sažetak:Prijavljeno je da korijeni vitis amurensis imaju potencijal za izbjeljivanje kože kroz procjenu aktivnosti melanogeneze i inhibicije tirozinaze. U ovoj studiji, korijeni V. amurensis su korišteni za brz odabir sastojaka za izbjeljivanje koristeći LC-Q-TOF-MS u kombinaciji sa testom inhibitora tirozinaze, i za optimizaciju procesa ekstrakcije za korištenje kao funkcionalni materijal za izbjeljivanje kože metodologijom površine odgovora. Rezultati su pokazali da korijeni V. amurensis pokazuju inhibitorne efekte tirozinaze pomoću dva stilbenska oligomera, ε-vinifere (1) i vitamina B (2), kako je predviđeno LC-Q-TOF-MS u kombinaciji sa biotestom. Optimalni uslovi ekstrakcije (koncentracija metanola 66 procenata, zapremina rastvarača 140 ml i vreme ekstrakcije 100 min) za sastojke za izbeljivanje kože utvrđeni su sa prinosom od 6,20 procenata, a inhibitorna aktivnost tirozinaze je bila 87,27 procenata. Odnos između svakog faktora i njegovog odgovarajućeg odgovora potvrđen je Pirsonovom korelacionom analizom. Zapremina rastvarača je pokazala jasnu linearnu vezu sa prinosima, a koncentracija metanola je imala jaku linearnu vezu sa inhibitornom aktivnošću tirozinaze za jedinjenja 1 i 2, kao i njihovu kombinaciju. Sve u svemu, dokazano je da LC-Q-TOF-MS zajedno sa biotestom ima potencijal da efikasno pronađe nove aktivne sastojke, kao i poznate aktivne sastojke; vitamini se mogu predložiti kao novi prirodni potencijal za izbjeljivanje.

Prema relevantnim studijama,cistancheje uobičajena biljka koja je poznata kao "čudotvorna biljka koja produžava život". Njegova glavna komponenta jecistanozid, koji ima različite efekte kao nprantioksidans, protuupalno, iunapređenje imunološke funkcije. Mehanizam između cistanche iizbjeljivanje koželeži u antioksidativnom dejstvu cistancheaglikozidi. Melanin u ljudskoj koži nastaje oksidacijom tirozina koju kataliziratirozinaza, a reakcija oksidacije zahtijeva učešće kisika, pa radikali bez kisika u tijelu postaju važan faktor koji utiče na proizvodnju melanina. Cistanche sadržicistanozid, koji je antioksidans i može smanjiti stvaranje slobodnih radikala u tijelu, čime inhibira proizvodnju melanina.

Kliknite na Cistanche Sold Near Me

Za više informacija:

david.deng@wecistanche.com WhatApp:86 13632399501

Ključne riječi:Vitis amurensis; LC-Q-TOF-MS u kombinaciji sa testom inhibitora tirozinaze; metodologija površine odgovora; Pearsonova korelacija

1. Uvod

Melanin je odgovoran za boju kože i dlake sisara i štiti kožu od ultraljubičastih zraka, ali prekomjerna proizvodnja melanina i nakupljanje melanina u koži uzrokuje hiperpigmentacijske poremećaje kože kao što su pjege, melazma, staračke pjege, efelidi i senilne lentigine. Tirozinaza, poznata kao enzim oksidaza koji sadrži bakar, ima ključnu ulogu u biosintezi melanina. Enzim je katalizirao dvije uzastopne reakcije oksidacije: prvi korak, hidroksilaciju L-tirozina u 3,4-dihidroksi-L-fenilalanin (L-DOPA), i drugi korak, oksidaciju L-DOPA do dopakinon. Dopakinon je visoko reaktivna supstanca koja može spontano polimerizirati i stvoriti melanin [1-3]. Stoga se inhibitori tirozinaze mogu koristiti kao tretmani za kožne poremećaje povezane s hiperpigmentacijom i kao sredstva za izbjeljivanje kože.

Vitis amurensis, divlja vrsta grožđa, uglavnom je rasprostranjena u Aziji (Koreja, Kina i Japan). Potpuno zreli plodovi konzumiraju se sirovi i sadrže obilje nutrijenata kao što su saharoza, glukoza, proteini i vitamini, pa se koriste kao materijal za vino, sokove, želee i džem. Osim toga, njeni listovi se koriste u salati [4]. Njegovo korijenje i stabljika koriste se kao tradicionalna medicina za liječenje raka, neuralgičnih bolova i bolova u trbuhu [5,6]. Njegovo korijenje se sastoji od stilbena (glavni sastojak), procijanidina, flflavonoida, triterpenoida i drugih fenolnih spojeva. Do sada je dovoljno detaljno proučavan hemijski sastav korijena. Konkretno, prijavljeni su različiti stilbenski oligomeri, uključujući resveratrol, amurensin A, vitamin A, ( plus )-ε-viniferu, amurensine C–M, ampelopsin A, D i ampelopsin E [6]. Metanolni ekstrakt korijena ispoljava antimelanogeno djelovanje protiv melanogeneze izazvane hormonom stimuliranog -melanocitima u B16F10 stanicama i u 3,4-dihidroksifenilalaninu (L-DOPA) oksidaciji putem tirozinaze gljiva [7]. Osim toga, ekstrakti V. amurensis i njihovi aktivni spojevi pokazuju antioksidativno, protuupalno, neuroprotektivno i antitumorogeno djelovanje [7–10].

