Karakterizacija kafeoilhinskih kiselina iz Lepisorus Thunbergianus i njihova aktivnost inhibicije melanogeneze

Kontakt: Audrey Hu Whatsapp/hp: 0086 13880143964 Email:audrey.hu@wecistanche.com

Hak Hyun Kim, Jae Kwon Kim, Jaehyun Kim, Se-Hui Jung,* i Kooyeon Lee*

SAŽETAK:Hiperpigmentacija koja je rezultat prekomjerne aktivacije tirozinaze dovodi do tamnijih mrlja ili mrlja na ljudskoj koži. Iako su ovi fenomeni bezopasni, još uvijek postoji velika potražnja za inhibitorima melanogeneze kako bi se spriječila hiperpigmentacija inhibicijom tirozinaze, enzima koji ograničava brzinu u melanogenezi. Iako se Lepisorus thunbergianus koristio u narodnoj medicini kao diuretik i hemostatski agens, njegov učinak na melanogenezu još nije prijavljen. U ovoj studiji smo pripremili ekstrakt L.thunbergianus i njegove frakcije rastvarača i procijenili njihovu biološku aktivnost protiv sinteze slobodnih radikala i melanina. Ekstrakt L. thunbergianus inhibira aktivnost tirozinaze gljiva efikasnije nego, i sa sličnim antioksidativnim djelovanjem kao, arbutin in vitro. Komparativna procjena anti-melanogeneze i anti-tirozinazne aktivnosti frakcija rastvarača L. thunbergianus pokazala je da, inhibicijom aktivnosti tirozinaze, frakcija butanola ima najveći potencijal za inhibiciju melanogeneze u stanicama melanoma. Strukturnom analizom pomoću tečne hromatografije visokih performansi (HPLC) i NMR spektroskopije utvrdili smo da su glavna jedinjenja u frakciji butanola tri derivata kafeoilkinske kiseline. Tri derivata su imala slične aktivnosti uklanjanja radikala i anti-tirozinaze in vitro, dok je samo 5-kafeoilkinska kiselina imala inhibitorni efekat na -MSH-indukovanu melanogenezu. Inhibicijski efekat 5-kafeoilkinske kiseline je potvrđen određivanjem sadržaja melanina i tirozinaseaktivnosti u melanomu nakon tretiranja ćelija komercijalnim jedinjenjem. Nadalje, otkrili smo da 5-kafeoilkinska kiselina inhibira melanogenezu helirajući bakrov katjon iz kompleksa bakar-tirozinaza. Prema tome, 5-kafeoilkinska kiselina ili butanol frakcija izolovani iz L. thunbergianus mogu biti korisni u kozmetici kao sredstvo za izbjeljivanje kože.

Cistanche tubulosa: sredstvo za izbjeljivanje kože.

UVOD

Melanin, grupa prirodnih pigmenata koji se nalazi u većini organizama, igra važnu ulogu u posmeđivanju voća, gljivica i povrća i pigmentaciji na ljudskoj koži.1 Melanin se proizvodi od aminokiseline tirozina kroz proces u više koraka koji uključuje enzimsku oksidaciju i polimerizaciju. 2 Kod ljudi, pigment melanina sintetiziraju specijalizirani melanociti dendritičnih stanica smješteni na spoju između epiderme i dermisa u kojima se sinteza pokreće izlaganjem ultraljubičastim (UV) zracima.3 Pigment melanina se transportuje do keratinocita kako bi zaštitio kožu od UV zraka i slobodnih radikala; stoga je boja kože određena uzorkom raspodjele pigmenta melanina.2 Disregulacija sinteze melanina dovodi do mnogih oblika hiperpigmentacije, kao što su melazma, pjege, staračke pjege, solarni lentigo, postinflamatorna hiperpigmentacija i drugi hiperpigmentacijski sindromi.4 Više od stotine proteina je povezano sa sintezom tomelanina, a među njima je tirozinaza enzim koji ograničava brzinu za koji se smatra da je odgovoran za sintezu formelanina.5 Stoga je većina istraživačkih radova na prevenciji hiperpigmentacije fokusirana na identifikaciju, izolaciju, sintezu i karakterizaciju novih moćnih inhibitori tirozinaze za prevenciju melanogeneze.1,6 Brojni inhibitori tirozinaze, kao što su kojična kiselina, arbutin, hidrokinon, azelainska kiselina, elaginska kiselina i traneksamska kiselina, popularno su korišćeni u kozmetičkoj industriji kao agensi protiv melanogeneze; međutim, zbog ograničenja hemijskih lijekova, koja uključuju citotoksičnost i nuspojave, još uvijek postoji potražnja za novim materijalima s poboljšanom bezbednošću, stabilnošću i efikasnošću.7

