Poglavlje 1: Faktor 15 sličan Krϋppelu potiskuje proliferaciju mezangijalnih stanica bubrežnih glomerula putem pojačavanja konjugacije P53 SUMO1

Za više informacija. kontakttina.xiang@wecistanche.com

Abstract

mezangijalna ćelija (MC)proliferacijaje ključna patološka karakteristika brojnih običnih ljudibubrežne bolesti, uključujući mezangijalni proliferativni nefritis i dijabetičke nefropatije. Poznavanje MC odgovora na patološke podražaje je ključno za razumijevanje ovih procesa bolesti. Prethodno smo utvrdili da je faktor 15 sličan Krüppelu (KLF15), faktor transkripcije cink prstiju obogaćen bubrezima, bio potreban za inhibiciju proliferacije MC. U ovoj studiji, istražili smo direktni ciljni gen i osnovni mehanizam pomoću kojeg KLF15 reguliše mezangijalnu proliferaciju. Prvo smo pregledali mali modifikator 1 vezan za ubikvitin (SUMO1) kao direktnu metu transkripcije KLF15 i potvrdili ovaj nalaz pomoću ChlP-PCR i testova luciferaze. Nadalje, pokazali smo da prekomjerna ekspresija KLF15 ili SUMO1 povećava stabilnost P53, koji blokira ćelijski ciklus humanih bubrežnih MC (HRMC) i stoga ukida proliferaciju stanica. Suprotno tome, nokdaun SUMO1 u HRMC, čak i onima koji su prekomjerno eksprimirani sa KLF15, nije mogao inhibirati stope proliferacije HRMC i povećati SUMOilaciju P53. Konačno, rezultati su pokazali da su nivoi SUMOiliranog P53 u korteksu bubrega anti-Thy 1 modela pacova smanjeni tokom perioda proliferacije. Ovi nalazi otkrivaju kritični mehanizam kojim KLF15 cilja SUMO1 da posreduje u proliferaciji MC.

KLJUČNE RIJEČI: KLF15, proliferacija mezangijalnih ćelija, P53, SUMO1

Kliknite ovdje da biste se upoznali sa prednostimacistanchei gdje možete kupiti cistanche tubulosa

1| UVOD

Mesangijalne ćelije (MC) čine otprilike jednu trećinu stanične populacije unutar glomerula. Oni igraju važnu ulogu u homeostazi tako što održavaju strukturnu arhitekturu glomerula, proizvode i održavaju mezangijalni matriks, regulišu površinu filtracije i fagocitiraju apoptotičke ćelije ili imune komplekse.1 U mnogim glomerularnim bolestima, kao što su mezangijalni proliferativni nefritis i dijabetička nefropata , MC su ozlijeđene i prolaze kroz veliku promjenu u fenotipu, što rezultira nekontroliranom mezangijalnom proliferacijom i prekomjernim taloženjem mezangijalnog matriksa.2-4 Osim hiperproliferacije i povećanja proizvodnje proteina ekstracelularnog matriksa (ECM) i matriksnih metaloproteinaza, MC mogu oslobađaju faktore upale, što rezultira glomerularnom sklerozom i intersticijskom fibrozom; dodatno pogoršavaju oštećenje bubrega i uzrokuju progresiju do ireverzibilne završne bubrežne bolesti.5-Poznavanje MC odgovora na patološke podražaje je ključno za razvoj tretmana za smanjenje oštećenja bubrega uzrokovanog abnormalnom proliferacijom MC i odgađanjem progresije u završni stadijum bubrežne bolesti.

Faktori slični Krüppelu (KLF) su grupa transkripcionih faktora koji vezuju DNK cinkovog prsta. Sve veći broj dokaza ukazuje da je ova porodica uključena u različite ćelijske procese, kao što su diferencijacija ćelija, remodeliranje srca, hematopoeza i određivanje sudbine matičnih ćelija.8-10 Porodica KLF se sastoji od osamnaest članova, među kojima je KLF15 široko rasprostranjen ububreg, pankreas, srce,jetrai skeletnih mišića. Prethodne studije su pokazale da je KLF15 ključni regulator transkripcije u različitim fiziološkim procesima, uključujući glukoneogenezu,imune reakcijei diferencijaciju adipocita.1-14 Naša prethodna studija je pokazala da je KLF15 neophodan za inhibiciju proliferacije MC-a.15 Ova studija je imala za cilj da razjasni direktni ciljni gen i nizvodni mehanizam kojim KLF15 reguliše mezangijalnu proliferaciju.