LC-MS u kombinaciji sa biotestom može istovremeno potvrditi hemijski profil i biološku aktivnost komponenti u prirodnim proizvodima bez potrebe za ekstrakcijom i izolacijom. Stoga se nedavno koristio za efikasno i brzo prepoznavanje bioaktivnih spojeva u prirodnim proizvodima [11–13].

Optimizacija je proces koji omogućava maksimalnu efikasnost eksperimentalnih sistema ili proizvoda. Metodologija površine odgovora (RSM), multivarijantna analiza, dizajn eksperimenata korišćenjem matematičkih i statističkih tehnika zasnovanih na empirijskim modelima i izražavanje korelacije između dizajna eksperimenta i rezultata kao polinomska funkcija, neke su od tehnika koje obezbeđuju idealne uslove optimizacije uz maksimalnu efikasnost. RSM je precizan i efikasan metod optimizacije koji se široko koristi u različitim oblastima, uključujući preradu hrane, hemiju, biologiju i poljoprivredu [14–16]. Posljednjih desetljeća povećao se interes za farmaceutske proizvode, kozmetiku i funkcionalnu hranu koja sadrži prirodne proizvode; shodno tome, u akademskoj zajednici i industriji su u tijeku istraživanja s ciljem razvoja takvih proizvoda [17,18]. Prvi korak u ovim studijama uključuje ekstrakciju bioaktivnog sastojka iz prirodnih proizvoda. U ovom trenutku, budući da su brojni faktori kao što su vrijeme ekstrakcije, temperatura, omjer tekućine i krutine i volumen rastvarača utjecali na ekstrahirane sastojke, potrebna je optimizacija za ekstrakciju bioaktivnih sastojaka do maksimuma.

Prema našim saznanjima, rijetko su prijavljivani sastojci koji inhibiraju tirozinazu i optimizacija ekstrakata korijena V. amurensis [5,19]. Stoga je ova studija imala za cilj da brzo dobije inhibitor tirozinaze iz korijena V. amurensis koristeći LC-Q-TOF-MS u kombinaciji sa testom inhibitora tirozinaze i da optimizira uslove ekstrakcije za proširenje upotrebe korijena V. amurensis kao sredstva za izbjeljivanje kože od RSM.

2. Rezultati i diskusija

2.1. LC-QTOF MS u kombinaciji s testom inhibicije tirozinaze korištenjem ekstrakta korijena V. amurensis

Ekstrakt MeOH od 80 posto korijena V. amurensis pokazao je značajnu inhibitornu aktivnost tirozinaze (80,7 ± 0,8 posto pri 50 µg/mL, Tabela S1). Da bi se identifikovala jedinjenja koja inhibiraju tirozinazu u korenu V. amurensis bez izolacije, sprovedena je LC-QTOF-MS u kombinaciji sa testom inhibitora tirozinaze. Hemijski profil ekstrakta korijena V. amurensis dobijen je u prvom ciklusu (Slika S1), a bioaktivna jedinjenja su identificirana korištenjem testa inhibitora tirozinaze frakcija sakupljenih svakih 30 s iz druge serije (Slika 1). Postojala su dva pika između 19 i 22 min na masovnom hromatogramu za koje je predviđeno da imaju značajnu inhibitornu aktivnost tirozinaze, a njihove strukture su identifikovane kao stilben dimer (1) i stilben tetramer (2) korišćenjem hemijskog profilisanja (Tabela 1).

2.2. Identifikacija sastojaka korijena V. amurensis koji inhibiraju tirozinazu

Prvo su iz EtOAc frakcije izdvojena dva sastojka za koje se očekuje da imaju inhibitornu aktivnost tirozinaze i procijenjena je njihova bioaktivnost. Strukture izolovanih jedinjenja 1 i 2 su identifikovane kao ε-vinifera (1) [20,21] i vitamin B (-vinifera, 2) [21–23], respektivno, korišćenjem 1H-NMR, 13C-NMR i ESI-MS (slika 2, slike S2 ​​i S3 i tabela S2). U testu inhibitora tirozinaze, IC50 vrijednosti jedinjenja 1, 2 i kojične kiseline bile su 3,51, 10,74 i 27,09 µM, respektivno. Oba spoja su pokazala veće inhibitorne efekte tirozinaze od pozitivne kontrole, kojične kiseline koja je poznati sastojak za izbjeljivanje kože (Tabela 1 i Slika S4). U prethodnim studijama, prijavljeno je da ε-vinifera (1) ima inhibitornu aktivnost na tirozinazu [23]; međutim, vitamin B (2) je prvi put identifikovan u našoj studiji.