Prirodni proizvodi, uključujući biljke, bakterije i gljive, postali su alternativni izvori za otkrivanje efikasnih sastojaka za izbjeljivanje kože zbog njihove manje toksičnosti i bolje biokompatibilnosti i bioraspoloživosti.1,8 Lepisorus thunbergianusis je paprat iz porodice Polypodiaceae, koja raste vezana za stare stijene. ili kora drveća i rasprostranjena je u umjerenim regijama istočne Azije, kao što su Koreja, Japan, Kina, Filipini i Indokina. L. thunbergianus se koristio kao adiuretik, hemostatsko sredstvo i antitusik u korejskim narodnim lijekovima. Prethodne studije su objavile da L. thunbergianusextract ima lokalnu antilipidnu peroksidacijsku aktivnost u lokalnoj i antioksidativnoj aktivnosti.9 Nadalje, ekstrakt L. thunbergianus pokazao je značajnu inhibiciju rasta zavisnu od koncentracije u ćelijama raka usne šupljine i raka debelog crijeva.10 Ekstrakt L. thunbergianus može imati potencijalnu primjenu u kozmetičkoj industriji jer ova biljka sadrži razne flavonoidne jedinjenja i brojne bioaktivne molekule, među kojima su kvercetin 3-metil eter-glukozid, viteksin, orijentalni, periodični-glukozid, izoviteksin, orijentin, Corentin i kafeoilkinična kiselina, međutim, efekti 9a. Sinteza ekstrakta L. thunbergianus o sintezi melanina u melanocitima tek treba biti razjašnjena.

Slika 1. Analiza ekstrakta L. thunbergianus za (A) uklanjanje radikala ABTS, (B) anti-tirozinazu i (C) intracelularne aktivnosti čišćenja ROS

U ovoj studiji smo pripremili ekstrakt L. thunbergianus i njegove frakcije otapala putem serijskog frakcioniranja i istražili inhibitorne efekte frakcija rastvarača na biosintezu melanina u stanicama melanoma B16F10. Identifikovali smo frakciju butanola (n-BuOH) kao glavni deo koji sadrži prirodni inhibitor i dalje karakterisali efekte derivata kafeoilkinske kiseline izolovanih iz ekstrakata L. thunbergianus na inhibiciju biosinteze melanina.

cistanche recenzija: antioksidacija

REZULTATI I DISKUSIJA

Etanol ekstrakt L. thunbergianus čisti radikal 2,2′-Azinobis(3-etil-benzotiazolin-6-sulfonske kiseline (ABTS) i inhibira aktivnost tirozinaze).

Ekstrakcija L. thunbergianus sa 70 posto etanola (EtOH) je obavljen kako bi se procijenila potencijalna inhibitorna aktivnost prirodnih spojeva u biljci. Aktivnost uklanjanja radikala ekstrakta L.thunbergianus određena je u rasponu koncentracija od 2-200 ug/mL. Ekstrakt etanola pokazao je aktivnost uklanjanja radikala ovisno o koncentraciji s maksimalnim učinkom pri 50 ug/mL, pri čemu je rezultat bio konzistentan sa onim arbutina korištenog kao pozitivna kontrola (Slika 1A).

Takođe smo procenili inhibitorni efekat ekstrakta na aktivnost tirozinaze gljive merenjem brzine sinteze dopahroma katalizovane tirozinazom. Etanoekstrakt je inhibirao 87 posto aktivnosti tirozinaze pri 500 ug/mL, dok je arbutin inhibirao samo 38 posto aktivnosti tirozinaze pri istoj koncentraciji (slika 1B). Zatim smo procijenili aktivnost uklanjanja ekstrakta na intracelularni ROS povećan za 100 μM vodikovog peroksida. Tretman vodonik peroksidom je inducirao približno 2.1-puta povećanja intracelularnog nivoa ROS ćelija B16F10 (Slika 1C). Otkrili smo da je povećanje intracelularnog ROS-a posredovano hidrogen peroksidom uklonjeno ekstraktom na način ovisan o dozi: maksimalna aktivnost uklanjanja pri 100 ug/mL bila je 78 posto (slika 1C). Ovi rezultati sugeriraju da etanolni ekstrakt L. thunbergianus sadrži bioaktivne sastojke koji inhibiraju aktivnost tirozinaze, kao i uklanjaju ABTS radikale i intracelularne ROS.

ekstrakt cistanche deserticola: inhibira aktivnost tirozinaze.

Inhibicijski potencijal frakcija L. thunbergianus protiv melanogeneze.

