Poglavlje 2: Faktor 15 sličan Krϋppelu potiskuje proliferaciju mezangijalnih ćelija bubrežnih glomerula putem pojačavanja konjugacije P53 SUMO1

Za više informacija. kontakttina.xiang@wecistanche.com

3 REZULTATA

3.1|Skrining KLF15-vezujućih gena putem ChIP-Seq u primarnim bubrežnim glomerularnim MC

Da bismo identifikovali partnerske gene za direktno vezivanje KLF15, izvršili smo ChlP-Seq analizu i na kraju pregledali 2478 gena. GO analiza ovih gena putem alata na web stranici www.uniprot.org (Slika 1A, B) otkrila je termine molekularne funkcije povezane sa 1941 genom, termine ćelijskih komponenti koji se odnose na 1662 gena i termine biološkog procesa koji se odnose na 1766 gena. Budući da je naš cilj bio otkriti kako KLF15 utječe na MC, fokusirali smo se na gene povezane sa ćelijskim procesom. Među 1315 gena povezanih sa ćelijskim procesom, 74 gena su pronađena da učestvuju u procesima ćelijskog ciklusa; konkretno, ovi geni su učestvovali u mitotičkom ćelijskom ciklusu, faznoj tranziciji ćelijskog ciklusa i drugim procesima (Slika 1C, D). Nadalje, analizirali smo gene uključene u rast i otkrili da su povezani s razvojnim rastom, rastom ćelija i drugim tipovima rasta (Slika 1E).

3.2|Provjera diferencijalno reguliranih gena u KLF15-premjernoj ekspresiji bubrežnih glomerularnih MC-a korištenjem SILAC-a i LC/MS

SILAC i LC/MS analiza HRMC-a koji prekomjerno eksprimiraju KLF15 u poređenju sa roditeljskim ćelijama dovela je do identifikacije 1357 proteina. Koristili smo DAVID i IPA da nabavimo GO domene i obogaćene puteve kvantificiranih proteina koje je identificirao SILAC. Zanimljivo je da su mnogi termini vezani za biološke funkcije proteina bili među prvih 30 značajno obogaćenih GO pojmova, uključujući regulaciju metaboličkog procesa ćelijskih aminokiselina, kompleks proteasoma, vezivanje proteina i termine transkripcije i translacije, koji su svi usko povezani sa ubikvitinacija (Slika 2A). Slika 2B prikazuje prvih 30 značajno obogaćenih termina putanje. Nekoliko termina bioloških procesa, uključujući termine proteazoma i neurodegenerativne bolesti, također su bili povezani s ubikvitinacijom.

Kliknite da saznate ocistanchena prodaju sa detaljima

3.3|Bioinformatička analiza KLF15-vezujućih gena koji su potencijalno povezani sa proliferacijom bubrežnih glomerularnih MC

Za istraživanje gena koji se vezuju za KLF15- koji su potencijalno povezanibubrežni glomerularMC proliferacije, izvršili smo bioinformatičku analizu podataka ChIP-Seq i SILAC-LC/MS podataka. Pregledano je 52 gena (Tabela 2 i Slika 2C), a pet od ovih gena, uključujući SUMO1, faktor inhibicije migracije makrofaga (MIF), eukariotski inicijacijski faktor (EIF), faktor rasta sličan insulinu (IGF) i retikulokalbin (RCN). ), bili su usko povezani saćelijska proliferacija. Budući da su GO i analize puteva različito eksprimiranih proteina sugerirali da su skrinirani geni povezani uglavnom s procesom ubikvitinacije, zaključili smo da SUMO1, član porodice proteina sličnih ubikvitinu (UBL), učestvuje u posttranslacijskoj modifikaciji sličnoj ubikvitinacija kao ciljni gen KLF15.

Sve veći broj dokaza ukazuje na to da je HG jedan od glavnih faktora koji izazivaju razvoj dijabetičke nefropatije, te promovira proliferaciju MC i povećanu sintezu matriksa in vitro.25 Prethodna studija je pokazala da je PDGF-BB neophodan za proliferaciju MC koja prethodi razvoju glomeruloskleroze u eksperimentalnom glomerulonefritisu.26 Nakon što smo potvrdili da su MC stimulirani HG ili PDGF-BB in vitro, otkrili smo promjene u ekspresiji KLF15 i SUMO1 i na RNK i na proteinu

nivoe i otkrili da ovi molekuli imaju slične trendove (slika 2D-l). Konačno, utvrdili smo da je SUMO1 ciljni gen KLF15.