Sve u svemu, rezultati, u korelaciji sa predviđenim podacima LC-MS u kombinaciji sa testom inhibitora tirozinaze i vitaminom B (2), pokazuju potencijal kao novi inhibitor tirozinaze. Nadalje, provedene su studije molekularnog spajanja kako bi se podržao rezultat značajne inhibitorne aktivnosti dva stilbena oligomera na tirozinazu. Kao što je prikazano u Tabeli 1, jedinjenja 1 i 2 su pokazala veći rezultat pristajanja od pozitivne kontrole, kojične kiseline, što je u skladu s našim eksperimentalnim podacima. Međutim, rezultati spajanja spojeva bili su suprotni našim eksperimentalnim rezultatima. Načini interakcije jedinjenja 1 i 2 su opisani na slici 3. Jedinjenje 1 formiralo je 4 vodikove veze, 2 hidrofobne interakcije i 1 interakciju pi-lone para, a jedinjenje 2 formiralo je 11 vodoničnih veza, 7 hidrofobnih interakcija, 1 van der Waalsovu interakciju , i 3 interakcije pi-lone para. Kao rezultat toga, potvrđeno je da se spojevi mogu ubaciti u aktivno mjesto ciljnog proteina i vezati za katalitičke aminokiselinske ostatke koji mogu inhibirati aktivnost tirozinaze. Dodatno, ε-vinifera (1) je prijavljena kao kompetitivni inhibitor koji se vezuje za isto mjesto na kojem se L-DOPA vezuje za tirozinazu [23]. Uočeno je da se vitamin B (2) vezuje za isto mjesto kao ε-vinifera (1), što je potvrdilo da je vitamin B (2) novi kompetitivni inhibitor.

2.3. Optimizacija ekstrakcije korijena V. amurensis korištenjem RSM-a

Za korištenje korijena V. amurensis kao funkcionalnog materijala za izbjeljivanje kože, Box-Behnken dizajn (BBD) dizajnirao je optimalne uslove ekstrakcije kako bi se maksimizirao prinos ekstrakcije i aktivnost inhibitora tirozinaze. Efekti nezavisnih odgovora kao što su prinos ekstrakcije, inhibitorna aktivnost tirozinaze, količina jedinjenja 1, količina jedinjenja 2 i količina zbira jedinjenja 1 i 2, na tri nezavisne varijable (vrijeme ekstrakcije, koncentracija MeOH/vode i izmjerene su zapremine rastvarača (tabela 2). Raspon varijabli je postavljen kao vrijeme ekstrakcije (40, 70 i 100 min), koncentracija MeOH (40, 70 i 100 posto) i zapremina rastvarača ( 35, 87,5 i 140 mL) na osnovu preliminarnog eksperimenta sa jednim faktorom (podaci nisu prikazani). Vrijednosti dobivene iz dizajniranih eksperimenata izražene su kao polinomi korelacija između varijabli primjenom regresione analize (tablice S4–S13 i slika S5). Kao rezultat izvođenja individualne optimizacije za svaku reakciju (Tabela 3), očekivalo se da će prinos predstavljati 6,21 posto kada se ekstrahira sa 100.00 min, MeOH 64,78 posto, 140.{{42} } mL. Inhibiciona aktivnost tirozinaze ( posto ) ekstrahirana je sa 65,22 min, MeOH 100.00 posto, 140.00 mL uslovi, i predviđeno je da će pokazati vrijednost od 90,37 posto. Količina jedinjenja 1 na 65,74 min, MeOH 100.00 posto, 35,00 mL je predviđena kao 37,45 µg/mg, a količina jedinjenja 2 na 70,00 min, MeOH 70,00 posto i 92,24 mL je predviđen kao 86.77 µg/mg. Osim toga, očekivalo se da će ukupni sadržaj jedinjenja 1 i 2 pokazati maksimalnu vrijednost od 108,10 µg/mg kada se ekstrahira pod uslovima od 75,20 min, MeOH 100,00 posto i 35,00 mL. Eksperimenti zasnovani na optimizovanim uslovima dali su 6,19 ± 0,36 procenata, aktivnost inhibicije tirozinaze 91,72 ± 3,48 procenata, sadržaj jedinjenja 1 36,54 ± 1,78 µg/mg, sadržaj jedinjenja 2 85,74 ± 16,57 µm i su{8. Dobijeno je },10 ± 19,11 µg/mg, a pojedinačni odgovori za svaku varijablu su pokazali razliku od 5 posto ili manje od teorijski predviđenih vrijednosti. Optimizacija višestrukog odgovora je izvršena kako bi se maksimizirao prinos ekstrakcije i aktivnost inhibitora tirozinaze (Tabela 3). Optimizirani uslovi bili su sljedeći: vrijeme ekstrakcije 100 min; Koncentracija MeOH 66,38 posto; i zapremina rastvarača 140 mL. Koristeći ove uslove, utvrđeno je da je prinos 5,95 ± 1,13 procenata, a aktivnost inhibitora tirozinaze 85,93 ± 1,57 procenata; ove vrijednosti su bile slične predviđenim vrijednostima, 6,20 i 87,25 posto, respektivno. Dodatno, korelacija između svake varijable i odgovarajućeg odgovora je analizirana korištenjem Pearsonove korelacije (Tabela 4). Prinos ekstrakcije pokazao je jasnu linearnu vezu između vremena ekstrakcije i koncentracije MeOH i negativnu linearnu vezu sa količinom jedinjenja 1. Dodatno, aktivnost inhibitora tirozinaze pokazala je jak linearni odnos između količine jedinjenja 2 i količine sume jedinjenja 1 i 2 i jasnog linearnog odnosa sa jedinjenjem 1. Stoga je inhibitorna aktivnost korena V. amurensis na tirozinazu bila proporcionalna oba jedinjenja 1 i 2, ali je pokazala jači linearni odnos sa količinom jedinjenja 2 od jedinjenja 1.