A crude EtOH extract was fractionated with various solvents including hexane (Hex), methylene chloride (CH2Cl2), ethyl acetate (EtOAc), and butanol to identify and characterize ingredients inhibiting melanogenesis. To identify which solvent fractions have the potential against melanin synthesis, we performed a comparative analysis of four different L. thunbergianus solvent fractions for the radical scavenging and anti-tyrosinase activities. First, to evaluate the antioxidant activity of the four solvent fractions of the L. thunbergianus extract, we determined the ABTS radical scavenging activities in the concentration range of 2−200 μg/ mL. All fractions showed a concentration-dependent increase in ABTS radical scavenging activity (Figure 2A). In particular, EtOAc and n-BuOH fractions completely scavenged the ABTS radical at a 50 μg/mL concentration. The ABTS radical scavenging activity was in the order of n-BuOH > EtOAc >CH2Cl2 > Hex, što je u skladu s prethodnim izvještajem.10b Nadalje, inhibitorni efekti različitih frakcija rastvarača na aktivnost tirozinaze su se povećali na način koji ovisi o koncentraciji: maksimalne inhibitorne aktivnosti frakcija n-Hex i CH2Cl2 bile su ispod 65 posto, ali one EtOAc i n-BuOH frakcije su bile iznad 70 posto (slika 2B). Inhibicijska aktivnost je bila reda n-BuOH > EtOAc > CH2Cl2 > n-Hex. Ovi rezultati sugeriraju da je više hidrofilnih frakcija, uključujući n-BuOH i EtOAc frakcije, pokazalo veću aktivnost uklanjanja radikala i bolju inhibitornu aktivnost od lipofilnih n-Hex i CH2Cl2 frakcija .

Zatim su istraženi efekti frakcija rastvarača L. thunbergianus na proliferaciju ćelija melanoma tretiranjem B16F10 ćelija sa 200 ug/mL svake od različitih frakcija ili 2mg/mL arbutina u prisustvo -melanocit-stimulirajućeg hormona (-MSH), za koji je dobro poznato da promoviše melanogenezu kroz indukciju transkripcionog faktora povezanog sa mikroftalmijom (MITF).11 Rezultati su pokazali da nijedna od frakcija nije imala značajan uticaj na proliferaciju ćelija melanoma (Slika 2C). Zatim smo istražili inhibitorni učinak frakcija rastvarača na melanogenezu stimuliranu -MSH u stanicama melanoma. Tretman -MSH inducirao je približno 2.{13}}puta povećanja intracelularnog sadržaja melanina u B16F10 ćelijama (slika 2D). Otkrili smo da je melanogeneza posredovana -MSH bila potpuno inhibirana frakcijom n-BuOH (p < 0,01)="" i="" djelomično="" inhibirana="" etoacfrakcijom="" (40="" posto,="" p="">< 0,01),="" dok="" -msh="" posredovana="" melanogeneza="" nije="" značajno="" promijenjena="" n-hex="" i="" ch2cl2="" frakcije="" (slika="" 2d).="" nadalje,="" utvrđeni="" su="" inhibitorni="" efekti="" frakcija="" rastvarača="" na="" aktivaciju="" tirozinaze="" posredovane="" -msh="" jer="" tirozinaza="" igra="" ključnu="" ulogu="" u="" melanogenezi.="" n-buoh="" (95="" posto,="" p="">< 0,001)="" i="" etoac="" (66="" posto,="" p="">< 0,001)="" frakcije="" reverzne="" aktivacije="" tirozine="" pomoću="" -msh,="" dok="" frakcije="" n-hex="" i="" ch2cl2="" nisu,="" kao="" što="" je="" prikazano="" na="" slici="" 2e.="" štaviše,="" efekat="" čišćenja="" različitih="" frakcija="" rastvarača="" na="" povećanje="" intracelularnog="" ros-a="" stimulisan="" je="" hidrogen="" peroksidom.="" sve="" frakcije="" rastvarača="" preokrenule="" su="" intracelularno="" povećanje="" ros="" posredovano="" vodonik="" peroksidom,="" kao="" što="" je="" prikazano="" na="" slici="" 2f.="" ovi="" rezultati="" pokazuju="" da="" je="" buoh="" frakcija="" l.="" thunbergianus="" inhibirala="" -msh-indukovanu="" sintezu="" melanina="" inhibirajući="" intracelularnu="" aktivnost="" tirozinaze="" u="" b16f10="" ćelijama.="" nadalje,="" ovi="" rezultati="" sugeriraju="" da="" su="" bioaktivni="" sastojci="" koji="" inhibiraju="" sintezu="" melanina="" bili="" hidrofilni="" i="" da="" su="" uglavnom="" pronađeni="" u="" frakciji="">

Slika 2. Efekti frakcija rastvarača na ABTS radikalno čišćenje, anti-tirozinazu i antimelanogenezu.

Identifikacija i karakterizacija bioaktivnih spojeva ekstrakta L. thunbergianus.

