Može li ekstrakt Cistanche Deserticola potaknuti imunološki odgovor?

Kontakt:joanna.jia@wecistanche.com/ WhatsApp: 008618081934791

Shuangshuang Feng a,1, Xiumei Yang a, Xiang Weng a,1, Bin Wang b, Ailian Zhang a,*

Ključna laboratorija za biološke resurse i genetičko inženjerstvo Xinjianga, College of Life Science and Technology, Xinjiang University, Urumqi, 830046, Xinjiang, Kina

b Ključna laboratorija medicinske molekularne virusologije, Škola osnovnih medicinskih nauka, Šangajski medicinski fakultet, Univerzitet Fudan, Šangaj, 200032, Kina

Etnofarmakološka relevantnost:Biljni polisaharidi su pokazali veliki potencijal za jačanje imuniteta. Adjuvansi su ključno sredstvo za razvoj efikasnih vakcina. U našoj prethodnoj studiji, polisaharid rastvorljiv u vodi ekstrahovan iz divljineCistanchedeserticolaYC Ma je ​​pokazao snažnu imunostimulirajuću aktivnost.

Cilj studije:U ovoj studiji su imuni profili i efikasnost vodenih ekstrakata kultivisanaCistanchedeserticolaYC Ma (AECCD) na ICR miševima protiv ovalbumina (OVA) su istraživani. U in vitro eksperimentima, procijenjen je mogući mehanizam DC aktivacije pomoću AECCD.

Materijali i metode:AECCD su ekstrahovani toplom vodom nakon čega su sirovi polisaharidi precipitirani etanolom. Miševi su prvo supkutano imunizirani samo OVA (10 ug po mišu) ili OVA (10 ug po mišu) koji sadrže različite doze AECCD (200, 400 i 800 ug po mišu) 1. i 14. dana i veličinom i kinetikom zatim su procijenjena antitijela i odgovori posredovani ćelijama.

Rezultati:AECCD je izazvao snažne i dugotrajne IgG odgovore sa mješovitim Th1/Th2 odgovorima i povišenim nivoima citokina povezanih s Th (CD4 plus IL-4, CD4 plus IFN- i CD8 plus IFN-). Štaviše, AECCD je izazvao jaku ćelijuimunodgovorkarakterizirana povećanom proliferacijom splenocita kao i aktiviranim odgovorom T stanica. Značajno je da je AECCD značajno poboljšao sazrijevanje dendritskih ćelija (DC) i inhibirao Tregove. Eksperimenti in vitro, preliminarni testovi su pokazali da je AECCD inducirao DC aktivaciju promovišući fenotipsko sazrijevanje, sekciju citokina i alostimulatornu aktivnost. Toll-like receptor 4 (TLR4) bio je esencijalni receptor za DC da direktno vežu AECCD. Inhibitori NF-κB su smanjili nivoe ekspresije CD40, CD80, CD86 i MHC-II i proizvodnju IFN-, TNF- i IL-6 preko DCS.

Zaključci:Konačno, ovi nalazi sugeriraju da bi AECCD mogao izazvati moćne i trajne antigen-specifičneimunodgovoreputem DC aktivacije, koja je bila uključena u regulaciju markera sazrijevanja i ekspresije citokina putem NF-κB puta povezanog s TLR4-. Studija pokazuje da je AECCD potencijalni imunomodulator.

Ključne riječi:Polisaharidni adjuvans Kultivisan,Cistanchedeserticola, imunomodulator, dendritske ćelije Toll-like receptor 4, NF-κB signalni put

Cistanche deserticolaekstrakt promoviraimunodgovor

1. Uvod

Mnoge studije sugeriraju da pomoćna sredstva mogu poboljšati efikasnost vakcina protiv različitih zaraznih bolesti kao što su HIV, COVID{0}}, gripa i slinavka i šapa (Cao et al., 2020.; Giuseppe et al., 2018. ). Adjuvansi mogu izazvati različite vrste i veličineimunodgovore, tako da prikladno odabran adjuvans može induciratiimunodgovorpotrebno za dati patogen ili antigen (Reed et al., 2013). Prirodni zeljasti ekstrakti odavno se široko koriste u svakodnevnom životu ili zdravstvu. U mnogim slučajevima, tradicionalna kineska medicina (TCM) i njene aktivne komponente, posebno višestruki adjuvansi iz TCM polisaharida, značajno su poboljšali efikasnost vakcina. TCM polisaharidi (Advax™, Astragalus polisaharid, Ginseng polisaharid, Lycium barbarum polisaharid i Ganoderma lucidum polisaharid) imali su nekoliko prednosti u odnosu na druge adjuvanse, kao što su bolja sigurnost, biokompatibilnost, snažno jačanje imuniteta, i niska reakcija na reagovanje 2 i 105; et al., 2020). Prema tome, spojevi i formulacije na bazi TCM polisaharida imaju potencijal kao pomoćni kandidati.

Cistanche deserticolaYC Ma (Roucongrong na kineskom) je tradicionalna kineska medicina zabilježena u kineskoj farmakopeji i korištena je kao tonik hrana stotinama godina u Kini (Kineska farmakopejska komisija, 1992.). Moderne farmakološke studije pokazale su njegovu višestruku farmakološku i imunomodulatornu primjenu (Dong et al., 2007; Fu et al., 2017). U našoj prethodnoj studiji, sirovi polisaharidi dobiveni iz divljineCistanchedeserticolaYC Ma promovira humoralne i ćelijske odgovore specifične za antigen i regulira sazrijevanje dendritskih stanica (DC) (Zhang et al., 2018; Zhao et al., 2019). Međutim, divljeCistanchedeserticolaYC Ma je ​​pretjerano istražen i naveden kao ugrožena vrsta.CistanchedeserticolaYC Ma je ​​zasađen u velikom obimu i naširoko se koristi u razvoju i primjeni TCM resursa. Međutim, adjuvantni potencijal se uzgajaCistanchedeserticolaYC Ma još uvijek nije jasno.