3. Materijali i metode

3.1. Opće eksperimentalne procedure

Tekuća hromatografija srednjeg pritiska (MPLC) je sprovedena korišćenjem Biotage Isolere (Biotage AB, Upsala, Švedska). Jedan sistem je opremljen pumpom za fleš hromatografiju visokih performansi (HPFC), varijabilnim detektorom dvostruke talasne dužine i kolektorom. NMR spektri su dobijeni pomoću Bruker SPECTROSPIN 300 MHz spektrometra (Bruker Corporation, Billerica, MA, SAD). Metanol-d4, NMR rastvarač, kupljen je od Cambridge Isotop Laboratories, Inc. Acetonitril (ACN), voda i metanol (MeOH) hromatografskog kvaliteta kupljeni su od ThermoFisher Scientific Korea Ltd. (Seul, Republika Koreja). L-tirozin, tirozinaza gljiva, kojična kiselina i mravlja kiselina kupljeni su od Sigma–Aldrich Co (St. Louis, MO, SAD).

3.2. Biljni materijal

Korijen V. amurensis je nabavljen iz Gyeongbuka, Koreja, a takođe je kupljen od Omniherba (Daegu, Republika Koreja). Identifikovao ih je dr. prof. Ki Yong Lee, sa Farmaceutskog koledža na Univerzitetu Koreje. Uzorak vaučera (KUP-HD071) deponovan je u Laboratoriju za farmakognoziju, Farmaceutski fakultet Univerziteta u Koreji.

3.3. LC-Q-TOF masena spektrometrija

LC je izveden korištenjem serije Agilent 1260 (Agilent, Santa Clara, Kalifornija, SAD) koja se sastoji od binarne pumpe, online degasera, autosamplera, termostatski kontroliranog odjeljka kolone i detektora fotodiode. Kromatografsko odvajanje je izvedeno pomoću Shiseido CapCell PAK C18 kolone (5 µm, 4,6 mm, ID × 150 nm). Mobilna faza se sastojala od vode (rastvarač A) i ACN (rastvarač B), oba sadrže 0.1 posto mravlje kiseline. Uslovi gradijenta su bili sljedeći: 0–5 min, 10 posto B, 5–30 min, i linearno povećanje B od 10 do 90 posto. Međubrzina je postavljena na 0,6 mL/min; 5 µL i 20 µL uzoraka je ubrizgano za LC-Q-TOF-MS analizu i LC-Q-TOF-MS zajedno sa testom inhibitora tirozinaze, respektivno. Masena spektrometrija je izvedena korišćenjem Agilent 6530 Q-TOF masenog spektrometra (Agilent, Santa Clara, CA, USA) sa interfejsom elektrosprej jonizacije (ESI) u negativnom režimu. Podaci raspona mase od m/z 50–1000 prikupljeni su u centroid modu. Parametri mase bili su sljedeći: kapilarni napon 4000 V; pritisak nebulizatora, 40 psi; napon fragmenta, 175 V; napon skimera, 65 V; temperatura gasa za sušenje, 325 ◦C; sporedna brzina gasa za sušenje, 12,0 L/min; energija sudara 10, 20, 30 i 40 eV. Podešavanje parametara akvizicije i obrada podataka obavljeni su pomoću LC-MS/MS Data Acquisition pomoću Q-TOF serije 6530 (verzija B.05.00) (softver MassHunter Workstation, Agilent, Santa Clara, Kalifornija, SAD).

3.4. LC-Q-TOF-MS u kombinaciji sa testom inhibicije tirozinaze

LC-Q-TOF-MS u kombinaciji sa testom inhibitora tirozinaze sproveden je metodom ustanovljenom u prethodnoj studiji [24]. Ukratko, analiza je nastavljena u dva ciklusa. U prvoj vožnji, hemijski profil uzorka je dobijen pomoću LC-Q-TOF-MS. U sljedećem ciklusu, eluat nakon prolaska kroz LC sistem pod navedenim LC-Q-TOF uslovima je sakupljen u 96- ploče sa bunarima svakih 30 s. Inhibicijska aktivnost sakupljenih frakcija na tirozinazu je procijenjena pomoću testa inhibitora tirozinaze.