Za identifikaciju i karakterizaciju sastojaka koji inhibiraju melanogenezu, izvršena je analiza tečne hromatografije visokih performansi (HPLC) za sve frakcije otapala. HPLC analiza frakcija rastvarača otkrila je da sve frakcije sadrže tri glavna jedinjenja u retencionim vremenima od 21, 28 i 29 min za jedinjenja 1, 2 i 3, respektivno (Slika 3A-D). Ova tri glavna jedinjenja su dalje izolovana preparativnim HPLC prečišćavanjem. Količine tri glavna jedinjenja u frakciji n-BuOH određene su korišćenjem komercijalnih derivata kafeoilkinske kiseline kao internih standardnih molekula, prema prethodnom izveštaju.12

Izolovana jedinjenja su zatim identifikovana poređenjem njihovih 1H i 13C NMR podataka sa literaturom i utvrđeno je da se slažu sa predloženim strukturama (Slika 4).13 Slika 3E prikazuje molekularnu strukturu tri jedinjenja. Jedinjenje 1 (prinos, 3,2 ± 0.1 mg/100 mg n BuOH frakcije) je dobijeno kao blijedo žuti prah. 1HNMR (400 MHz, DMSO-d6) δ 9,66 (1H, brs), 9,20 (1H, brs), 7,49 (1H, d, J=15},9 Hz), 7,04 (1H, s), 6,99 ( 1H, d, J=8.2Hz), 6.78 (1H, d, J=8.1 Hz), 6.23 (1H, d, J=15.9 Hz), 5.20( 1H, m), 5,08 (1H, brs), 4,89 (1H, brs) 4,13 (1H, m), 3,84 (1H, m), 3,56 (1H, s), 3,35 (1H, s), 1,99 (1H, m), m), 1,92 (1H, m), 1,89 (1H, m), 1,79 (1H, m). 13C{1H} NMR (100 MHz, DMSO-d6) δ (176.42, 168.10, 148.14, 145.53, 144.75, 125.65, 121.07, 115.75, 114.47, 114.72, 114.472, 114.72, 114.472, 114.47 . Jedinjenje 1 je identifikovano kao 3-kafeoilkinska kiselina NMR analizom i poređenjem sa prethodnom literaturom.13b

Jedinjenje 2 (prinos, 14,1 ± 0.1 mg/100 mg frakcije n-BuOH) je dobijeno kao blijedo žuti prah. 1H NMR (400MHz, DMSO-d6) δ 9,64 (1H, brs), 9,20 (1H, brs), 7,52 (1H,d, J=15},9 Hz), 7,06 (1H, s), 7,02 ( 1H, d, J=8.1 Hz) 6.79(1H, d, J=7.9 Hz), 6.30 (1H, d, J=15.9 Hz), 4.85 ( 1H, brs),4,70 (1H, d, J=4,9 Hz), 4,12 (1H, brs), 3,95 (1H, m), 1,97 (2H, m), 1,88 (1H, m), 1,83 (1H, m). 13C{1H} NMR (100MHz, DMSO-d6) δ (176.02, 166.27, 148.28, 145.55, 144.77,125.54, 121.19, 115.76, 114.46, 76.76, 114.46, 114.46, 76, 76, 76, 76, 76, 76, 76, 73 Jedinjenje 2 je identificirano kao 5-kafeoilkinska kiselina NMR analizom i poređenjem sa prethodnom literaturom.13c

Jedinjenje 3 (prinos, 3,9 ± 0.2 mg/100 mg n-BuOH frakcije) je dobijeno kao blijedo žuti prah. 1H NMR (400MHz, DMSO-d6) δ 9,64 (1H, brs), 9,20 (1H, brs), 7,52 (1H,d, J=15},9 Hz), 7,06 (1H, s), 7,02 ( 1H, d, J=8.1 Hz) 6.79(1H, d, J=7.9 Hz), 6.30 (1H, d, J=15.9 Hz), 4.85 ( 1H, brs),4,70 (1H, d, J=4,9 Hz), 4,12 (1H, brs), 3,95 (1H, m), 1,97 (2H, m), 1,88 (1H, m), 1,83 (1H, m). 13C{1H} NMR (100MHz, DMSO-d6) δ (176.02, 166.27, 148.28, 145.55, 144.77,125.54, 121.19, 115.76, 114.46, 76.76, 114.46, 114.46, 76, 76, 76, 76, 76, 76, 76, 73 Jedinjenje 3 je identificirano kao 4-kafeoilkinska kiselina NMR analizom i poređenjem sa prethodnom literaturom.13a

Slika 3. HPLC hromatogrami (A) n-Hex, (B) CH2Cl2, (C) EtOAc i (D) n-BuOH frakcija L. thunbergianus i (E) strukture tri glavna jedinjenja.

Inhibicijski potencijal derivata kafeoilkinske kiseline izolovanih iz L. thunbergianus protiv melanogeneze.