DCS su esencijalni regulatori protiv zaraznih bolesti. Nakon što se DC aktiviraju, površinske molekule i proinflamatorni citokini na DC stupaju u interakciju s odgovarajućim receptorima kako bi aktivirali T stanice i izazvali antigen-specifične odgovore i proizvodnju citokina koji usmjeravaju adaptivneimunodgovore(Banchereau i Steinman, 1998). Prijavljeno je da receptor 4 (TLR4) sličan toll-u na DC funkcionira kao važan polisaharidni receptor (Park et al., 2014; Qi et al., 2016). Zaista, mnogi polisaharidi mogu direktno ili indirektno stupiti u interakciju s TLR4 na DC kako bi aktivirali nizvodni nuklearni faktor-kappa B (NF-κB), koji može inducirati ekspresiju različitih proinflamatornih gena kao što su IFN-, TNF- i IL{{11 }} i upalni odgovor na eliminaciju patogena (Tian et al., 2019.; Zhou et al., 2017.; Zhu et al., 2013.). Stoga su DCS i NF-κB opsežno proučavani kao potencijalne mete za terapiju bolesti.

U studiji, sa in vivo (ICR miševi) strategijom, prvo smo procijenili imunostimulirajuće efekte vodenih ekstrakata kultiviranihCistanchedeserticolaYC Ma (AECCD) sa različitim dozama (niskim, srednjim i visokim) za izazivanje animunodgovorprotiv OVA i objasniti in vitro način za aktiviranje DC-a i nizvodnih puteva povezanih s receptorima. Uz model miša, otkrili smo da je AECCD promovirao dugotrajni odgovor antitijela s povećanim titrom IgG i ćelijskimimunodgovor. Važno je da je AECCD inducirao citokine povezane s Th, posebno proizvodnju IFN-a, što je dovelo do Th1 odgovora na infekcije. Učinak indukcije bio je usko povezan s pojačanim sazrijevanjem DC i smanjenim Tregs. Mehanički, AECCD je promovisao DC aktivaciju putem NF-κB puta povezanog sa TLR4-. Ukratko, studija je potvrdila moćnu pomoćnu aktivnost AECCD-a u promoviranju adaptivnog odgovora. Studija je postavila temelje za razvoj AECCD polisaharidnih adjuvansa.

2. Materijali i metode

2.1. Reagensi

Ovalbumin (OVA), 3-(4, 5-dimetiltiazol-2-il)-2, 5-difeniltetrazolijum bromid (MTT), polimiksin B (PMB), konkanavalin A (ConA), lipopolisaharid (LPS), mitomicin C i 3,3′,5,5′-tetrametilbenzidin (TMB) dobijeni su od Sigme (SAD). Fetalni goveđi serum (FBS) kupljen je od Biološke industrije. Komplet za brojanje ćelija-8 (CCK-8) je kupljen od Biosharp-a (Kina). Konjugati protiv miša IgG/IgG1/IgG2a-HRP su iz Southern Biotech (SAD). Inject Alum je bio iz Thermo Scientific Piercea (SAD). GM-CSF je bio iz Peprotech-a (SAD). Fluorescentno obeležena antitela (anti-CD3-PE, anti-CD4-APC, anti-CD8a-FITC, anti-CD44-PE, anti-CD62L-PE, anti-MHCII -FITC/Percp-cy5.5, anti-IL-4-PE, anti–IFN– -PE, anti-CD86-APC, anti-CD40-FITC/PE, anti- CD11c-PE/FITC, anti-CD80-APC), Golgistop, Cytofix/Cytoperm i Perm/Wash pufer su svi iz BD Bioscience (SAD). Regulatorni komplet za bojenje T-ćelija bio je iz eBiosciences (SAD). TAK-242 je bio iz MedchemExpress-a (Šangaj, Kina). PDTC je bio iz Beyotime Biotechnology (Kina). Komplet za analizu protoka multianalita bio je iz Biolegend-a (SAD).

2.2. Priprema AECCD C. deserticola

(Uzorak vaučera br. CD10041602) identifikovao je profesor Jiang He. AECCD je dobiven ekstrakcijom vode, precipitacijom etanolom i metodom deproteinizacije uz neke manje modifikacije (Zhang et al., 2018). Ukratko, kultivisanoCistanchedeserticolaje prvo ekstrahiran vodom više puta, a zatim su sirovi polisaharidi preko noći taloženi dodavanjem etanola u volumnom odnosu 1:4. Zatim su dobiveni sirovi polisaharidi deproteinizirani metodom Sevag (Liu et al., 2012). Metodom antron-sumporne kiseline otkriveno je da je ukupan sadržaj šećera 76,82 posto (Dubois et al., 1951).

2.3. Infracrvena spektroskopska analiza

Za potrebe analize organskih funkcionalnih grupa, AECCD sa KBr je presovan u pelete za merenje infracrvenog (IR) spektra. IR spektri uzoraka određivani su unutar 4000–400 cm−1.

Cistancheherbapromoviratiimunodgovor

2.4. Eksperimenti in vivo

2.4.1. Imunizacija životinja

Ženke miševa C57BL/6 i ICR miševa (stari 6 sedmica) sa Medicinskog univerziteta Xinjiang (Urumqi, Kina) aklimatizirane su 3 dana. Svi eksperimentalni postupci sprovedeni su u skladu sa propisima Komiteta za etiku eksperimenata na životinjama Ključne laboratorije za biološke resurse i genetski inženjering Xinjiang Univerziteta Xinjiang (BRGE-AE001).

Miševi su subkutano imunizirani samo OVA ili OVA s različitim koncentracijama AECCD i pojačani 14. dana prema različitim grupama kako slijedi (6 miševa u svakoj grupi): Kontrolna grupa (0.9 posto NaCl), OVA grupa ( 10 ug OVA), AECCD-H grupa (AECCD 800 ug), OVA/ AECCD-L grupa (10 ug OVA, AECCD 200 ug), OVA/AECCD-M grupa (10 ug OVA, AECCD 400 ug ), OVA/AECCD-H grupa (10 ug OVA, AECCD 800 ug) i OVA/Alum grupa (10 ug OVA, Alum100 ug). Formulacije vakcine u 100 μL 0,9 posto NaCl ubrizgane su na dva različita mjesta (50 μL na svakom mjestu) na koži leđa svakog miša. Nakon vakcinacije, uzeti su uzorci krvi iz retro-orbitalnog pleksusa, a serumi su uzeti i pohranjeni na -80 ◦C za dalju analizu detekcije IgG. Proliferacija splenocita i detekcija citokina, podskupina T ćelija, površinskih markera DC-a i Treg-ova sprovedeni su nakon istog protokola vakcinacije.