3.4|KLF15 reguliše ekspresiju SUMO-1 gena vezujući se za 16 bp CACCCA-SUMO-1 promotorsku regiju i motiv bogat C plus A

Koristili smo MEME paket (http://meme-suite.org/tools/meme) za karakterizaciju KLF15-motiva vezivanja 52 pregledana gena iz KLF15 ChlP-Seq podataka i identifikovali KLF-vezujući motiv (Slika 3A). Osim toga, dalje smo analizirali više od hiljadu baza uzvodno od SUMO1 promotora i otkrili da KLF15 može prepoznati i vezati se za sekvencu od 16 bp (nukleotidi -205~-199) uključujući - CACCCA-(Slika 3B).ChIP-PCR je potvrdio da je KLF15 vezan za SUMO1 promotor, a rezultati su pokazali značajno veću ekspresiju SUMO1 u grupi anti-KLF15 antitijela nego u kontrolnoj grupi (slika 3C).

Nadalje, izvršili smo test reportera dualne luciferaze kako bismo potvrdili odnos ciljanja između SUMO1 i KLF15. Grupa promotora SUMO1 divljeg tipa pokazala je veću aktivnost luciferaze od pGL3 vektora i mutantnih grupa u HRMC, a aktivnost je značajno povećana prekomjernom ekspresijom KLF15. Poboljšanja aktivnosti luciferaze su poništena transfekcijom sa plazmidom koji eksprimira mutantni promotorski region (Slika 3D). Uzeti zajedno, ovi podaci sugeriraju da je SUMO1 direktna meta transkripcije KLF15.

3.5 |Skrining P53 kao SUMOilacioni supstrat za SUMO1

SUMO modifikacije su široko izražene posttranslacijske modifikacije kod eukariota. Reverzibilna konjugacija ovih modifikacija sa supstratnim proteinima poznata je i kao SUMOilacija, koja igra važnu ulogu u regulaciji funkcija ciljnih proteina i dalje učestvuje u različitim biološkim procesima, kao što su nukleocitoplazmatski transport, regulacija transkripcije, apoptoza, stabilizacija proteina, odgovori na stres i progresija ćelijskog ciklusa.27 Da bismo istražili nizvodne signalne molekule direktno konjugirane sa SUMO1, izvršili smo mrežnu analizu SUMO1 koristeći IPA bazu podataka, a podaci su pokazali da se SUMO1 može direktno konjugirati s P53, APP, JUN i AKT, između ostalog. proteini (Slika 4A-C). Prvobitno smo odabrali P53 kao nizvodni molekul SUMO1 jer je to dobro poznati protein koji je usko povezan sa ćelijskom proliferacijom.28.29 Nadalje, koristili smo SUMOsp softver za predviđanje mogućih SUMOilacijskih sekvenci različitih vrsta P53 i otkrili da P53 ima sekvencu SUMOilacije（ Slika 4D）. Da bismo utvrdili da li je P53 zaista modificiran SUMOilacijom, privremeno smo transficirali HRMC sa SUMO1 prekomjerno ekspresijskim plazmidom ili SUMO1 siRNA. I IP i Western blot rezultati otkrili su trendove u promjenama ekspresije SUMO1-P53 i P53 koji su bili u skladu s promjenama u SUMO1 (Slika 4E-J). Ovi podaci ukazuju da je P53 SUMOilacijski supstrat SUMO1.