2|MATERIJALI I METODE

2.1 |Anti-Thy1 model nefritisa

Mužjaci pacova Wistar (Beijing Vital River Laboratory Animal Technology Co., Ltd.) težine između 200 i 220 g nasumično su raspoređeni u kontrolnu i anti-Thy1 grupu. Svi pacovi su smješteni u objektu za njegu životinja u ciklusu svjetlo/mrak od 12/12 sati sa slobodnim pristupom hrani i vodi. Procene i intervencije u vezi sa dobrobiti vršene su tokom eksperimenta. Ukupno, 28 pacova je ubrizgalo mišje anti-Thy1 monoklonsko antitijelo, kao što je prethodno opisano,16 a sedam je dobilo fiziološku otopinu (kontrole). Glomeruli su pročišćeni iz tkiva korteksa bubrega metodom prosijavanja. Serumi su sakupljeni za merenje nivoa azota ureje i kreatinina u serumu. Anti-Thy1 model pacovi su ubijeni u danima O, 3, 5, 7 i 10, a njihovi glomeruli su sakupljeni. Svi postupci za dobrobit životinja i eksperimentalni postupci izvedeni su u strogom skladu sa Vodičem za njegu i korištenje laboratorijskih životinja (SAD National Research Council, 1996).

2.2|Ljudska bubrežna MC (HRMC) kultura i liječenje

Primarni bubrežni HRMC su kupljeni od ScienCell-a (San Diego, CA). HRMC od trećeg do šestog pasusa održavani su u MC Medium (MsCM; ScienCell) prema uputama proizvođača. Za eksperimente, ćelije su uzgajane do konfluencije, zaustavljane rasta u smanjenom serumu (0.5 posto FBS) tokom 24 sata i podijeljene u različite eksperimentalne grupe.

Za tretman sa različitim koncentracijama glukoze, ćelije su inkubirane u MsCM koji sadrži ili 5 mmol/L glukoze (normalna glukoza) ili 30 mmol/L glukoze (visoka glukoza, HG) 48 sati na 37 stepeni C. Ćelije inkubirane pod identičnim eksperimentalnim uslovi sa 5 mmol/L glukoze i 25 mmol/L manitola umjesto 30 mmol/L glukoze korišteni su kao osmotske kontrole. Za tretman sa PDGF-BB, ćelije su inkubirane u MsCM koji sadrži 20 ng/ml PDGF-BB (R&D Systems, Minneapolis, MN) tokom 48 sati na 37 stepeni C.

2.3|Imunohistohemija (IHC)

Tkivo bubrega ugrađeno u parafin je isječeno na 4 μm debljine, a rezovi su obojeni na IHC. Kriške su inkubirane sa 3 posto H, O, kako bi se blokirala endogena peroksidaza nakon deparafinizacije. Nakon preuzimanja i blokiranja antigena, rezovi su inkubirani sa anti-KLF15 (ab81604, Abcam), anti-malim ubikvitinom povezanim modifikatorom 1 (SUMO1, ab32058, Abcam) i anti-PCNA (ab92552, Abcam) antitelima na 4 stepena C Kriške su zatim inkubirane sa sekundarnim antitelom obeleženim peroksidazom hrena na 37 stepeni 30 minuta, a imunohistohemijska reakcija je posmatrana prema uputstvima proizvođača sa 3,3'-diaminobenzidinom (DAB, ORIGINE, CN) kao hromogenim agensom. . Nakon toga, preparati su obojeni hematoksilin-eozinom i snimljeni svjetlosnim mikroskopom (Olympus). Imunohistohemijsko bojenje je procenjeno pomoću softvera Image J prema vrednosti prosečne optičke gustine (AOD).