2.4.2. Analiza antitela

Titri IgG u serumu protiv OVA određivani su ELISA-om 14., 28., 42. i 56. dana nakon prethodno spomenute primarne vakcinacije (Zhang et al., 2018). IgG1 i IgG2a su izmjereni 21. dana. Apsorbancija na 450 nm/630 nm je dobijena korištenjem čitača (Bio-Rad, SAD). Rezultati odgovora antitijela su izraženi kao IgG titri, a IgG1 i IgG2a izotipovi su izraženi kao odgovarajuće apsorbancije.

2.4.3. Test proliferacije splenocita

Test proliferacije splenocita kod miševa je izveden sa kompletom za analizu CCK-8 prema uputstvima proizvođača. 21. dana nakon prve imunizacije, splenociti su izolovani iz slezene imuniziranih miševa, a eritrociti su lizirani nakon mljevenja. Splenociti (1 × 106 ćelija/jažici) su stimulirani sa OVA (10 ug/mL), OVA323-339 (10 ug/mL), ConA (10 ug/mL) i LPS (10 ug/mL) za dva dana i prazne ćelije su korištene kao kontrola. Aktivnost proliferacije izražena je kao indeks stimulacije (SI), koji je izračunat omjerom apsorpcije stimulirane ćelije prema nestimuliranoj ćeliji na talasnoj dužini od 570/630 nm.

2.4.4. Analiza fenotipizacije T-limfocita u drenirajućim limfnim čvorovima i slezeni

Suspenzije splenocita iz limfnih čvorova i slezene imuniziranih miševa dobivene su prema gore navedenoj metodi (Zhang et al., 2018). Nakon ispiranja, uzorci (1 × 106 ćelija/jažici) su obojeni 30 minuta antitijelima za površinske markere, uključujući anti-CD{{5}PE, anti-CD4-APC, anti-CD8a-FITC, anti-CD44-PE i anti-CD62L-PE. Nivoi T-limfocita su ispitivani protočnom citometrijom. Rezultati fenotipova T-limfocita izraženi su kao procenti CD4 plus T ćelija (procenti), CD8 plus T ćelije (procenti), CD44 plus T ćelije (procenti) i CD62L plus (procenti) T ćelije.

2.4.5. Protočna citometrijska analiza nivoa citokina

Za potrebe analize intracelularnog bojenja citokina, limfociti slezene su odvojeni i obrađeni u jednoćelijsku suspenziju 21. dana nakon prve imunizacije (Zhang et al., 2017). Uzorci (2 × 106 ćelija/mL) stimulisani sa OVA (10 ug/mL) su inkubirani 4 h. Golgistop je naknadno dodan 12 h. Uzorci su zatim isprani, blokirani i obojeni anti-CD4-APC ili anti-CD8a-FITC antitelima tokom 30 minuta. Nakon fiksacije i permeabilizacije sa Cyto fix/Cytopermom, uzorci su zatim označeni anti-IL-4-PE ili anti –IFN–-PE antitijelima. Urađena je analiza protoka da bi se odredio nivo citokina.

2.4.6. Procjena DC aktivacije i Treg ćelija u slezeni

Istražiti da li DC i Tregs igraju ulogu u poboljšanomimunodgovorprotiv OVA, 3. dana nakon prve vakcinacije, sakupljeni su limfociti slezene od imuniziranih miševa za procjenu sazrijevanja DC (Zhang et al., 2017). Ćelije su respektivno blokirane i inkubirane sa anti-CD11c-PE/FITC, anti-CD40-PE, anti-CD{{8}APC, anti-CD80-APC i anti-MHCII- FITC 30 min. Ćelije su analizirane protočnom citometrijom. Dana 21. nakon prve imunizacije, Tregovi su testirani sa kompletom za bojenje T-ćelija miša sa regulatornim tijelom. Splenociti su obojeni anti-CD4-FITC za markere ćelijske površine, nakon čega je uslijedilo intracelularno bojenje anti-CD25-APC i anti-Foxp3-PE prema uputstvima proizvođača. Nivo CD4 plus CD25 plus Foxp3 plus ćelija određen je protočnom citometrijom.

Cistanche biljka ekstrakt podstiče animunodgovor

2.5. In vitro eksperimenti

2.5.1. Stvaranje DC-a, vitalnost ćelija i nivoi endotoksina

DC izvedeni iz koštane srži C57BL/6 miševa su dobijeni prema prethodno opisanoj metodi (Inaba et al., 1992). Ukratko, ćelije su kultivisane sa RPMI-1640 kompletnom podlogom (20 ng/mL GM-CSF i 5 ng/mL IL-4). Nakon šest dana, sve suspendirane ćelije su sakupljene kao nezrele DC za naredne analize. Protočnom citometrijom utvrđeno je da je postotak CD11c plus DC u neadherentnim stanicama 94 posto.

Vijabilnost ćelija DC-a i splenocita miševa nakon AECCD-a je detektirana sa kompletom CCK{{0}} prema uputstvima proizvođača. Ćelije iz DCS-a i splenocita su dobijene i zatim stimulirane različitim koncentracijama AECCD (0, 10, 100, 400, 800 i 1600 ug/mL). Vijabilnost ćelija je izražena kao omjer apsorbancije tretirane grupe prema apsorbanciji kontrolne grupe) × 100 posto.

U svrhu isključivanja efekta endotoksina na AECCD, nakon što su AECCD (100, 200 i 400 ug/mL) i LPS (100 ng/mL) prethodno tretirani PMB (100 ug/mL) 60 min, DC (5 × 105 ćelija/mL) inkubirano je sa prethodno tretiranim AECCD (100, 200 i 400 ug/mL) i LPS tokom 12 h. Nakon gore navedenog tretmana, procijenjeni su nivoi CD40, CD{13}}, CD80 i MHCII.

