Uvjetni nokaut miševi karboksipeptidaze E pokazuju nedostatke učenja i pamćenja te neurodegeneraciju 1. dio

Karboksipeptidaza E (CPE) je multifunkcionalni protein sa mnogim neenzimskim funkcijama u različitim sistemima. Prethodne studije koje su koristile CPE nokaut miševe pokazale su da CPE ima neuroprotektivne efekte protiv stresa i da je uključen u učenje i pamćenje.

Otpornost na stres i pamćenje su dva neodvojiva aspekta. Bilo da je u pitanju posao, učenje ili život, suočićemo se sa svim vrstama pritiska. Ponekad se zbog ovih stresova osjećamo depresivno, tjeskobno, umorno, pa čak i utjecati na naše pamćenje. U ovom slučaju, moramo pronaći neke načine da poboljšamo otpornost na stres i pamćenje.

Prvo, poboljšanje tolerancije na stres može se postići vježbanjem. Istraživanja pokazuju da vježbanje može pomoći ljudima da smanje anksioznost i depresiju. Osim toga, odgovarajuća tjelovježba također može potaknuti metabolizam, poboljšati san i poboljšati fizičku kondiciju. Sve ovo pomaže poboljšanju naše tolerancije na stres i pamćenja.

Drugo, psihološko savjetovanje je također efikasno sredstvo za poboljšanje otpornosti na stres. Kada naiđete na poteškoće i zastoje, odmah komunicirajte sa porodicom ili prijateljima kako biste oslobodili svoje unutrašnje loše emocije i smanjili psihičko opterećenje, kako biste se bolje suočili s pritiskom i izazovima.

Osim toga, dobre navike spavanja su također neophodne za poboljšanje pamćenja i otpornosti na stres. Loš san može dovesti do fizičkog umora, depresije i gubitka pamćenja. Stoga moramo razviti dobre navike spavanja, osigurati odgovarajuće vrijeme za spavanje svake noći i osigurati kvalitet sna.

Konačno, pozitivan stav je takođe ključan. Morate zadržati dobar stav, nastaviti učiti i usavršavati svoje vještine, aktivno se suočavati s izazovima, održavati optimističan stav kada se suočavate s poteškoćama i vjerovati da možete prevladati pritisak i postići uspjeh.

Ukratko, otpornost na stres i pamćenje su dva blisko povezana aspekta. Vježbanjem, psihološkim savjetovanjem, dobrim navikama spavanja i pozitivnim stavom možemo efikasno poboljšati našu sposobnost da izdržimo stres i pamćenje, te bolje da se suočimo s raznim izazovima u životu i poslu. Vidi se da moramo poboljšati pamćenje, a cistanche deserticola može značajno poboljšati pamćenje jer je cistanche deserticola tradicionalni kineski ljekoviti materijal koji ima mnogo jedinstvenih učinaka, od kojih je jedno poboljšanje pamćenja. Djelotvornost mljevenog mesa proizlazi iz različitih aktivnih sastojaka koje sadrži, uključujući kiselinu, polisaharide, flavonoide, itd. Ovi sastojci mogu promovirati zdravlje mozga na različite načine.

Kliknite na saznajte 10 načina za poboljšanje memorije

Međutim, funkcije CPE u neuronima još uvijek su uglavnom nepoznate. Ovdje smo koristili Camk2a-Cre sistem za uslovno nokautiranje CPE ineurona. Miševi divljeg tipa, CPEflox/− i CPEflox/flox su odbačeni, označeni ušima i podrezani rep za genotipizaciju u dobi od 3 sedmice, a podvrgnuti su testovima na otvorenom terenu, prepoznavanju objekata, Y-labirintu i strahu u 8. nedeljama star.

CPEflox/flox miševi su imali normalnu tjelesnu težinu i metabolizam glukoze. Testovi ponašanja su pokazali da su CPEflox/flox miševi imali oslabljeno učenje i pamćenje u poređenju sa divljim i CPEflox/- miševima. Iznenađujuće, subiculum (Sub) regija CPEflox/flox miševa je bila potpuno degenerirana, za razliku od CPE full nockout miša, koji pokazuju neurodegeneraciju CA3 regije. Osim toga, imunobojenje dvostrukim kortinom sugerira da je neurogeneza u dentat gyrusu hipokampusa značajno smanjena kod CPEflox/flox miševa.

Zanimljivo je da je TrkBfosforilacija u hipokampusu bila smanjena kod CPEflox/flox miševa, ali nivoi neurotrofnih faktora iz mozga nisu. I u hipokampusu i u dorzalnom medijalnom prefrontalnom korteksu, uočili smo smanjenu ekspresiju MAP2 i GFAP kod CPEflox/flox miševa. Sve zajedno, rezultati ove studije pokazuju da specifičan neuronski CPE nokaut dovodi do disfunkcije centralnog nervnog sistema miševa, uključujući deficite učenja i pamćenja, subdegeneraciju hipokampusa i oštećenu neurogenezu.