2.4 |Imunoprecipitacija hromatina (ChlP) s paralelnim sekvenciranjem (ChIP-Seq)

ChIP je izveden korištenjem Simple ChlP Plus Enzymatic Chromatin IP Kit (Magnetic Beads; Cell Signaling Technology) prema protokolu proizvođača. Ukratko, HRMC su bili prekomjerno eksprimirani ili sa KLF15 ili s skremblom pri gustini ćelija od 2.0×10³ ćelija/mL i umreženi sa 1,7 posto formaldehida u PBS-u 5 minuta na sobnoj temperaturi (RT ). Umrežene ćelije su lizirane da bi se dobila nuklearna frakcija, koja je ultrazvučna u 1× ChIP puferu. Lizati su bistreni centrifugiranjem na 9300×g tokom 10 minuta na 4 stepena. Uzorci hromatina su inkubirani ili sa anti-KLF15 antitelom (ab81604, Abcam) ili anti-lgG antitelom (pozadinska kontrola) preko noći na 4 stepena. Kompleksi vezani za antitijela su uhvaćeni inkubacijom sa magnetnim kuglicama proteina G. ChlP-Seq biblioteke za sekvenciranje pripremljene su upotrebom TruSeq ChlP Sample Prep Kit (Illumina). Biblioteke su podvrgnute paralelnom sekvenciranju sa HiSeq2500 sekvencerom (Illumina) koristeći jednostrani protokol dužine sekvenciranja od 50 bp. Neobrađeni podaci sekvenciranja sljedeće generacije (NGS) pretvoreni su u FASTQ datoteke pomoću softvera CASAVA (verzija 1.8.2), a svaki skup podataka je usklađen sa ljudskim referentnim genomom (UCSC hg19) korištenjem Burrows-Wheeler Aligner (verzija 0.7.12) ).17 ChIP-Seq vršno pozivanje je obavljeno pomoću programa MACS2 (verzija 2.0.1) sa zadanim parametrima ali aq vrijednošću od 0,05, sa ulaznim podacima za oduzimanje.18 Poređenje vrha sa šifrovanom kontrolom (roditeljske ćelije) a uzorci prekomerne ekspresije izvedeni su sa Diffbind, R paketom, koristeći DeSeq2 algoritam, a smatralo se da stopa lažnog otkrivanja od 0,1 ukazuje na značaj.1 Superpojačivači su identifikovani iz skupa pikova otkrivenih u DMSO-tretiranim HRMC-ovima sa superpojačivačem softver ROSE.2 stepen ChIP-Seq pikovi su označeni R paketom ChlPpeakAnno, a promoteri su definisani kao KLF15-obogaćene regije unutar 1 kb od mjesta početka transkripcije.21 Gen sa početnim mjestom transkripcije najbližim c unos svakog super-pojačivača je definiran kao ciljni gen tog super-pojačivača.

2.5|ChIP-kvantitativni PCR u realnom vremenu (ChlP-PCR)

ChlP-PCR procedura je bila slična proceduri opisanoj gore. ChIP DNK iz ćelija tretiranih anti-KLF15 antitijelima korištena je za otkrivanje povezanosti između KLF15 i SUMO1. DNK iz ćelija tretiranih anti-lgG antitijelima služila je kao kontrola. Prečišćena DNK je korištena za analizu SUMO1 proksimalnog promotorskog regiona PCR-om u realnom vremenu na ABI PRISM 7600 koristeći SYBR GreenER qPCR Supermix. SUMO1 prajmeri su bili sljedeći: naprijed: 5'-AGCAGCGGTCTTTAGCATCA-3'; revers:5'-TCGGTTAACCAGCACCCCTTG-3'. Relativna amplifikacija promotorske sekvence gena izračunata je pomoću {{18 }}AcT metoda, a normalizacija je izvršena prema 1:100 razblaženju ulazne DNK.