2.5.2. Analiza DC fenotipa

Određeni su nivoi kostimulatornih molekula za procjenu sazrijevanja kroz in vitro eksperimente. Šestog dana, DC su tretirani AECCD (20, 100, 200 i 400 ug/mL) ili LPS (100 ng/mL) tokom 12 sati. Zatim su DC obojeni površinskim molekulima i analizirani protočnom citometrijom.

2.5.3. Proizvodnja citokina od strane DC in vitro

Supernatant ćelijske kulture je sakupljen kako bi se izmjerio nivo citokina korištenjem ELISA kompleta ili kompleta za analizu protoka više analita sa CBA metodom. Svi eksperimentalni koraci izvedeni su prema uputama proizvođača.

2.5.4. Alogena mješovita limfocitna reakcija (MLR)

Splenociti iz BALB/c miševa su aseptički dobijeni u mediju RPMI- 1640 (Zhang et al., 2018). Zreli C57BL/6 DC (sazreli u prisustvu različitih koncentracija AECCD ili LPS) su prethodno tretirani sa 50 ug/mL mitomicina C tokom 60 minuta na 37 ◦C. Nakon ispiranja, DC su miješani sa splenocitima u omjeru 1:5 ili 1:10 tokom 2 dana. Proliferacija ćelija određena je MTT testom.

2.5.5. Eksperimenti neutralizacije inhibitora

Da bi se istražio NF-κB put povezan sa TLR4-, sakupljeni DC-ovi su stavljeni na ploču 24-jažica i zatim prethodno tretirani sa TAK-242 (5 μM) ili PDTC (5 μM) , odnosno. Nakon 1-h inkubacije, ćelije su stimulirane različitim koncentracijama AECCD (100, 200 i 400 ug/mL) ili LPS (100 ng/mL) tokom 24 h. Zatim su utvrđeni nivoi ekspresije površinskih molekula i citokina u supernatantima kulture prema gore opisanim metodama.

3. Rezultati

3.1. FTIR spektroskopija

Glavni apsorpcioni vrhovi AECCD na slici 1 bili su karakteristični apsorpcioni vrhovi glikozidnih struktura koji odgovaraju vibraciji istezanja O–H na 3342,95 cm−1. Traka na 2933,54 cm−1 imala je karakterističnu slabu apsorpciju C–H vibracija rastezanja. Vrh na 1657,39 cm−1 pripisan je O–H fleksuralnoj vibraciji. Apsorpcija na 1411.00 cm− 1 pripisana je rasteznim vibracijama O–H ili C–H i C–O. Vrhovi na 1018,38 cm−1 takođe ukazuju na vibracije glikozidnih traka CO i C–O–C.

Slika 1. FTIR spektri AECCD.

3.2. OVA-specifični serumski odgovor antitijela

Serumi imuniziranih miševa su testirani kako bi se provjerilo prisustvo generiranih antitijela (IgG, IgG1 i IgG2a) protiv OVA. Kao što je prikazano na slici 2A, titri IgG kod miševa imuniziranih OVA/AECCD-M izazvali su veći ukupni IgG (titri: 220,000, 25{{30}}, 000 i 250,000) u odnosu na one iz OVA grupe (titri: 100,000, 100,000 i 120,000), i bio je blizu Alum grupe (titri: 250,000, 250,000 i 270,000) 28., 42. i 56. dana nakon primarne vakcinacije. OVA/AECCD-M/H značajno je povećao nivoe IgG1 u poređenju sa OVA grupom (P < 0,05),="" a="" razlika="" između="" ova/aeccd-m/h="" grupe="" i="" grupe="" alum="" nije="" bila="" značajna="" (p=""> 0,05). OVA/AECCD-M/H je takođe značajno povećao nivoe IgG2a u poređenju sa OVA grupom i Alum grupom (sl. 2B i C) (P < 0,05).="" povećani="" nivoi="" igg2a="" mogu="" spriječiti="" bolest="" koja="" zahtijeva="">imunodgovor.

Slika 2. Titri specifičnih antitijela za OVA i izotipovi IgG u serumu. Uzorci seruma su prikupljeni nakon primarne i dopunske imunizacije na antitijela pomoću ELISA. (A) IgG titri skupnog seruma su procijenjeni 14., 28., 42. i 56. dana nakon prve imunizacije. (B–C) IgG1 i IgG2a su izmjereni 21. dana nakon prve imunizacije. Podaci su predstavljeni kao srednja vrijednost ± SD (n=6). *P < 0.05="" u="" poređenju="" sa="">

3.3. Ćelijski imuni odgovori

Proliferacija limfocita slezene je ispitivana MTT testom pod restimulacijom sa OVA ili OVA{{0}}. Analiza proliferacije je otkrila da OVA/AECCD-M oba značajno povećavaju proliferaciju splenocita nakon izlaganja OVA, OVA323-339, Con A ili LPS u odnosu na OVA grupu. OVA i OVA323-339 značajno su poboljšali veći odgovor proliferacije nego u grupi Alum (slika 3) (P <>

Slika 3. Proliferacija splenocita nakon tretmana AECCD in vivo. Splenociti su ponovo stimulirani sa OVA, OVA323-339, ConA ili LPS i mjereni MTT metodom 21. dana nakon prve imunizacije. Proliferacija ćelija je prikazana kao indeks stimulacije (SI): (A–B) Indeks stimulacije OVA i OVA323-339. (C–D) Indeks stimulacije ConA i LPS. Podaci su predstavljeni kao srednja vrijednost ± SD (n=5). *P<0.05, **p="" <="" 0.01,="" and="" ***p="" <="" 0.001="" compared="" to="" ova;="" #p="" <="" 0.05="" and="" ##p="" <="" 0.01="" compared="" to="" ova/="">

3.4. Aktivacija podskupina T ćelija u drenirajućim limfnim čvorovima i slezeni

Limfni čvorovi i slezena od imuniziranih miševa su sakupljeni da bi se otkrile podskupine T ćelija 21. dana nakon primarne vakcinacije. Procenat podgrupa T ćelija (CD4 plus, CD8 plus, CD44 plus T ćelije) iz limfnih čvorova u OVA/AECCD-M grupi bio je značajno veći nego u OVA grupi i Alum grupi (sl. 4A–D) (P < 0.05).="" procenti="" podskupina="" t="" ćelija="" (cd4="" plus,="" cd8="" plus,="" cd44="" plus="" i="" cd62l="" plus="" t="" ćelije)="" u="" slezeni="" bili="" su="" značajno="" veći="" od="" onih="" u="" ova="" grupi="" (slika="" 4e–j)="" (p="">< 0,05).="" ovi="" nalazi="" su="" pokazali="" da="" je="" aeccd="" promovirao="" posredovanje="">imunodgovor.