3.6 |KLF15 inhibira MC proliferaciju promovišući ekspresiju SUMO1 i P53 SUMOilaciju

Da bismo uspostavili regulaciju P53 SUMOilacije i MC proliferacije pomoću KLF15 i SUMO1, intervenirali smo sa ekspresijom KLF15 ili SUMO1 u HRMC i tretirali HRMC s PDGF-BB. Među PDGF-BB-tretiranim HRMC, ćelije transficirane plazmidom prekomerne ekspresije KLF15 pokazale su veću ekspresiju SUMO1-P53, P53, KLF15 i SUMO1 nego ćelije transficirane KLF15 kontrolnim plazmidom. Iste promjene u SUMO1-P53, P53 i SUMO1 pronađene su u ćelijama transficiranim plazmidom prekomjerne ekspresije SUMO1, dok je ekspresija KLF15 ostala nepromijenjena u ovim ćelijama (Slika 5A-F). PDGF-BB je jedan od najefikasnijih faktora rasta MC-ova opisanih do sada, a uočen je proliferativni odgovor HRMC-a na PDGF-BB. Kao što je prikazano na slici 5G, H, procenat EdU-pozitivnih ćelija je značajno povećan davanjem rekombinantnog PDGF-BB. Rezultati bojenja EdU pokazali su da prekomjerna ekspresija KLF15 i SUMO1 inhibira proliferaciju stanica izazvanu PDGF-BB (Slika 5G, H).

Da bismo stekli daljnji uvid u uloge KLF15 i SUMO1 u proliferirajućim HRMCs, transficirali smo stanice samo sa SUMO1 siRNA ili ih kotransficirali sa SUMO1 siRNA i KLF15 prekomerno ekspresijskim plazmidom. Smanjenje regulacije SUMO1 nije uticalo na ekspresiju KLF15, ali nivoi ekspresije SUMO1-P53 i P53 su očigledno smanjeni nakon transfekcije SUMO1 siRNA (Slika 6A-C). Pored toga, kada je ekspresija SUMO1 inhibirana, nivoi ekspresije SUMO1-P53 i P53 su takođe potisnuti čak iu ćelijama koje prekomerno eksprimiraju KLF15 (slika 6D-F). Zatim je proliferacija MC procijenjena korištenjem EdU testa bojenja. SUMO1 RNAi je pojačao proliferativni učinak PDGF-BBon HRMCs, a grupa kotransficirana plazmidom prekomjerne ekspresije KLF15 i SUMO1 siRNA imala je više EdU-pozitivnih ćelija od grupe kotransficirane plazmidom prekomjerne ekspresije i kontrolnom hibridnom sekvencom siRNA (Slika 6G, H) . Stoga zaključujemo da KLF15 potiskuje proliferaciju MC pojačavajući SUMOilaciju P53.

3.7|Globalna ekspresija SUMO1 i P53 u glomerularnim MC je u negativnoj korelaciji sa proliferacijom MC kod Thy{4}} nefritisa štakora

Anti-Thy1 nefritis je klasičan model samoograničenog mezangijalnog proliferativnog glomerulonefritisa s proliferativnom fazom i fazom oporavka. Ubrizgali smo Thy1 antitijelo Wistar pacovima da bismo napravili ovaj model. I dušik uree u serumu i kreatinin nemaju značajnu promjenu između kontrolnih pacova i modelnih pacova (Slika S1). Izražena mezangijalna proliferacija i akumulacija ECM uočeni su tokom proliferativne faze (5. i 7. dan) kod modelnih pacova, a broj MC-a se smanjio tokom faze oporavka 10. dana (Slika 7A). Takođe smo detektovali promene ekspresije u markeru ćelijske proliferacije PCNA pomoću IHC (Slika 7A, B). Nivoi PCNA su povećani 5. dana, dostigli vrhunac 7. i smanjeni 10. dana (Slika 7F). Western blot analiza je pokazala da je ekspresija proteina P53, SUMO1 i KLF15 u izolovanim glomerulima bila niža u modelnim grupama nego u kontrolnoj grupi (Slika 7C, D), u skladu sa imunohistohemijskim rezultatima (Slika 7E, F). Ovi rezultati pokazuju da je abnormalna proliferacija MC kod štakora anti-Thy1 modela povezana sa niskim nivoom ekspresije KLF15 i SUMO1. Očekuje se da će ometanje ekspresije ovih molekula ublažiti patološki fenotip kod pacova.