Zatim, da bismo identificirali biološki aktivni sastojak koji leži u osnovi moćne antimelanogeneze, odredili smo inhibitornu aktivnost tri derivata kafeoilkinske kiseline izolovane iz L. thunbergianus protiv sinteze melanina u stanicama melanoma. Prvo su istraženi efekti tri derivata na uklanjanje radikala ABTS. Rezultati su pokazali da tri derivata imaju slične aktivnosti uklanjanja radikala ABTS (Slika 5A). Zatim smo istražili inhibitorni učinak tri derivata izolirana iz aktivnosti ontirozinaze L. thunbergianus. Tri derivata su pokazala koncentracijsko zavisnu inhibiciju aktivnosti tirozinaze, uz maksimalnu inhibiciju pri koncentraciji od 200 μM (Slika 5B). Nadalje, istražili smo inhibitorni efekat tri derivata na sintezu melanina indukovanu -MSH u B16F10 ćelijama. Tretman -MSH indukovao je približno 20-puta povećanja intracelularnog sadržaja melanina u B16F10 ćelijama (slika 5C). Zanimljivo je da jedinjenja 1 (3-kafeoilkinska kiselina) i 3 (4-kafeoilkinska kiselina) značajno povećavaju sintezu melanina za 25 odnosno 23 posto (slika 5C, str.< 0.001),="" while="" compound="" 2="" (5-caffeoylquinic="" acid)="" completely="" reversed="" α-msh-induced="" melanogenesis="" (p="" <="" 0.001).="" these="" results="" suggest="" that="" the="" three="" caffeoylquinic="" acid="" derivatives="" with="" similar="" structures="" but="" different="" substitution="" sites="" have="" different="" biological="" activities="" on="" melanogenesis.="" furthermore,="" 5-caffeoylquinic="" acid="" has="" potent="" inhibitory="" activity="" against="">

Slika 4. 1H NMR spektri (A) 3- kofeoilkinske kiseline, (B) 4- kofeoilkinske kiseline i (C) 5- kofeoilkinske kiseline i 13C NMR spektri (D) {{ 6}}kafeoilkinska kiselina, (E) 4-kafeoilkinska kiselina i (F) 5-kafeoilkinska kiselina

Provjera efikasnosti protiv melanogeneze 5-kafeoilkinske kiseline.

Da bismo potvrdili inhibitorni efekat {{0}}kafeoilhinske kiseline na melanogenezu, utvrdili smo inhibicijski efekat komercijalne 5-kofeoilhinske kiseline na sintezu melanina posredovanu -MSH. Tretman sa nižim koncentracijama 0.1 i 0.2 mM 5-kafeoilkinične kiseline blago je povećao sintezu melanina i aktivnost intracelularne tirozinaze, dok su veće koncentracije od 0,5 i 1 mm jedinjenja preokrenule melanogenezu posredovanu MSH i aktivnost intracelularne tirozinaze (Slika 6A, B) u kojoj su rezultati u skladu s prethodnim izvještajem.14

Kafeoilkinska kiselina je fenolni spoj formiran esterskom vezom između kofeinske kiseline i L-hinske kiseline. Poznato je da derivati ​​kafeoilkinske kiseline imaju antimelanogenezu i antitirozinazno djelovanje, kao i aktivnost uklanjanja ROS. Tirozinaza je multifunkcionalni metaloenzim koji sadrži bakar i ima katjone dvovalentnog bakra.1 Derivati ​​kofeoilkinske kiseline mogu inhibirati tirozinaseaktivnost keliranjem katjona bakra odgovornog za održavanje aktivnog stanja tirozinaze. Da bi se predvidjela interakcija između 5-kafeoilkinske kiseline i tirozinaze, izvršena je kompjuterska molekularna studija spajanja pomoću Maestroprograma. Najbolja poza za jedinjenje, usidrenu totirozinazu, prikazana je na slici 6C, D. Studija molekularnog spajanja otkrila je da 5-kafeoilkinska kiselina interaguje sa bakrom na udaljenosti od 2,43 Å i uspostavlja seriju π−π slaganja sa His 259, Asn 260, His 85 i His 263 ostaci i H-veza sa Arg 268. Nadalje, energija vezivanja između tirozinaze i 5-kafeoilkinske kiseline bila je −4,425 kJ/mol. Ovi rezultati pokazuju da 5-kafeoilhinska kiselina može inhibirati aktivnost tirozinaze helacijom bakra. Da bismo potvrdili inhibitorni mehanizam melanogeneze 5-kafeoilkinske kiseline, odredili smo sposobnost heliranja bakra 5-kafeoilkinske kiseline. Sposobnost heliranja bakra 5-kafeoilkinske kiseline povećana je na način koji zavisi od koncentracije (slika 6E). Ovaj rezultat sugerira da 5-kafeoilkvinska kiselina inhibira sintezu melanina putem keliranja bakarnog katjona koji je u interakciji sa tirozinazom.

Slika 5. Efekti tri derivata kafeoilkinske kiseline na uklanjanje radikala, in vitro aktivnost anti-tirozinaze i antimelanogeneze u B16F10 ćelijama.