Slika 4. Nivoi podskupina T ćelija u drenirajućim limfnim čvorovima i slezeni in vivo. Dana 21. nakon prve vakcinacije, ćelije iz limfnih čvorova i slezene korištene su za otkrivanje podskupova T stanica protočnom citometrijom. (A–D) Procenti CD4 plus, CD8 plus i CD44 plus T ćelija u limfnim čvorovima. (E–J) Procenti CD4 plus, CD8 plus, CD44 plus i CD62L plus T ćelija u slezeni. Podaci su predstavljeni kao srednja vrijednost ± SD (n=5). *P < {{10}}.05,="" **p="">< 0.01="" i="" ***p="">< 0,001="" u="" poređenju="" sa="" ova;="" #p="">< 0,05="" i="" ##p="">< 0,01="" u="" poređenju="" sa="">

3.5. Citokini koje luče restimulirani splenociti in vivo

'Th1/Th2 citokini iz slezene imuniziranih miševa su određeni intracelularnim bojenjem 21. dana nakon prve vakcinacije. Nivoi CD4 plus IL-4, CD4 plus IFN- i CD8 plus IFN- u OVA/AECCD-M grupi bili su značajno viši od onih u OVA grupi i Alum grupi (P < 0="" .05,="" sl.="" 5).="" razlike="" su="" pokazale="" da="" aeccd="" može="" stimulirati="" th1/th2="" odgovore,="" posebno="" posredovane="">imunodgovor.

Slika 5. Analiza citokina specifičnih za antigen u T ćelijama in vivo. Splenociti imuniziranih miševa su ispitani 21. dana nakon prve imunizacije intracelularnim bojenjem citokina. (A) Procenti CD4 plus IL-4. (B–C) Procenti CD4 plus IFN- i CD8 plus IFN-. Podaci su predstavljeni kao srednja vrijednost ± SD (n=5). *P < {{10}}.05="" i="" **p="">< 0,01="" u="" poređenju="" sa="" ova;="" #p="">< 0,05="" u="" poređenju="" sa="">

3.6. DC sazrijevanje i Tregs in vivo

DC aktivacija može pokrenuti adaptivni imunitet. Efekti AECCD na sazrijevanje DC kod imuniziranih miševa procijenjeni su 3. dana nakon prve imunizacije. OVA/AECCD-M inducirao je najviše nivoe CD40, CD80, CD86 i MHCII na DC u odnosu na OVA grupu, i razliku između OVA/AECCD-M grupa i Alum grupa je bila značajna (sl. 6A–D) (P < 0,05).="" učestalost="" cd4="" plus="" cd25="" plus="" foxp3="" plus="" tregs="" u="" ova/aeccd-m="" grupi="" bila="" je="" dramatično="" niža="" od="" one="" u="" ova="" grupi="" (slika="" 6e)="" (p="">< 0,05).="" ovi="" podaci="" sugeriraju="" da="" bi="" aeccd="" mogao="" aktivirati="" dc="" i="" sniziti="" treg="">

Slika 6. Efekti AECCD na DC sazrijevanje i Tregs in vivo. Splenociti iz ICR miševa korišteni su za detekciju kostimulatornih molekula na DC i Tregovima 3. ili 21. dana nakon prve imunizacije. (A–D) Procenti CD40, CD86, CD80 i MHCII na CD11c plus DC. (E) Procenti CD4 plus CD25 plus Foxp3 plus Tregs. Podaci su predstavljeni kao srednja vrijednost ± SD (n {{10}}). *P < 0.05="" i="" **p="">< 0.01="" u="" poređenju="" sa="" ova;="" #p="">< 0,05="" i="" ##p="">< 0,01="" u="" poređenju="" sa="">

3.7. Testovi citotoksičnosti i kontaminacije endotoksinom

Nakon tretmana različitim koncentracijama AECCD tokom 2 dana, ćelije iz DCS i splenocita miševa su korištene za određivanje potencijalne citotoksičnosti sa kompletom CCK-8. Nije bilo značajnog odgovora inhibirane proliferacije u vijabilnosti ćelija DC-a i splenocita u poređenju sa onim u kontrolnim grupama (Slika 7A–B) (P > 0.05). Ovi rezultati su pokazali da AECCD u koncentraciji od 10–1600 ug/mL nije pokazao značajnu citotoksičnost za DC i splenocite u poređenju sa kontrolom (P > 0,05). Stoga je koncentracija AECCD u narednim eksperimentima postavljena na ispod 1600 ug/mL.

Da bi se isključila interferencija kontaminacije endotoksinom u efektima AECCD-a na aktivaciju DC, PMB, antibiotik koji je široko priznat zbog svog LPS-neutralizirajućeg efekta, korišten je da isključi kontaminaciju endotoksinom (Morrison i Jacobs, 1976). Kao što je prikazano na slici 7C–F, nivoi ekspresije CD40, CD80, CD86 ili MHC-II u DC tretiranim AECCD u prisustvu PMB nisu pokazali značajnu promjenu ( P > 0,05). Međutim, uočen je dramatičan pad nivoa ekspresije CD40, CD80 CD86 i MHC-II u LPS-tretiranim DC u prisustvu PMB (P < 0,001).="" ovi="" rezultati="" su="" pokazali="" da="" aeccd="" nije="" bio="" kontaminiran="">