4 DISKUSIJA

Theglomerulisu jedinice za filtriranjebubreg. Poremećaj glomerularne funkcije može biti uzrokovan primarnom glomerularnom patologijom ili može biti sekundarni sistemskim bolestima. Mezangijalne promjene su uočene nakon glomerularne ozljede uključujući hiperproliferaciju MC praćene prekomjernom proizvodnjom ECM (mezangijalna ekspanzija) i proizvodnjom kemoatraktanta za inflamatorne stanice. Stoga je modulacija MC odgovora, posebno abnormalne proliferacije, novi terapijski pristup. KLF15 je protein koji igra regulatornu ulogu kao faktor transkripcije vezivanjem za specifične sekvence DNK. Mnoge studije su objavile da je KLF15 uključen u regulaciju proliferacije ćelija. Na primjer, otkriveno je da KLF15 učestvuje u inhibiciji signalnih puteva povezanih s proliferacijom MC,15,30 ali njegov direktni ciljni gen nije prijavljen u literaturi. Stoga je ova studija uključivala uglavnom zajednički skrining nivoa transkripcije i translacije kako bi se identificirao direktni ciljni gen KLF15.

KLF15 reguliše različite gene u različitim vrstama iu različitim tkivima i organima. U procesu regulacije proliferacije MC, KLF15 utječe na ekspresiju više gena i učestvuje u više puteva.131,32 Da bismo istražili direktne ciljne gene KLF15, koristili smo ChIP-Seg. Klein RH i njegove kolege su koristili ChlP-seq tehnologija za proučavanje regulacije KLF7 na diferencijaciju epitelnih ćelija rožnjače.33 Ying M i saradnici su koristili ovu tehniku ​​da proučavaju inhibitorni efekat KLF9 na pluripotenciju glioblastoma.34U poređenju sa ChlP-čipom, ChIP-Seq omogućava pravu analizu celog genoma sa višom rezolucijom, većom osetljivošću detekcije i manjom potražnjom za veličinom uzorka.35 Koristili smo ChP da dobijemo DNK fragmente direktno vezane za KLF15, a nakon poređenja i analize sa GenBank-om, pregledali smo 2478 mogućih ciljnih gena. Kroz GO i analizu puteva identificirali smo mnoge ciljne gene uključene u ćelijski ciklus i procese proliferacije.

ChlP-Seq eksperimenti zahtijevaju PCR za amplifikaciju signala detekcije, a određeni stepen pristranosti tokom procesa amplifikacije je neizbježan. Pored toga, ChIP-Seq dobija samo gene koje KLF15 može da veže i ne ukazuje na promene koje se dešavaju u ekspresiji ovih gena kada se ekspresija KLF15 promeni. Koristili smo SILAC-LC/MS proteomičku analizu da kompenziramo ove nedostatke. Ova tehnika pruža informacije o svim proteinima čija se ekspresija mijenja nakon regulacije KLF15, uključujući proteine ​​direktno regulirane KLF15 i proteine ​​koji su indirektno regulirani ili post-translacijsko modificirani. HRMC su kultivisane korišćenjem SILAC-a, a KLF15 je prekomerno eksprimiran u ćelijama kroz transfekciju plazmida. Proteini su sakupljeni za LC/MS detekciju i dobijeno je 1357 različito eksprimiranih proteina. GO i analize puteva otkrile su da su neki od različito eksprimiranih proteina uključeni u ubikvitinaciju. Podaci o genima i proteinima su ukrštani. Geni koji nisu povezani sa svrhom istraživanja i geni koji nisu direktno regulisani KLF15 su uklonjeni; na kraju, pregledana su 52 gena. Među njima je odabrano pet gena sa najočiglednijim razlikama u ekspresiji koji su bili najbliži povezani sa proliferacijom. S obzirom na kombinovane rezultate analize puteva, analize ekspresije SUMO1 i KLF15 u proliferirajućim HRMCs, ChlP-PCR i dual-luciferase reporter testovima, protein SUMO1 je odabran kao ciljni gen KLF15.

