1093/var/gkz9 datoteke dostupne ovdje) baze podataka. Genom mm10 miša i njegove napomene preuzeti su putem projekta Illumina genomes (dostupno ovdje). Over-chain fajl za podizanje mm9 koordinata na mm10 je preuzet iz UCSC pretraživača genoma (DOI: 10.1101/gr.229102; datoteka dostupna ovdje). TAD napomene iz embrionalnih matičnih ćelija miša preuzete su iz 3D Genome pretraživača (DOI: 10.1186/s13059-018-1519-9; fajl dostupan ovdje). Predviđene mete miRNA transkripta su preuzete iz TargetScan-a (DOI: 10.7554/eLife.05005, fajl dostupan ovde), i iz miRDB verzije 6 (DOI: 10.1093/var/gkz757, fajl dostupan ovde). ATAC-seq podaci uključujući IDR/DAR lokacije, napomene i rezultate diferencijalnog obogaćivanja dostupni su na GEO (GSE168339), kao i mRNA-seq podaci uključujući napomene i rezultate diferencijalne ekspresije (GSE168342). Kompjuterski kod koji se koristi za obradu i analizu podataka, te za generiranje brojki dostupan je na https://bitbucket.org/clugstonA/mirna_enhancers

Bibliografija

Abruzzese, MP, Bilotta, MT, Fionda, C., Zingoni, A., Soriani, A., Petrucci, MT, Ricciardi, MR, Molfetta, R., Paolini, R., Santoni, A., & Cippitelli, M (2019). Homeobox transkripcijski faktor MEIS2 je regulator preživljavanja ćelija raka i aktivnosti IMiD-a kod multiplog mijeloma: modulacija bromodomenskim i ekstra-terminalnim (BET) proteinskim inhibitorima. Ćelijska smrt i bolest, 10(4). https://doi.org/10.1038/s41419-019-1562-9

Agarwal, V., Bell, GW, Nam, JW, & Bartel, DP (2015). Predviđanje efikasnih mikroRNA ciljnih mjesta u mRNA sisara. ELife. https://doi.org/10.7554/eLife.05005

Andersson, R., Gebhard, C., Miguel-Escalada, I., Hoof, I., Bornholdt, J., Boyd, M., Chen, Y., Zhao, X., Schmidl, C., Suzuki, T ., Ntini, E., Arner, E., Valen, E., Li, K., Schwarzfischer, L., Glatz, D., Raithel, J., Lilje, B., Rapin, N., … Sandelin, A. (2014). Atlas aktivnih pojačivača kroz tipove ljudskih ćelija i tkiva. Nature, 507(7493), 455–461. https://doi.org/10.1038/nature12787

BabrahamLab. (2014). Trim Galore. U bioinformatici. http://www.bioinformatics.babraham.ac.uk/projects/trim_u izobilju

Bais, AS, Cerqueira, DM, Clugston, AS, Ho, J. i Kostka, D. (2020). Jednoćelijsko RNK sekvenciranje otkriva diferencijalnu aktivnost ćelijskog ciklusa u ključnim ćelijskim populacijama tokom nefrogeneze. BioRxiv. https://doi.org/https://doi.org/10.1101/2020.09.16.300293

Barber, RD, Harmer, DW, Coleman, RA i Clark, BJ (2005). GAPDH kao gen za održavanje kućanstva: Analiza ekspresije GAPDH mRNA u panelu od 72 ljudska tkiva. Physiological Genomics. https://doi.org/10.1152/physiolgenomics.00025.2005

Bartel, DP (2009). MicroRNA prepoznavanje ciljeva i regulatorne funkcije. Cell, 136(2), 215–233. https://doi.org/10.1016/j.cell.2009.01.002.MicroRNA

Bertram, JF, Douglas-Denton, RN, Diouf, B., Hughson, MD, & Hoy, WE (2011). Broj ljudskih nefrona: implikacije na zdravlje i bolest. Pedijatrijska nefrologija, 26(9), 1529–1533. https://doi.org/10.1007/s00467-011-1843-8

Boleu, N., Kundaje, A., Bickel, PJ, & Li, Q. (2015). Stopa neponovljivog otkrivanja (2.0.3). https://github.com/nboley/idr

Bouchard, M., Souabni, A., Mandler, M., Neubüser, A., & Busslinger, M. (2002). Specifikacija nefričke loze od strane Pax2 i Pax8. Geni i razvoj. https://doi.org/10.1101/gad.240102

..............

Od: Journal Pre-proof

2021. Objavio Elsevier Inc.