Slika 7. Citotoksičnost i efekti PMB na indukovano sazrevanje DC nakon AECCD. (A–B) DCS i splenociti miševa su kultivisani u prisustvu AECCD tokom 2 dana da bi se odredila vitalnost ćelija MTT metodom. (C–F) DC su inkubirani 12 h sa AECCD ili LPS prethodno tretiranim u prisustvu/odsustvu PMB tokom 60 min. Određeni su procenti CD40, CD80, CD86 i MHCII na CD11c plus DC. Podaci su predstavljeni kao srednje vrijednosti ± SD (n =3). **P < 0,01="" i="" ***p="">< 0,001="" u="" poređenju="" sa="" grupom="" sa="">

3.8. Fenotipsko sazrijevanje i funkcionalna aktivacija DC in vitro

Na osnovu gornjih eksperimenata imunizacije, fenotipsko sazrijevanje DC-a je dalje istraženo nakon tretmana AECCD in vitro. Šestog dana, nezreli DC su stimulirani datom koncentracijom AECCD ili LPS da bi se analizirali površinski molekuli. AECCD indukovano sazrevanje ćelija karakterisano značajnim povećanjem procenta CD40, CD80 CD86 i MHC II na način koji zavisi od doze (P <0,001, slika="" 8a-d).="" slično="" fenotipsko="" sazrevanje="" dc="" je="" takođe="" primećeno="" nakon="" stimulacije="" sa="" 100="" ng/ml="" lps.="" podaci="" analize="" su="" otkrili="" da="" je="" aeccd="" poboljšao="" dc="">

Iz gornjih rezultata, AECCD je poboljšao fenotipsko sazrijevanje DC-a. Kako bi se uočio učinak AECCD-a na funkciju DC in vitro, sposobnost DC-a tretiranih AECCD-om da stimuliraju alogenu proliferaciju T stanica u MLR-u pri omjeru DC-splenocita od 1:5 ili 1:10 je bila istraženo. DC-i tretirani različitim koncentracijama AECCD-a izazvali su značajnu proliferaciju T ćelija u poređenju sa netretiranim-DC-ima (Slika 8E-F) (P < 0.001).="" dc="" sazrijevanje="" može="" izazvati="" proizvodnju="" citokina.="" zatim="" su="" supernatanti="" dc="" tretiranih="" sa="" aeccd="" ili="" lps="" detektovani="" elisa="" kompletom.="" nivoi="" il-12="" i="" tnf-="" u="" supernatantima="" dc-a="" su="" dramatično="" povećani="" u="" zavisnosti="" od="" doze="" (p="">< 0,001,="" slika="">

Slika 8. Fenotipsko sazrijevanje i funkcionalna aktivacija DC nakon AECCD tretmana in vitro. (A–D) Dana 6, DC su tretirani datom koncentracijom AECCD ili LPS tokom 12 sati. Ćelije su obojene antitelima i određene protočnom citometrijom. Srednji intenzitet fluorescencije (MFI) CD40, CD80, CD86 i MHCII na CD11c plus DC. (E–F) C57BL/6 DC tretirani različitim koncentracijama AECCD ili LPS pomiješani su sa splenocitima BALB/c miševa u omjeru 1:5 ili 1:10 u MLR-u tokom 2 dana. Proliferacija ćelija određena je MTT testom. (G–H) Supernatanti kulture DC su analizirani na IL-12 i TNF-a pomoću ELISA kompleta. Podaci su predstavljeni kao srednje vrijednosti ± SD (n =3). *P < 0.05,="" **p="">< 0,01="" i="" ***p="">< 0,001="" u="" poređenju="" sa="" netretiranim="" dc;="" #p="">< 0,05="" u="" poređenju="" sa="">

3.9. TLR4, receptor za AECCD na DC

DCS može inicirati ćelijsku signalizaciju putem membranskih receptora. Toodreditiuloga TLR4 u učešću u sazrevanju DC-a tretiranog AECCD-om, nakon prethodnog tretmana sa TLR4 inhibitorom TAK-242, DC-ovi su stimulisani datom koncentracijom AECCD-a, a zatim je protočnim citometrom ispitan status aktivacije DC-a . Nivoi ekspresije citokina u supernatantima kulture analizirani su kompletom za ispitivanje protoka više analita. Povećana regulacija CD40, CD80, CD86 i MHC-II izazvana AECCD je značajno inhibirana blokiranjem TLR4 puteva (P <0,01, slika="" 9a-d).="" štaviše,="" u="" poređenju="" sa="" netretiranom="" kontrolom,="" blokiranje="" tlr4="" sa="" tak-242="" imalo="" je="" značajniji="" inhibicijski="" efekat="" na="" proizvodnju="" ifn-,="" tnf-="" i="" il-6="" (p=""><0,01, slika="" 9e–g)="">

Slika 9. Aktivacija TLR4 signalizacije u DC-ovima tretiranim AECCD. Nakon što su nezreli DC tretirani AECCD u odsustvu ili prisustvu TAK-242 tokom 12 h, fenotipsko sazrijevanje je ispitano protočnim citometrom, a nivoi citokina u supernatantima CBA metodom. (A–D) Procenti CD40, CD80, CD86 i MHCII na CD11c plus DC. (E–G) Nivoi IFN-, TNF- i IL-6. Podaci su predstavljeni kao srednje vrijednosti ± SD (n=3). **P < 0,01="" i=""><0.001 compared="" to="" the="" group="" with="">

3.10. DC aktivacija od strane AECCD putem NF-κB puta povezanog sa TLR4-

Da bi se istražilo da li su ekspresije površinskih molekula i citokina DC tretiranih AECCD regulirane NF-κB nakon što su nezreli DC prethodno tretirani inhibitorom NF-κB PDTC stimulirani AECCD tijekom 12 sati, izmjereni su nivoi ekspresije kostimulatornih molekula i citokina. protočni citometar. Nivoi CD40, CD80 CD86 i MHC-II izazvani AECCD su značajno smanjeni u poređenju sa netretiranom kontrolom blokiranjem NF-κB puteva odgovarajućim inhibitorima (P < 0,001,="" slika="" 10a–d).="" istovremeno,="" ekspresija="" ifn-,="" tnf-="" i="" il-6="" je="" takođe="" značajno="" inhibirana="" od="" strane="" pdtc="" (p="">< 0,05,="" sl.="">