3.5. Izolacija spojeva koji inhibiraju tirozinazu iz korijena V. amurensis

Za izolaciju jedinjenja koja inhibiraju tirozinazu identificiranih korištenjem LC-Q-TOF-MS u kombinaciji sa testom inhibitora tirozinaze, korijen V. amurensis (3.01 kg) je ekstrahovan tri puta sa 80 posto MeOH u trajanju od 60 min na sobnoj temperaturi pomoću ultrazvučne obrade. Ekstrahovani rastvarač je filtriran i koncentriran da se dobije sirovi ekstrakt (215,7 g), koji je suspendovan u vodi i uzastopno podeljen korišćenjem n-heksana, etil acetata (EtOAc) i n-BuOH. EtOAc frakcija (25,85 g) je podvrgnuta hromatografiji na koloni silika gela korišćenjem n-heksana: EtOAc pod uslovima gradijenta (20:1 → 0:1) da bi se dobilo sedam frakcija (E1–E7). Frakcija E4 je odvojena korišćenjem MPLC i 100 g SNAP KP-Sil, patrone od silika gela i dihlormetan: MeOH pod uslovima gradijenta (97:3 → 0:100) da bi se dobilo sedam podfrakcija (E4–1 do E4–7) . Jedinjenje 2 (417,0 mg) je dobijeno iz E4–5. Podfrakcija E4–4 je ponovo hromatografisana na MPLC koristeći SNAP 25 g Ultra, silika gel uložak i hloroform:MeOH:H2O pod uslovima gradijenta (50:4:1 → 15:4:1) da bi se dobilo sedam frakcija ( E4–4–1 do E4–4–7). Jedinjenje 1 (396,0 mg) je dobijeno iz E4–4–5, koje je uočeno kao jedna tačka na ploči tankoslojne hromatografije (TLC).

3.6. Test inhibicije tirozinaze

Inhibicijska aktivnost tirozinaze procijenjena je prethodno opisanom metodom uz neznatne modifikacije [25]. Dva mikrolitra uzorka i 50 µL 0.1 U/µL tirozinaze pečuraka tretirani su u 96-pločama i inkubirani na 37 ◦C. Nakon 15 min, dodato je 50 µL 1 mM L-tirozina i zatim reaguje na 37 ◦C tokom 15 min. Količina formiranog dopahroma izmjerena je na 495 nm pomoću čitača mikroploča Spectra Max 19{{20}} (Molecular Devices, San Jose, CA, USA). Inhibicijska aktivnost tirozinaze izračunata je korištenjem sljedeće jednadžbe: inhibicija tirozinaze ( posto )=[1 − (S − S0)/(C − C0)] × 100, gdje je S apsorpcija uzorka, tirozinaze i L -tirozin; S0 je apsorpcija uzorka i L-tirozina; C je apsorpcija tirozinaze i L-tirozina, a C0 je apsorpcija L-tirozina. Kojična kiselina, poznati inhibitor tirozinaze, korištena je kao pozitivna kontrola. IC50 vrijednosti su izračunate pomoću GraphPad Prism 6 (GraphPad Software, Inc., La Jolla, CA, USA).

3.7. Molecular Docking Studies

Molekularno spajanje je izvedeno korišćenjem softvera SYBYL-X 2.1.1 (Tripos Ltd., St. Louis, MO, SAD) sa kristalnim strukturama PPO3, tirozinaze iz Agaricus bisporus (Protein Data Bank (PDB) ID: 2Y9W). Svi molekuli vode ciljnog proteina su uklonjeni, a priprema liganda je sprovedena prema protokolu pripreme "sanitize" u SYBYL-X 2.1.1. Afinitet protein-ligand je izračunat pomoću polja Tripos sile i izražen kao ukupni rezultati. Usidrena poza liganda iz kompleksa protein-ligand vizualizirana je u programu Discovery Studio 2017 R2 Client (Biovia Co., San Diego, Kalifornija, SAD).

3.8. Dizajn eksperimenta i statistička analiza

Optimizirani uvjeti za ekstrakciju sastojaka s maksimalnom inhibitornom aktivnošću tirozinaze iz korijena V. amurensis su uspostavljeni korištenjem BBD-a sa tri varijable i tri nivoa (MINITAB izdanje 14.12.0 Statistički softver). Na osnovu preliminarnih rezultata jednofaktorskog eksperimenta odabrane su nezavisne varijable uključujući vrijeme ekstrakcije (X1), koncentraciju MeOH i vode (X2), te volumen tekućine (X3) i raspon njihovih varijabli (Tablica S3). Varijable za RSM su kodirane korištenjem tri nivoa, −1, 0 i 1. Ukupno je dizajnirano 15 eksperimenata uključujući 3 replika u centru dizajna (Tabela 2). Kao nezavisni odgovori, mjereni su prinos (procenti), inhibitorna aktivnost tirozinaze (procent), količina jedinjenja (1) (µg/mg) i količina jedinjenja (2) (µg/mg). Inhibicijska aktivnost ekstrakta na tirozinazu procijenjena je pri koncentraciji od 50 µg/mL. Svaki odgovor se izražava pomoću sljedeće polinomske jednadžbe drugog reda:

gdje R označava odgovor; 1, 2 i 3 su linearni koeficijenti; 12, 23 i 13 su koeficijenti interakcije između tri varijable; a 11, 22 i 33 su kvadratni koeficijenti.
Nadalje, Pearsonova korelacijska analiza je izvršena kako bi se utvrdilo postojanje linearne veze između svake varijable i odgovora. Pearsonov koeficijent korelacije ima jak linearni odnos između {{0}}.7 i 1.0, jasan linearni odnos između 0.3 i 0.7, slab linearni odnos između {{10}}.1 i 0.3, i nikakav ili zanemarljiv linearni odnos između 0.0 i 0.1. Pozitivna i negativna korelacija se izražava u zavisnosti od toga da li je Pearsonov koeficijent korelacije pozitivan ili negativan.

3.9. Kvantitativna analiza spojeva 1 i 2 koji inhibiraju tirozinazu

Količina svakog spoja 1 i 2 u ekstraktima dobivenim korištenjem dizajniranih 15 eksperimentalnih uvjeta mjerena je pomoću kalibracionih krivulja (Tablica 2). Kalibracione krive za jedinjenja 1 i 2 određene su korišćenjem površine ispod krive UV hromatograma (330 nm dobijenih pri koncentracijama od 0,1-1000 µg/mL i 7,81-1000 µg/mL, respektivno). LC je izveden korišćenjem Waters 2695 LC sistema (Waters, Santa Clara, Kalifornija, SAD) sa istim uslovima kao i za LC sistem koji je detaljno opisan u Materijalima i metodama, LC-Q-TOF masena spektrometrija.

4. Zaključak

ε-Viniferin (1) i vitamin B (2) iz korijena V. amurensis okarakterizirani su kao sastojci za izbjeljivanje kože korištenjem LC-Q-TOF-MS u kombinaciji sa testom inhibitora tirozinaze. Konkretno, vitamin B (2) je prvi put identifikovan kao spoj koji inhibira tirozinazu u ovoj studiji, a ε-vinifera (1) i vitamin B (2) su pokazali veće inhibitorne efekte na tirozinazu od pozitivne kontrole, kojične kiseline. Uslovi optimizacije sa maksimalnim inhibitornim efektom tirozinaze i prinosom korena V. amurensis su uspostavljeni korišćenjem vremena ekstrakcije (100 min), koncentracije MeOH (66,38 procenata) i zapremine tečnosti (140 mL). Rezultat je pokazao dobru korespondenciju između eksperimentalnih i predviđenih vrijednosti. Shodno tome, LC-Q-TOF-MS u kombinaciji sa biološkim testom pokazao je potencijal za efikasno pronalaženje novih aktivnih sastojaka, kao i poznatih aktivnih sastojaka, vitamina B (2), koji se može predložiti kao novi prirodni potencijal za izbjeljivanje.

Dodatni materijali: Sljedeće je dostupno na mreži, slika S1: MS hromatogram u načinu negativne jonizacije (A); UV hromatogram na 280 nm (B) ekstrakata korijena V. amurensis, Slika S2: 1H- i 13C-NMR spektri jedinjenja 1 (300 i 75 MHz, CD3OD), Slika S3: 1H- i 13C-NMR spektri jedinjenja 2 (300 i 75 MHz, CD3OD), Slika S4: Sigmoidalni dijagram i IC50 pozitivne kontrole, jedinjenja 1 i 2, Slika S5: Grafički prikazi površine i konture koji pokazuju učinak parametara ekstrakcije (X1: vrijeme ekstrakcije, min; X2: Koncentracija MeOH, posto; X3: zapremina rastvarača, mL). (A) prinos; (B) inhibitorna aktivnost tirozinaze; (C) jedinjenje 1; (D) spoj 2; (E) zbir jedinjenja 1 i 2, tabela S1. Inhibicijska aktivnost tirozinaze ekstrakta korijena V. amurensis, Tabela S2: 1H- i 13C NMR podaci jedinjenja 1 i 2 u CD3OD (δ u ppm), Tabela S3: Nezavisne varijable i nivoi za metodologiju površine odgovora, Tabela S4: Procijenjena regresija koeficijent za prinos, Tabela S5: Analiza varijanse za prinos, Tabela S6: Procijenjeni koeficijent regresije za aktivnost inhibicije tirozinaze, Tabela S7: Analiza varijanse za aktivnost inhibicije tirozinaze, Tabela S8: Procijenjeni koeficijent regresije za jedinjenje 1, Tabela S9: Analiza varijansa za jedinjenje 1, Tabela S10: Procijenjeni koeficijent regresije za jedinjenje 2, Tabela S11. Analiza varijanse za jedinjenje 2, Tabela S12: Procijenjeni koeficijent regresije za zbir jedinjenja 1 i 2, Tabela S13: Analiza varijanse za zbir jedinjenja 1 i 2.
Doprinosi autora: Konceptualizacija, KYL; metodologija, K.-EO, HS i KYL; softver, K.-EO i HS; validacija, HS; formalna analiza, K.-EO, i HS; istraga, K.-EO, HS, MKL i KYL; kuriranje podataka, K.-EO, HS, BP i KYL; pisanje—priprema originalnog nacrta, K.-EO i HS; pisanje—pregled i uređivanje, HS, MKL, BP i KYL; nadzor, MKL, BP i KYL Svi autori su pročitali i složili se s objavljenom verzijom rukopisa.
finansiranje: Ovo istraživanje je podržala donacija Nacionalne istraživačke fondacije Koreje koju je financirala Vlada Koreje (NRF-2017R1A2B4003403 i NRF-2019R1A6A1A03031807) i grant projekta za istraživanje i razvoj zdravstvene tehnologije Koreje kroz razvoj zdravstvene industrije Koreje Institut (KHIDI), finansiran od strane Ministarstva zdravlja i socijalne zaštite, Republika Koreja (HF20C0038).
Izjava o dostupnosti podataka: Podaci prikazani u ovoj studiji dostupni su u dodatnom materijalu.
Sukobi interesa:Autori izjavljuju da nema sukoba interesa.
Dostupnost uzorka: Nije dostupno