UVOD

Karboksipeptidaza E (CPE), također poznata kao neurotrofni faktor- 1, je multifunkcionalni protein sa mnogim esencijalnim neenzimskim funkcijama u endokrinom i nervnom sistemu [1]. CPE je obogaćen zrelim sekretornim vezikulama i igra ključnu ulogu u biosintezi peptidnih hormona i neuropeptida [2]. CPE također djeluje kao receptor za sortiranje mnogih proproteina, uključujući proinzulin, proenkefalin, pro-opiomelanokortin i neurotrofni faktor koji potiče od mozga (pro-BDNF) [3].

Prirodna mutacija fenotipa gojaznosti miša, nazvana "mast", mapirana je na CPE gen [4]. Naknadna studija je pokazala da su miševi CPEfat/fat i CPE-knockout (KO) pokazali slične fenotipove, uključujući neplodnost i gojaznost odraslih [5]. Prijavljeno je da ljudski CPE gen ima mutacije, uključujući nulte mutacije, mutacije koje daju skraćene proteine ​​i one sa eliminiranim ključnim katalitičkim ostacima [6].

Homozigotne osobe sa teškim mutacijama su morbidno gojazne i imaju hipogonadizam. Osim toga, CPE missense polimorfizam je pronađen kod pacijenata sa dijabetesom tipa 2. Mutacija mijenja aktivnost CPE enzima, a pacijenti pokazuju ranu pojavu dijabetesa tipa 2 [7]. Nadalje, CPE igra važnu ulogu u vezikularnom transportu, kao što je prikazano u neuronima i sinapsama hipokampusa [8].

Prethodne studije su pokazale da se visoki nivoi CPE eksprimiraju u hipokampusu i imaju neurotrofičku ulogu neovisno o njegovoj enzimskoj aktivnosti u zaštiti od smrti piramidalnih neurona izazvanih stresom i kognitivnih oštećenja [9, 10]. Stres narušava strukturu i funkciju niza regije mozga [11].

Prefrontalni korteks (PFC) je glavna neuropatološka meta stresa, koji je povezan sa brojnim kortikalnim i subkortikalnim regionima i doprinosi kognitivnim funkcijama[12, 13]. Dorzalni medijalni PFC (dmPFC) uključuje rostralanteriornu cingulatnu koru i prelimbički korteks, koji su regije uključene u modulaciju bola, emocija i kognicije. Pokazalo se da funkcionalna inaktivacija dmPFC-a izaziva negativne emocije i smanjuje kognitivnu sposobnost [14]. Aktivnost dmPFC neurona prenosi informacije o prošlim izborima i ishodima, a uklanjanje dmPFC-a ili inaktivacija narušava vođenje signala [15].

Osim toga, stres dovodi do oštećenja neuronskih mreža, kognitivne disfunkcije, degeneracije hipokampusa i smanjene neurogeneze [10]. Piramidalni neuroni u dmPFC-u i hipokampusu pokazuju atrofični stres, a psihosocijalni stres i stres sputavanja izazivaju atrofiju unutar otprilike 3-4 sedmice [11, 16]. Temorfološke promjene variraju u zavisnosti od regije mozga. Hronični stres dovodi do dendritske retrakcije i smanjuje gustinu kičmene kičme u prelimbičkom području dmPFC-a i hipokampusa [17].

Smanjenje složenosti apikalnih dendrita hipokampusa uzrokovano stresom je u skladu s oštećenim funkcijama hipokampusa, kao što su učenje i pamćenje [18]. Osim toga, neuronske ozljede i apoptoza u CA3 regiji dovode do deficita prostorne memorije [19]. U ponašanju je otkriveno da stres narušava različite funkcije zavisne od hipokampusa, kao što je pamćenje [20].

CPE se modulira pod različitim vrstama stresa i važan je u zaštiti neurona. Neuroni u hipokampusu i korteksu pojačavaju ekspresiju CPE nakon ishemijskog stresa, što je povezano sa preživljavanjem neurona [21].

Osim toga, nakon što su miševi CPEknockout (KO) primili paradigmu stresa kada su bili odbačeni od nje u dobi od 3 sedmice, pokazali su degeneraciju CA3 regije i smanjenu neurogenezu u dentat gyrusu (DG)[1, 22].

U ovoj studiji koristili smo uobičajeni za neurone specifičan Camk2aCre sistem za brisanje CPE neurona. Generirali smo CPE uslovniKO (cKO) mišji model za proučavanje fenotipa gubitka funkcije CPE u neuronima mozga. Procijenili smo učinak paradigme stresa (odbijene, označene ušima i podrezani rep) na 3 sedmice starosti na CPE-cKO miševe. Koristili smo prepoznavanje objekata, Y lavirint i testove za uslovljavanje straha u dobi od 8-10 sedmica da bismo procijenili kognitivne performanse. Osim toga, analizirali smo fenotipove neurona i astrocita, kao i neurogenezu u hipokampusu.