Slika 10. Učešće NF-κB u AECCD-indukovanoj DC aktivaciji. DC su tretirani AECCD u odsustvu ili prisustvu PDTC tokom 24 sata. (A–D) Procenti CD40, CD80, CD86 i MHCII na CD11c plus DC su određeni protočnom citometrijom. (E–G) Nivoi IFN- , TNF- i IL-6 u supernatantu određeni su CBA metodom. Podaci su predstavljeni kao srednja vrijednost ± SD (n=3).*P < 0,05,="" **p="">< 0,01="" i="" ***p="">< 0,001="" u="" poređenju="" sa="" grupom="" sa="">

4. Diskusija

Trenutno se istražuju različiti polisaharidi iz TCM-a kao pomoćna sredstva za vakcine za ljude i životinje (Sun et al., 2018; Rey-Ladino et al., 2011). U ovoj studiji, imunomodulacijski efekti AECCD-a i primarni mehanizam aktivacije DC-a istraženi su in vivo i in vitro nizom eksperimenata kako bi se procijenilo adaptivnoimunodgovorprotiv OVA i statusa aktivacije DCS-a. Eksperimenti in vivo su pokazali da AECCD značajno potiče proizvodnju OVA-specifičnih IgG i IgG izotipova, pojačanu proliferaciju splenocita i inducira aktivaciju T ćelija i citokina (IL-4/IFN-). Osim toga, AECCD je poboljšao DC sazrijevanje i pokazao smanjene Tregove. Ovi nalazi sugeriraju da je funkcija AECCD-a kao efikasnog adjuvansa ostvarena promicanjem DC sazrijevanja i inhibicijom Treg-ova. In vitro eksperimenti su pokazali da je AECCD promovirao fenotipsko sazrijevanje DC-a, sekcije citokina i alostimulatornu aktivnost putem NF-κB puta povezanog s TLR4-. Ovi eksperimentalni rezultati su pokazali da AECCD ima značajan potencijal kao stimulator za jačanje imuniteta.

Svaki adjuvans ima jedinstvene imunološke karakteristike protiv različitih antigena, što ukazuje da adjuvansi imaju potencijal primjene u različitim bolestima. Prvo, ispitivana su adjuvantna svojstva istodobne primjene AECCD i OVA određivanjem njihovih efekata na adaptivneimunodgovorkod miševa. Mnoge studije su pokazale da su imunostimulativne aktivnosti bile direktno proporcionalne dozi unutar određenog raspona (Li et al., 2020; Reed et al., 2020; Zhang et al., 2017). Slično, u studiji je analiza antitijela i izotipa otkrila da je AECCD u određenom rasponu doza pojačao OVA-specifične IgG, IgG1 i IgG2a odgovore i da je srednja doza AECCD bila optimalna doza. U kasnijim eksperimentima, uglavnom smo istraživali stimulativni učinak AECCD pri optimalnoj srednjoj dozi. Srednja doza AECCD značajno je povećala odgovor na proliferaciju splenocita kod imuniziranih miševa, što ukazuje da je AECCD promovirao ćelijskiimunodgovoreprotiv OVA. Ovi rezultati sugeriraju da je AECCD poboljšao i humoralni i ćelijskiimunodgovore, koji su bili povezani sa adjuvansnim potencijalom.
Izražena značajna aktivnost T-ćelija može biti pogodna za eradikaciju bolesti. Tokom animunodgovor, aktivirane T ćelije mogu doći do sekundarnog limfoidnog tkiva, uključujući slezinu i limfne čvorove (Steinman, 2012). Srednja doza AECCD efektivno je poboljšala efikasnost vakcine jer je mogla značajno poboljšati odgovore CD4, CD8, CD44 i CD62L T ćelija u drenirajućim limfnim čvorovima i slezeni. Aktivirane CD8 T ćelije su posredovale eradikaciji patogena lučenjem IFN-a. Proliferirane CD4 T ćelije su diferencirane u Th1 ćelije i Th1 ćelije. Th1 ćelije luče Th1 citokin da stimulišu proliferaciju limfocita, a Th2 ćelije luče Th2 citokin da pojačaju proizvodnju antitijela (Seder et al., 2008). U studiji, nivoi CD4 plus IL-4, CD4 plus IFN- i CD8 plus IFN- povećani su AECCD u srednjoj dozi. AECCD je izazvao uravnotežen Th1/Th2 odgovor i usmjerio naimunodgovorpromjenom mreže citokina.

Adjuvans treba da izazove specifičan imunitet i kontroliše ishodimunodgovorregulacijom statusa DC na brojnim tačkama (Carrera Silva et al., 2013). Ekspresija površinskih molekula na DC je ključni indikator za procjenu sazrijevanja DC i obično je u korelaciji s diferencijacijom T limfocita (Steinman, 2012). U ovoj studiji, AECCD je poboljšao ekspresiju kostimulatornih molekula i olakšao sazrijevanje DC kada se koristio kao pomoćno sredstvo protiv OVA. Ovo bi mogao biti jedan od načina na koji je AECCD promovirao humoralni i ćelijskiimunodgovore. U međuvremenu, AECCD je takođe smanjio učestalost CD4 plus CD25 plus Foxp3 plus Tregs, što je obezbedilo uravnotežen imunitet nakon vakcinacije. Naši rezultati podržavaju nedavne nalaze da su različiti polisaharidi iz TCM regulatori sazrijevanja DC (Bo i sur., 2019.; Li i sur., 2015.; Zhu et al., 2016.).