2.6|Obeležavanje ćelija i obeležavanje stabilnih izotopa aminokiselinama u ćelijskoj kulturi (SILAC) analiza

Ćelije sa 15 posto konfluentnosti su zasijane u odgovarajući kompletan medijum (za HRMC: MsCM). Postupci označavanja i SILAC opisani su u prethodnim istraživanjima.22 Ukratko, nakon što su označeni laganim (13C,-obilježenim) ili teškim (15N,-obilježenim) lizinom i laganim (1c-obilježenim) ili teškim (15N-obilježenim) )arginin, ćelije su transficirane plazmidom prekomerne ekspresije KLF15 ili kontrolnim plazmidom. Nakon tretmana, ćelije su tripsinizirane i izbrojane kako bi se dobila ćelijska peleta od 2×10' ćelija/stanje, a ćelije su podvrgnute SILAC analizi korištenjem masene spektrometrije. Pelete teških i lakih ćelija su lizirane u puferu za radioimunoprecipitaciju sa dodacima inhibitorima proteaze i fosfataze upotrebom kratkih 15-drugih rafala ultrazvukom. Lizati su centrifugirani na 14,{16}} o/min 20 minute. Nakon centrifugiranja, supernatanti su sakupljeni, a koncentracija proteina je izmjerena pomoću Hitachi L{18}} analizatora aminokiselina. Alikvoti od 200 ug proteina su pripremljeni iz uzoraka, kombinovani i precipitirani metodom taloženja metanol-hloroform. Proteinske pelete su resuspendirane u 8 mol/L uree/0,4 mol/L amonijum bikarbonatnog pufera, redukovane sa 45 mmol/L DTT 30 minuta na 37 stepeni C, alkilirane sa 100 mmol/L jodoacetamida 30 minuta u mraku na sobnoj temperaturi. i digestiran sa Lys-C proteazom (1:20 w/w) preko noći (~16 sati) na 37 stepeni. Lis-C digestija je dalje razblažena i digestirana tripsinom (1:20 w/w) tokom 8 sati na 37 stepeni. Digestija je odsoljena pomoću MacroSpin kolone (The Nest Group, Inc) i osušena u SpeedVac koncentratoru. Osoljeni peptidi su zatim obogaćeni fosfopeptidima pomoću smole titanijum dioksida ugrađene u vrhove od 10 μL (Glygen Corp). Protoci su rezervisani, a obogaćeni peptidi su eluirani upotrebom omjera amonijum hidroksida prema vodi 1:33. Protočne i eluacijske frakcije osušene SpeedVac su resuspendirane u puferu A (0,1 posto mravlje kiseline u vodi) i podvrgnute analizi tečne hromatografije-tandem masene spektrometrije (LC/MS).

2.7| Dual-luciferase reporter test

Ljudski SUMO1(NM_001005781) promotor divljeg tipa sa 1604bp(-1474nt- plus 129nt) uključujući potencijalno mjesto vezivanja (-205nt--199nt) dobijen je korištenjem PCR-a amplificiraju i subkloniraju u pGL3-Basic vektor (Cat.# E1751 Promega) sa SacI i Bglll restrikcijskim enzimskim mjestima, nazvanim pGL3-WT-SU. Također, mjesto vezivanja-CACCCA-unutar promotora SUMO1 je mutirano u -CGTTTG-, nazvano pGL3-MT-SU. Plazmid (pReceiver-M94) sadržavao je cDNK ljudske KLF15 pune dužine dobijen je iz GeneCopoeie. Plazmid prekomerne ekspresije KLF15 i pGL3-WT-SU ili pGL3-MT-SU transfektovani su u ćelije HEK293T sa Lipofectamine 2000 reagensom. Uzorci su zatim kotransficirani plazmidom pRL-TK(Cat #E2241, Promega) koji eksprimira Renilla luciferazu. Nakon 24 sata transfekcije, ćelije su lizirane. Nivoi aktivnosti luciferaze Firefly i Renilla su ispitani pomoću sistema za analizu dual-luciferase reporter (Biotek).

2.8 Priprema RNK, sinteza cDNK i RT-qPCR analiza

Ukupna RNA je ekstrahirana upotrebom TRlzola (Invitrogen) i pročišćena korištenjem RNeasy Mini Kit (Qiagen) prema uputama proizvođača. cDNA je generirana korištenjem kompleta za sintezu cDNK prvog lanca ProtoScript (New England Biolabs. Kvantitativni PCR je izveden korištenjem Power SYBR Green Master Mix-a (Life Technologies). Oligonukleotidne sekvence korištene za RT-qPCR su date u Tabeli 1.