Pored ubikvitina, identifikuje se sve veći broj UBLproteina,3637 uključujući SUMO,38 neuralne prekursorske ćelije izražene, razvojno smanjene 8(NEDD8)3940 i interferonom stimulisan gen 15(ISG15),41. Ovi modificirajući proteini snažno reguliraju različite biološke procese. Kovalentno dodavanje SUMO supstratima, nazvano SUMOilacija, je posttranslacijska modifikacija uključena u niz ćelijskih procesa, uključujući nuklearno-citosolni transport, transkripcijsku regulaciju, apoptozu, kontrolu stabilnosti proteina, odgovore na stres i progresiju ćelijskog ciklusa.27SUMO je tipično vezan za akceptorske lizinske ostatke proteinskih supstrata koji sadrže konsenzus sekvencu i doprinose regulaciji protein-proteinskih interakcija, kao i supćelijskoj kompartmentalizaciji i stabilnosti proteina.2 sUMO1, kao član porodice SUMOS, može uticati na proliferaciju ćelije modifikujući supstrat i stabilizaciju regulatornih proteina ćelijskog ciklusa.43 Stoga, u kombinaciji sa izvještajem iz literature i sveobuhvatnim rezultatima skrininga i analize, fokusirali smo se na to kako KLF15 reguliše efekat SUMO1 na proliferaciju mezangijalnih ćelija.

Za identifikaciju supstrata SUMO1, izvršili smo analizu mreže SUMO1 koristeći IPA bazu podataka i SUMOsp softver. U kombinaciji s objavljenim istraživanjem o P53, naši početni podaci skrininga sugerirali su P53 kao nizvodni molekul SUMO1 sa SUMOilacijskom sekvencom YKxD/E. Prethodne studije su pokazale da je P53 bio supstrat SUMOilacije,45 a pojačana konjugacija P53 SUMO1 promoviše stabilnost i aktivnost P53 i inducira senescenciju.46 U našoj studiji, interferencija s ekspresijom SUMO1 u HRMC-ima proizvela je iste trendove promjena u SUMO1-P53 i P53, što ukazuje da je P53 bio SUMOilacijski supstrat SUMO1.

Novi dokazi ukazuju da SUMOilacija i de-SUMOilacija igraju ulogu u brojnim nefropatskim bolestima, kao što su disgeneza bubrega, karcinom bubrega, glomerularna bolest, apoptoza podocita i hipertonus bubrežne srži, akutna povreda bubrega i nefrolitija. U odnosu između KLF15, SUMO1, P53 SUMOilacije i MC proliferacije, izvršili smo seriju transfekcijskih tretmana na ćelijama koje su bile podvrgnute proliferaciji izazvanoj PDGF-BB. Prekomjerna ekspresija KLF15 je pojačala ekspresiju SUMO1, dok prekomjerna ekspresija SUMO1 nije utjecala na ekspresiju KLF15. Prekomjerna ekspresija KLF15 ili SUMO1 povećala je SUMOilaciju P53 i antagonizirala proliferaciju stanica izazvanu PDGF-BB. Kada je ekspresija SUMO1 bila inhibirana, SUMOilacija P53 je takođe bila inhibirana, a KLF15 je izgubio svoj antagonistički efekat na proliferaciju ćelija. In vivo. proliferacija MC se postepeno povećavala sa pogoršanjem mezangijalnog proliferativnog nefritisa, dok se ekspresija KLF15, SUMO1 i P53 značajno smanjivala. Uzimajući u obzir integrisana opažanja u ćelijama i tkivima, preliminarno zaključujemo da KLF15 reguliše SUMOilaciju P53 preko SUMO1, čime inhibira MC proliferaciju.

5 ZAKLJUČCI

Neke studije su pokazale da KLF15 igra važnu ulogu u regulaciji proliferacije MC. U ovom radu istražili smo mehanizme supresije MC proliferacije posredovane ovim faktorom transkripcije. Identifikovali smo SUMO1 kao primarni cilj KLF15 u MC putem bioinformatičkih analiza koje uključuju ChIP-Seq i SILAC-LC/MS. Nadalje, uz pomoć IPA baze podataka i SUMOsp softvera, utvrdili smo da je P53 direktan supstrat SUMO1. In vitro i in vivo eksperimenti su potvrdili da KLF15 može promovirati ekspresiju SUMO1 i SUMOilaciju P53, a zatim inhibirati proliferaciju MC (slika S2). Ovi rezultati doprinose razumijevanju regulatorne uloge KLF15 u proliferaciji MC i pružaju teorijsku osnovu za pronalaženje novih tretmana za bolesti bubrega povezanih s MC proliferacijom.