MATERIJALI I METODE

Materijali

L. thunbergianus je kupljen na internetskom tržištu www.jirisangol.com (Koreja) i osušen u ambijentalnim uslovima prije upotrebe u ovoj studiji. Reagensi, kao što su 2,2′- cink bis(3-etil-benzotiazolin-6-sulfonska kiselina (ABTS) i 3-(4,5-dimetiltiazol-2- yl)-2,5-difeniltetrazolijum bromid (MTT), hormon koji stimuliše melanocite (-MSH), i enzimi, kao što je tirozinaza pečuraka, dobijeni su od Sigma-Aldrich (St. Louis, MO, SAD). Kalijumpersulfat (K2S2O8), pirokatehol ljubičasta i 3,4-dihidroksi-L fenilalanin (L-DOPA) kupljeni su od Alfa Aesar (Haverhill, MA, SAD).

Ekstrakcija i frakcionisanje L. thunbergianus.

Osušeni L. thunbergianus (80 g) je usitnjen u prah pomoću mašine za mljevenje (HBL-3500S, Samyang Electronics, Koreja) i ekstrahiran sa 7{30}} posto EtOH tri puta (800 mL, svaki put ) na 70 stepeni 3 dana. Dobiveni ekstrakt je vakuumski filtriran korištenjem Advantecfilter papira br. 1 i 2 (Toyo Roshi Kaisha, Ltd., Tokio, Japan) i koncentriran korištenjem Hei-Vap Advantage rotacionog isparivača (Heidolph, Njemačka) da se dobije 17,2 g EtOH sirovog ekstrakta. Ovaj sirovi ekstrakt je suspendovan u dH2O (180 mL) i sukcesivno frakcionisan sa Hex, CH2Cl2, EtOAc i n-BuOH da bi se dobio Hex (1,51 g, 8,8 procenata), CH2Cl2 (0,88 g, 5,1 procenat), EtOAc, 3,90 g. procenat ), i n-BuOH (3,02 g, 17,6 procenata), kao što je prethodno opisano.15 Dobijeni ekstrakti i frakcije su osušeni zamrzavanjem i uskladišteni na -80 stepeni pre upotrebe.

Određivanje aktivnosti uklanjanja slobodnih radikala ABTS.

Da bi se procijenila antioksidativna aktivnost ekstrakta L.thunbergianus i njegovih frakcija rastvarača, određena je aktivnost čišćenja ABTSradical, kao što je prethodno opisano.16 Da bi se stvorio ABTS radikal, 10 mL od 7 mMABTS je pomiješan sa 176 μL 140 mM kalijumperoksi disulfat u dH2O i inkubiran u mraku na sobnoj temperaturi (RT) 16 h prije upotrebe. Otopina ABTS radikala je razrijeđena apsolutnim metanolom da bi se dobila anabsorbanca od blizu 0,7 na 734 nm. Alikvoti od 100 μL svakog ekstrakta ili frakcija u naznačenom rasponu koncentracija od 2-200 ug/mL dodani su u 100 μL razrijeđene otopine ABTS radikala i inkubirani 10 minuta u mraku na sobnoj temperaturi. Apsorbanca je zatim izmjerena na 732 nm pomoću SpectraMaxM5 multimodnog čitača mikroploča (Molecular Devices, Sunnyvale, Kalifornija, SAD). Aktivnost uklanjanja radikala ABTS izračunata je na sljedeći način

Aktivnost uklanjanja radikala ABTS (procenti) =1−(Asample/Acontrol)×100 (1)

In vitro inhibicija tirozinaze.

Inhibicijski učinak ekstrakata L.thunbergianus i njegovih frakcija rastvarača na tirozinaseaktivnost procijenjen je količinom dopahroma sintetizirane katalitičkom reakcijom tirozinaze.2a,17 Ukratko, 50 μL svakog ekstrakta ili frakcije u naznačenom rasponu koncentracija pomiješano je sa 50 μL od 50 μL U/mL tirozinaza pečurki u 50 mM fosfatnim puferom slane otopine (PBS; 8,1 mM Na2HPO4, 1,2 mM KH2PO4, pH 6,8, 2,7 mMKCl i 138 mM NaCl) u pločici sa {{20 RT 3 jažicom i u min. Zatim je u svaku jažicu dodato 100 μL 1 mM L-DOPA, nakon čega je uslijedila inkubacija dodatnih 10 minuta na 37 stepeni. Apsorbancija rezultirajućeg rastvora je izmerena na 475 nm korišćenjem SpectraMax M5 multimodnog čitača mikroploča.

Cell Culture.

B16F10 ćelije mišjeg melanoma uzgajane su u Dulbecco-ovom modificiranom Eagleovom mediju (DMEM) (Gibco,Gaithersburg, SAD) sa dodatkom 10 posto fetalnog goveđeg seruma inaktiviranog toplinom (Gibco), 100 jedinica/mL penicilina i 100 ugbkocina na stepenu (Gibco) pod vlažnim 5 posto CO2.