2.9 |Test ćelijske proliferacije

Ljudska SUMO1 cDNK (NM_003352.8) pune dužine dobijena od OriGene Technologies (Peking, Kina) je ubačena u pCMV6-Entry plazmid (CAT#: RC200633). Proliferacija ćelija je analizirana pomoću Click-iT⑧ Plus EdU Alexa Fluor⑧555 Imaging Kit (Invitrogen) prema uputstvima proizvođača. Ukratko, ćelije su inkubirane u 6-ploči za kulturu i transficirane sa KLF15 kontrolnim plazmidom (Scramble, grupa VECTOR), KLF15 plazmidom prekomjerne ekspresije (isto gore, KLF15 grupa), vektorom ekspresije za SUMO1 (grupa VECTOR), plazmid prekomerne ekspresije SUMO1 (SUMO1 grupa), negativna kontrola siRNA (grupa SI CON), SUMO1 siRNA (grupa SI SUMO1), plazmid prekomerne ekspresije KLF15 sa SUMO1 siRNA (grupa KLF15 plus SI SUMO1) ili plazmid prekomerne ekspresije KLF15 sa negativnom kontrolom siRNA (KLF15 plus SICONgroup) tokom 24 sata. Zatim je medijum zamenjen medijumom sa dodatkom 20 ng/mL PDGF-BB tokom 48 sati, a optimizovana koncentracija EdU od 10 μmol/L dodata je oko 12 sati pre stimulacije PDGF-BB. Nakon tretmana, ćelije su fiksirane sa 4% formaldehida, permeabilizirane sa 0,5% Triton X-100, isprane sa 3% BSA u PBS, inkubirane sa Click-iT⑧ reakcionim koktelom 30 minuta na sobnoj temperaturi i inkubirane sa DAPIre-action pufer 10 minuta na sobnoj temperaturi zaštićen od svjetlosti. Ćelije su posmatrane fluorescentnom mikroskopom (Olimp, Tokio, Japan). Jezgra ćelija koje se razmnožavaju tada su obojene crvenom bojom.

2.10|Western blot analiza i imunoprecipitacija (IP)

Ćelije su lizirane korištenjem RIPA pufera (Thermo Scientific), a ukupni protein u supernatantima je kvantificiran korištenjem kompleta za analizu BCA proteina (Thermo Scientific). Western blot analiza i IP su obavljeni kao što je prethodno opisano. 23.24 Anti-KLF15 antitijelo (AV32587, Merk), anti-SUMO1 antitijelo (S8070, Merk) i anti- -aktin (A5316, Sigma) korišteni su za Western blot analizu. Anti-P53 antitelo (P5813, Merk) je korišćeno za IP analizu.

2.11 |Bioinformatička analiza

Kandidati iz ChIP-Seq ili SILAC pokazali su najmanje dvostruko obogaćenje u odnosu na kontrole. Analiza genske ontologije (GO) izvedena je sa bazom podataka za anotaciju, vizualizaciju i integrisano otkrivanje (DAVID; verzija 6.7). P-vrijednosti su prilagođene za testiranje više hipoteza korištenjem Benjamini-Hochbergove metode. Značajno obogaćene kategorije u funkcijskoj subontologiji i KEGG putevima s prilagođenom P-vrijednošću<.05 were="" chosen.="" ingenuity="" pathway="" analysis="" (ipa)="" of="" 52="" intersecting="" genes="" or="" proteins="" between="" chlp-seq="" and="" silac="" was="" performed="" on="" the="" qiagen="" ipa="" platform(https://digitalinsights.qiagen.com/),="" and="" the="" motifs="" in="" the="" target="" genes="" were="" analyzed="" using="" meme="" suite="" 5.3.0.="">

2.12|Statistička analiza

Svi eksperimenti su izvedeni u tri primjerka, a rezultati su izraženi kao srednja vrijednost ± SE. Svi podaci su analizirani korištenjem SPSS softvera (ver.20.0; SPSS Inc) i upoređeni korištenjem Studentovog t-testa ili jednosmjerne ANOVA. P-vrijednost<.05 was="" considered="" to="" reflect="" statistical="">