Reference

1. Ranjbar, S.; Shahvaran, PS; Edraki, N.; Khoshneviszadeh, M.; Darroudi, M.; Sarrafifi, Y.; Hamzehloueian, M.; Khoshneviszadeh, M. 1, 2, 3-Triazol-vezani 5-benziliden (tio) barbiturati kao novi inhibitori tirozinaze i hvatači slobodnih radikala. Arch. Pharm. 2020, 353, 2000058. [CrossRef] [PubMed]

2. Chang, T.-S.; Ding, H.-Y.; Lin, H.-C. Identifikacija 6, 7, 40 -trihidroksiizoflavona kao snažnog inhibitora tirozinaze. Biosci. Biotechnol. Biochem. 2005, 69, 1999–2001. [CrossRef] [PubMed]

3. Miyazawa, M.; Oshima, T.; Koshio, K.; Itsuzaki, Y.; Anzai, J. Inhibitor tirozinaze iz mekinja crne riže. J. Agric. Food Chem. 2003, 51, 6953–6956. [CrossRef]

4. Chen, Q.; Diao, L.; Song, H.; Zhu, X. Vitis amurensis Rupr: Pregled hemije i farmakologije. Fitomedicina 2018, 49, 111–122. [CrossRef] [PubMed]

5. Jin, K.-S.; Oh, YN; Hyun, SK; Kwon, HJ; Kim, BW Betulinska kiselina izolirana iz korijena Vitis amurensis inhibira 3-izobutil-1- melanogenezu izazvanu 3-izobutil-1- metilksantinom induciranom melanogenezom putem regulacije MEK/ERK i PI3K/Akt puteva u B16F10 ćelijama. Food Chem. Toxicol. 2014, 68, 38–43. [CrossRef]

6. Kim, H.; Thuong, PT; Ngoc, TM; Lee, I.; Hung, ND; Bae, K. Antioksidativna i lipoksigenaza inhibitorna aktivnost oligostilbena iz lista i stabljike Vitis amurensis. J. Ethnopharmacol. 2009, 125, 304–309. [CrossRef]

7. Jin, K.-S.; Oh, YN; Hyun, SK; Kwon, HJ; Kim, BW Vitis amurensis Ruprechtov korijen inhibirao melanogenezu izazvanu hormonom melanocita u B16F10 stanicama. Nutr. Res. Prakt. 2014, 8, 509–515. [CrossRef]

8. Jang, MH; Piao, XL; Kim, HY; Cho, EJ; Baek, SH; Kwon, SW; Park, JH Resveratrol oligomeri iz Vitis amurensis smanjuju oksidativni stres izazvan amiloidom u PC12 ćelijama. Biol. Pharm. Bik. 2007, 30, 1130–1134. [CrossRef]

9. Lee, E.-O.; Lee, H.-J.; Hwang, H.-S.; Ahn, K.-S.; Chae, C.; Kang, K.-S.; Lu, J.; Kim, S.-H. Snažna inhibicija rasta Lewisovog karcinoma pluća heksanolom A iz korijena Vitis amurensis putem apoptotičkih i antiangiogenih aktivnosti. Karcinogen 2006, 27, 2059–2069. [CrossRef]

10. Bak, M.-J.; Truong, VL; Kang, H.-S.; Jun, M.; Jeong, W.-S. Protuupalni učinak procijanidina iz sjemenki divljeg grožđa (Vitis amurensis) u ćelijama RAW 264.7 izazvanim LPS. Oksid. Med. Cell. Longev. 2013, 2013. [CrossRef]

11. Shin, H.; Chung, H.; Park, B.; Lee, KY Identifikacija antioksidativnih sastojaka iz Polygonum aviculare upotrebom LC-MS u kombinaciji sa DPPH testom. Nat. Prod. Sci. 2016, 22, 64–69. [CrossRef]