Cell Viability.

Vijabilnost ćelija B16F10 određena je korišćenjem MTT testa, kao što je prethodno opisano.18 Ukratko, ćelije B16F10 su zasijane u 24-ploče sa gustinom od 1 × 104 ćelije po jažici. Nakon 24 h, ćelije su tretirane naznačenim koncentracijama ekstrakta ili frakcija L. thunbergianus 48 h. Ćelije su zatim inkubirane sa MTT rastvorom 4 h, a redukovani kristali formazana su rastvoreni u DMSO. Dobijeni rastvor je prebačen na 96-ploče sa jažicom, a apsorpcija je izmerena na 540 nm korišćenjem SpectraMax M5 multimodnog čitača mikroploča.

Određivanje intracelularnih reaktivnih vrsta kiseonika (ROS).

Intracelularni nivo ROS-a mjeren je pomoću DCF/H2DCFDA ćelijskog ROS testnog kompleta (ab113851,Abcam), prema uputama proizvođača. Ukratko, B16F10 ćelije su zasijane u 48-ploče sa gustinom od 2 × 104 ćelije po jažici. Nakon 24 h kulture, ćelije su tretirane 1 h sa naznačenim koncentracijama ekstrakta L. thunbergianus ili frakcija rastvarača u mediju kulture koji sadrži 0,1 posto goveđeg serumskog albumina (BSA) bez fenol crvenog. Ćelije su zatim inkubirane sa 100 μM vodikovog peroksida 30 min. Nakon ispiranja sa PBS, ćelije su tretirane sa 25 μMH2DCFDA u PBS-u 45 min. Nivo ROS je analiziran čitačem mikroploče (Synergy H1, Biotek, Vermont, USA) opremljenim fluorescentnim filterom na 485/545 nm (talasna dužina ekscitacije/emisije). Prosječni relativni intenzitet fluorescencije kontrole je izjednačen sa 100 posto, s tim da su uslovi tretmana izračunati proporcionalno.

Određivanje sadržaja melanina.

Sadržaj melanina je određen, kao što je prethodno opisano, uz neke modifikacije.19 Ćelije melanoma su uzgajane u ploči sa šest jažica 24 h. Tretirani su naznačenim koncentracijama ekstrakta L. thunbergianus ili njegovim frakcijama rastvarača narednih 48 h u prisustvu 100 nM -MSH. Nakon dva puta ispiranja ohlađenom Dulbecco-ovom fosfatnom puferiranom fiziološkom otopinom dopunjenom kalcijum hloridom i magnezijum hloridom (D-PBS). Gibco), rezultirajuće ćelije su odvojene inkubacijom sa rastvorom tripsina-EDTA. Nakon centrifugiranja na 1000 rpm tokom 3 min, ćelijski pelet je otopljen u 150 μL 1 M NaOH koji sadrži 10 posto DMSO tokom 1 h na 60 stepeni tokom 1 h. Sadržaj melanina određen je apsorbancijom na 405 nm pomoću čitača mikroploče.

Ekstrakt Cistanche inhibira melanin.

Određivanje aktivnosti ćelijske tirozinaze u ćelijama melanoma.

Aktivnost tirozinaze u ćelijama B16F10 ispitivana je na osnovu količine dopahroma proizvedenog katalitičkom reakcijom intracelularne tirozinaze.20 Ukratko, ćelije melanoma su kultivisane u ploči sa šest jažica 24 h, nakon čega je tretiran različitim koncentracijama ekstrakta L.thunbergianus ili njegovog rastvarača. frakcije za još 48 u prisustvu 100 nM -MSH. Nakon dva puta ispiranja ledeno hladnim D-PBS, ćelije su lizirane u 200 μL pufera za radioimunoprecipitacijski test (RIPA) (Sigma-Aldrich) koji sadrži inhibitore proteaze i fosfataze. Nakon centrifugiranja ćelijskog lizata sakupljenog iz svake jažice na 15,000g tokom 15 minuta, 100 μL supernatanta je pomiješano sa 100 μL 1 mM L-DOPA u PBS (pH 6,8) nakon čega je uslijedila inkubacija 30 minuta na 37 stepeni . Apsorbancija dopahroma je izmjerena na 475 nm pomoću čitača mikroploče. Podaci su normalizirani koncentracijom proteina određenom testom bicinhoninske kiseline.

Izolacija i karakterizacija bioaktivnih jedinjenja pomoću HPLC.