METODE

Životinje

Camk2a-Cre miševi i CPEflox/flox miševi su dobijeni od CyagenBiosciences (Suzhou, Kina). Sve životinje su bile smještene na temperaturi okoline (22 stepena ± 2 stepena) sa prirodnim ciklusom svjetlosti/mraka i omogućen slobodan pristup čistoj vodi i standardnoj hrani za glodare. Camk2a-Cre i CPEflox/floxmice se nazivaju CPE-cKO miševi. U dobi od 3 sedmice, miševi su odbačeni, obilježeni ušima i podrezani repovi za genotipizaciju, što je izazvalo paradigmu emocionalnog i fizičkog stresa. Pozivamo se na Camk2a-Cre; CPEflox/flox miševi kao CPEcKO, Camk2a-Cre; CPEflox/− miševi kao heterozigoti (HE), i CPE−/− miševi kao divlji tip (WT). Sve eksperimentalne procedure za životinje odobrene su od strane Komiteta za eksperimentalnu etiku životinja na Univerzitetu Minzu u Kini.

Lančana reakcija polimeraze (PCR)

Odrezani repovi su sakupljeni kako bi se izolirala DNK za PCR kako bi se identificirao genotip. Sekvence prajmera su sledeće:

Telesna težina

WT, CPEflox/− i CPEflox/flox miševi (1-20 sedmica starosti; n=10 za svaki genotip) vagani su svake sedmice, što je korišteno za određivanje promjena težine. Težina svakog miša je prosječna za svaku grupu.

Glukoza u plazmi

Venska krv iz repova miša je sakupljena i detektirana pomoću sistema za praćenje glukoze u krvi (Yuwell, Kina) nakon 12 h gladovanja. Uzorci krvi su uzeti iz kaudalne vene na 0 min za glukozu u plazmi natašte. Zatim je svakom mišu intraperitonealno ubrizgan 1 g/kg rastvora glukoze. Zatim smo određivali nivo glukoze u plazmi za 15, 30, 60, 90 i 120 minuta da bismo izmerili nivo glukoze u krvi.

Testovi ponašanja

Da bi se procijenilo ponašanje miševa WT, CPEflox/− i CPEflox/flox, životinje stare 8–10- sedmica su podvrgnute testovima na otvorenom polju, prepoznavanju objekata, Y lavirintu i strahu.

Otvoreno polje

Istraživačko ponašanje mjereno je aparatom na otvorenom (50 × 50 × 40 cm). Svaka životinja je stavljena na jedan ugao aparata i mjerena 7 minuta. Prijeđena udaljenost zabilježena je u posljednjih 5 minuta pomoću video-imaging sistema (Taimeng, Chengdu, Kina).

Prepoznavanje objekata

Test prepoznavanja objekata korišten je za testiranje učenja i pamćenja kod miševa. Na dan treninga dva identična objekta postavljena su na dijagonalu aparata (50 × 50 × 40 cm). Životinjama je dozvoljeno da slobodno istražuju 7 minuta. Za proceduru testiranja, jedan objekt je zamijenjen novim objektom na istoj dijagonali kao i dan obuke. Životinjama je dozvoljeno da slobodno istražuju 7 minuta. Vrijeme istraživanja na 2–3 cm oko novog objekta zabilježeno je u posljednjih 5 min.

Y maze

Istraživačka aktivnost i radna memorija mjereni su pomoću Y-mazeaparata (dužina ruke: 30 cm, širina ruke: 6 cm, visina zida: 15 cm). Svaka životinja je postavljena u središnji dio. Broj i promjene ulazaka u ruke snimani su u trajanju od 7 minuta sa video-imaging sistemom (Taimeng, Chengdu, Kina). Rezultat je izračunat kao broj korekcije/ukupni ulazni broj ruke.

Uslovljavanje straha

Kondicioniranje straha sastojalo se od dvije komore, a kutija za zamrzavanje (23 × 23 × 30 cm) smještena je u veću zvučno izoliranu prostoriju (30 × 30 × 37 cm). Kutija za zamrzavanje sadržavala je metalnu rešetku za šok stopala, a zabilježeni su vertikalni i horizontalni pokreti životinja. Prvi dan je bio trening uslovnih refleksa. Procedura je bila sljedeća: neaktivnost 60 s, a zatim stimulacija 12 puta.

Sadržaj stimulacije je uključivao uslovljeni stimulus od 30 s (75 dB), nakon čega je slijedio interval traga (30 s), a završio se sa šokom stopala od 2 s (30 mA) i 15 s neaktivnosti. Šest sati kasnije, sproveden je test kratkoročnog pamćenja, a broj stimulusa je smanjen na 6. Tokom procesa stimulacije, svaki pokus se sastojao od uslovljenog stimulusa praćenog intervalom u tragovima (30 sekundi) i završavao se bez ispoljavanja šoka stopala.

Test dugotrajnog pamćenja obavljen je sljedećeg dana u intervalu od jednog dana. Metoda je bila ista kao ona za kratkoročno pamćenje za mjerenje kvaliteta dugoročnog pamćenja.

For more information:1950477648nn@gmail.com