12. Park, S.; Shin, H.; Park, Y.; Choi, I.; Park, B.; Lee, KY Karakterizacija inhibitornih sastojaka proizvodnje NO iz Catalpa ovata korištenjem LC-MS u kombinaciji sa testom baziranim na ćelijama. Bioorg. Chem. 2018, 80, 57–63. [CrossRef] [PubMed]

13. Ingkaninan, K.; De Best, C.; Van Der Heijden, R.; Hofte, A.; Karabatak, B.; Irth, H.; Tjaden, U.; Van der Greef, J.; Verpoorte, R. Tečna hromatografija visokih performansi sa on-line spojenom UV, masenom spektrometrijom i biohemijskom detekcijom za identifikaciju inhibitora acetilholinesteraze iz prirodnih proizvoda. J. Chromatogr. 2000, 872, 61–73. [CrossRef]

14. Bezerra, MA; Santelli, RE; Oliveira, EP; Villar, LS; Escaleira, LA Metodologija površine odgovora (RSM) kao alat za optimizaciju u analitičkoj hemiji. Talanta 2008, 76, 965–977. [CrossRef] [PubMed]

15. Witek-Krowiak, A.; Chojnacka, K.; Podstawczyk, D.; Dawiec, A.; Pokomeda, K. Primjena metodologije površine odgovora i metoda umjetne neuronske mreže u modeliranju i optimizaciji procesa biosorpcije. Bioresour. Technol. 2014, 160, 150–160. [CrossRef] [PubMed]

16. Araujo, PW; Brereton, RG Dizajn eksperimenta I. Screening. Trends Analyst. Chem. 1996, 15, 26–31. [CrossRef]

17. Wang, Y.; Zhao, L.; Zhang, R.; Yang, X.; Sun, Y.; Shi, L.; Xue, P. Optimizacija ekstrakcije potpomognute ultrazvukom metodologijom površine odgovora, antioksidativnim kapacitetom i inhibitornom aktivnošću antocijana na tirozinazu iz crvenih pirinčanih mekinja. Food Sci. Nutr. 2020, 8, 921–932. [CrossRef]

18. Weremfo, A.; Adulley, F.; Adarkwah-Yiadom, M. Simultaneous Optimization of Microwave Assisted Extraction of Phenol Compounds and Antioxidant Activity of Avocado (Persea americana Mill.) Seeds Using Response Surface Methodology. J. Anal. Methods Chem. 2020, 2020, 7541927. [CrossRef]

19. Ko, J.; Choi, J.; Bae, SK; Kim, J.; Yoon, KD Odvajanje pet oligostilbena iz V itis amurensis pomoću protivstrujne hromatografije visokih performansi sa gradijentom druge brzine. J. Sep. Sci. 2013, 36, 3860–3865. [CrossRef]

20. Wang, K.-T.; Chen, L.-G.; Tseng, S.-H.; Huang, J.-S.; Hsieh, M.-S.; Wang, C.-C. Protuupalni efekti resveratrola i oligostilbena iz Vitis thunbergii var. taiwaniana protiv artritisa izazvanog lipopolisaharidom. J. Agric. Food Chem. 2011, 59, 3649–3656. [CrossRef]

21. Hu, J.; Lin, T.; Xu, J.; Ding, R.; Wang, G.; Shen, R.; Zhang, Y.-W.; Chen, H. Polifenoli izolovani iz listova Vitis thunbergii var. taiwaniana reguliše put povezan sa APP. Bioorg. Med. Chem. Lett. 2016, 26, 505–511. [CrossRef] [PubMed]

22. Oshima, Y.; Kamijou, A.; Ohizumi, Y.; Niwa, M.; Ito, J.; Hisamichi, K.; Takeshita, M. Novel oligostilbenes iz Vitis coignetiae. Tetrahedron 1995, 51, 11979–11986. [CrossRef]

23. Anna Malinowska, M.; Billet, K.; Drouet, S.; Munsch, T.; Unlubayir, M.; Tungmunnithum, D.; Giglioli-Guivarc'h, N.; Hano, C.; Lanoue, A. Ekstrakti grožđane trske kao multifunkcionalni kozmetički sastojak za pomlađivanje: procjena aktivnosti sirtuina, inhibicije tirozinaze i potencijala bioraspoloživosti. Molecules 2020, 25, 2203. [CrossRef] [PubMed]

24. Yang, HH; Oh, K.-E.; Jo, YH; Ahn, JH; Liu, Q.; Turk, A.; Jang, JY; Hwang, BY; Lee, KY; Lee, MK Karakterizacija sastojaka koji inhibiraju tirozinazu iz nadzemnih dijelova Humulus japonicus korištenjem LC-MS/MS spojenog online testa. Bioorg. Med. Chem. 2018, 26, 509–515. [CrossRef] [PubMed]

25. Liu, Q.; Kim, C.; Jo, YH; Kim, SB; Hwang, BY; Lee, MK Sinteza i biološka procjena derivata resveratrola kao inhibitora melanogeneze. Molecules 2015, 20, 16933–16945. [CrossRef] [PubMed]

Za više informacija: david.deng@wecistanche.com WhatApp:86 13632399501