HPLC je izveden na YL{{0}} (Young Lin Instrument, Koreja), opremljen sa TC-C18 kolonom (4,6 mm, 250 mm, i 5 μm, Agilent, SAD), inkonjukcija sa gradijentnim sistemom koji se sastoji od rastvarača A (0.2 posto mravlje kiseline) i rastvarača B (MeOH). Omjer rastvarača nagiba je postavljen na 0−5 min, 15 posto B; 5−10 min, 15−20 posto B; 10−15 min, 20−30 posto B; 15−30 min, 30−40 posto B; 30−37 min, 40−60 posto B; 37−40 min, 60−100 posto B; 40−45 min, 100 posto B; 45−50 min, 100−15 posto B; i 50-55 min, 15 posto B. Da bi se identifikovali sastojci u frakcijama rastvarača, mobilna faza je isporučena brzinom protoka od 1 mL/min, a detekcija eluiranja je sprovedena na 330 nm. Za prikupljanje insolventnih frakcija bioaktivnih sastojaka, mobilna faza je isporučena brzinom protoka od 15,0 mL/min, a detekcija eluiranja je izvedena na 330 nm pomoću prep-HPLC (YL-9100 s, Young Lin Instrument, Koreja ), opremljen prep-C18 kolonom (4,6 mm, 212 mm, 10 μm, Agilent, SAD), u kombinaciji sa gradijentnim sistemom koji se sastoji od rastvarača A (0,2 posto mravlje kiseline) i rastvarača B (MeOH). Omjer rastvarača nagiba je postavljen na 0-10 min, 10 posto B; 10-20 min, 10-15 posto B; 20−40 min, 15 posto B; 40−60 min, 15−20 posto B; i 60−70 min, 30 posto B.

Molecular Modeling.

Kristalna struktura gljivatirozinaze za molekularno modeliranje bila je Agaricustyrosinase (PDB radi: 2Y9X) dobijena iz Protein DataBank (PDB). Enzim je pripremljen korištenjem procesa pripreme proteina koji je ugrađen u Maestroprogram (Maestro, verzija 11.9.011, Schrödinger, LLC, NewYork, NY, SAD, 2019.). Voda i svi ostali molekuli prisutni u PDB datotekama su uklonjeni. Molekularno spajanje obavljeno je korištenjem protokola za indukovano pristajanje (IFD) (Schrödinger Suite 2019 Induced Fit Docking protokol), kao što je ranije objavljeno.21

Sposobnost helatiranja bakra.

Sposobnost heliranja bakra jedinjenja izolovanih iz L. thunbergianus određena je prema prethodnom izvještaju.22 Svaki derivat kafeoilkinske kiseline (10 μL) u naznačenoj koncentraciji pomiješan je sa 280 μL 50 mM natrijum acetatnog pufera (pH 6.0). 6 μL 4 mM rastvora pirokatehol ljubičaste boje pripremljene u istom puferu i 10 μL 1 ug/μL CuSO4·5H2O. Nestanak plave boje je uočen mjerenjem apsorbancije na 632nm pomoću SpectraMax M5 multimodnog čitača mikroploča. Voda je korištena kao kontrola umjesto uzorka. Procenat aktivnosti heliranja bakra izračunat je iz apsorbancije na 632 nm, što je kako slijedi

Sposobnost heliranja bakra ( posto )=1− (Uzorak/kontrola)×100 (2)

Statistička analiza.

Svi podaci u ovoj studiji izraženi su kao srednja vrijednost ± standardna devijacija (SD) iz tri nezavisna eksperimenta. Statističke analize su obavljene korištenjem GraphPad Prism 8.0 (GraphPad Software Inc., La Jolla, Kalifornija, SAD). Razlike između srednjih vrijednosti kontrolne i izložene grupe analizirane su jednosmjernom analizom varijanse (ANOVA) praćeno Dunnettovim post hoktestom. Prag statističke značajnosti za sve analize bio je p < 0.05="">

ZAKLJUČCI

U ovoj studiji smo pokazali da ekstrakt L. thunbergianus uklanja ABTS radikale i pokazuje snažan inhibitorni efekat na biosintezu melanina bez značajne citotoksičnosti. Abioaktivni sastojak koji postoji u L. thunbergianus i inhibira melanogenezu izolovan je u frakciji n-BuOH. Nadalje, otkrili smo da su tri derivata kafeoilkinske kiseline glavna jedinjenja koja postoje u frakciji n-BuOH i da je 5-kafeoilkinska kiselina važan sastojak potiskujući melanogenezu u stanicama melanoma inhibiranjem ćelijske aktivnosti tirozinaze. Ovdje smo izolovali prirodni inhibitor jedinjenja 5-kafeoilhinsku kiselinu iz ekstrakta L.thunbergianus da bismo spriječili hiperpigmentaciju i otkrili njegov mehanizam inhibicije koji leži u osnovi melanogeneze. Stoga, naši nalazi sugeriraju da bi 5-kafeoilkinska kiselina i n-BuOH frakcija izolirana iz L. thunbergianus mogle biti korisne u kozmetici kao sredstva za izbjeljivanje kože.

cistanche kriške