Aktivacija adaptivnogimunodgovorepolisaharidnim adjuvansima je posredovan prvenstveno preko njihovog prepoznavanja od strane specifičnih receptora DC (Akira, 2004). DC aktivirani putem puteva vezanih za TLR{1}} mogu lučiti različite imunomodulatore kao kritične posrednike protiv infekcija (Akira, 2007). Stoga smo u narednim eksperimentima preliminarno istraživali molekularni mehanizam stimulativnog efekta AECCD na DC in vitro. Kako bi se promatrala citotoksičnost AECCD, prvo je određena ćelijska održivost DC i splenocita miševa. AECCD na 10–1600 ug/mL nije pokazao citotoksičnost za DC i splenocite. Da bismo isključili kontaminaciju LPS-om, prethodno smo tretirali AECCD sa PMB. Nivoi ekspresije CD40, CD80 CD86 i MHC-II u DC tretiranim AECCD nisu smanjeni, ali je PMB efikasno inhibirao ekspresiju kostimulatornih molekula u DC tretiranim LPS. Ovo je pokazalo da AECCD nije bio kontaminiran endotoksinom. Zatim je dalje istražen status aktivacije DC-a. Slično LPS-liječenim DC-ima, na način ovisan o dozi, DC-ovi tretirani AECCD-om povećali su nivoe CD40, CD80 CD86 i MHC II, kao i proizvodnju pro-upalnog citokina, koji je bio parametar funkcionalnog sazrijevanja DC. U MLR, sposobnost proliferacije alogenih T ćelija je procenjena u AECCD tretiranim DC. AECCD bi mogao pokrenuti i aktivirati alogene T ćelije. DC su prvo prethodno tretirani mitomicinom C, a zatim temeljito isprani da bi se uklonio ovaj reagens, tako da efekti AECCD-a na DC nisu vjerovatno bili pripisani mitogenoj aktivnosti. Eksperimentalni podaci su otkrili da se fenotipsko sazrijevanje DC i funkcionalna aktivacija mogu pripisati stimulaciji iz AECCD.

Brojni TCM polisaharidi mogu stimulirati sazrijevanje DC preko TLR4. NF-κB kao član nizvodnog puta povezanog s TLR4- igra važnu ulogu u regulaciji fenotipskog i funkcionalnog sazrijevanja DC-a i indukciji ekspresije različitih gena uključenih uimunodgovore(Qi et al., 2016; Re i Strominger, 2001; Wei et al., 2016; Zhu et al., 2013). Kroz in vitro eksperimente, otkrili smo da AECCD potiče sazrijevanje DC i da TAK-242 (TLR4 inhibitor) i PDTC (NF-κB inhibitor) smanjuju nivoe ekspresije CD40, CD80, CD86 i MHC -II i nivoi sekrecije IFN-, TNF- i IL-6 na AECCD-tretiranim DC-ima, Ovi nalazi su pokazali da su TLR4 i NF-κB bili uključeni u AECCD-indukovanu aktivaciju DC-a i izlučivanje citokina. Ovi rezultati su bili u skladu sa prethodno prijavljenim studijama jer je AECCD kao pomoćno sredstvo poboljšao ciljanje antigena na DC.

Ukratko, naši rezultati su pokazali da je AECCD inducirao trajne i Th1/Th2 odgovore, posebno posredovane T-ćelijamaimunodgovorprotiv OVA. AECCD je aktivirao DC putem NF-κB puta posredovanog TLR4-, čime je pojačao proizvodnju imunomodulatora i alogenu proliferaciju T ćelija. AECCD se može koristiti kao efikasan adjuvans u razvoju vakcine. Međutim, izvršit će se precizna analiza komponenti kako bi se utvrdilo koja komponenta u AECCD aktivira DC. Sa fokusom na mehanizme koji se odnose na to kako AECCD povećava imunogenost, uključujući optimizaciju formulacija adjuvansa i načina primjene cjepiva, dalje ćemo istražiti imunomodulatorne komponente i specifična svojstva adjuvansa AECCD-a u svrhu dizajniranja efikasnih adjuvansa za vakcinu protiv zaraznih bolesti.

Cistanche koristi deserticolapromovirati animunodgovor

Doprinosi autora

Prikupljanje, analiza i interpretacija podataka: Shuangshuang Feng, Xiumei Yang, Xiang Weng. Pisanje originalnog nacrta: Shuangshuang Feng, Xiang Weng.

Finansijska akvizicija:Ailian Zhang.

istraga:Ailian Zhang.

metodologija:Ailian Zhang, Bin Wang.

nadzor:Ailian Zhang.

Izjava o konkurentnom interesu

Autori nemaju sukob interesa u vezi sa ovom studijom.

Priznanja

Ovaj rad je podržala Nacionalna fondacija za prirodne nauke Kine [brojevi grantova 31960164 i 31660259] Finanseri nisu imali nikakvu ulogu u dizajnu studije, prikupljanju podataka i analizi, odluci o objavljivanju, pripremi ili rukopisu.

Autori zahvaljuju prof. Xingguo Zhengu i Jiang Heu (Urumqi, Kina) na ljubaznom materijalu i identifikaciji.

Reference

Akira, S., 2004. Familije receptora cestarine: struktura i funkcija. Semin. Immunol. 16, 1–2.

Akira, KS, 2007. Signalizacija NF-κB putem receptora sličnih cestarini. Trendovi Mol. Med. 18, 156–163.

Banchereau, J., Steinman, RM, 1998. Dendritske ćelije i kontrola imuniteta. Nature 392, 245–252.
Bo, R., Liu, Z., Zhang, J., Gu, P., Ou, N., Sun, Y., Hu, Y., Liu, J., Wang, D., 2019. mehanizam Lyciuma barbarum polisaharidi liposomi na aktiviranju mišjih dendritskih stanica. Ugljikohidrati. Polym. 205, 540–549.
Cao, P., Wu, S., Wu, T., Deng, Y., Zhang, Q., Wang, K., Zhang, Y., 2020. Važna uloga polisaharida iz tradicionalne kineske medicine - čišćenje pluća i detoksikacijski decokcija protiv pandemije COVID-19. Ugljikohidrati. Polym. 240,m116346
Carrera Silva, EA, Chan, PY, Joannas, L., Errasti, AE, Gagliani, N., Bosurgi, L., Jabbour, M., Perry, A., Smith-Chakmakova, F., Mucida, D., Cheroutre, H., BurstynCohen, T., Leighton, JA, Lemke, G., Ghosh, S., Rothlin, CV, 2013. Izvedeno od T ćelija
protein S uključuje signalizaciju TAM receptora u dendritskim ćelijama da kontroliše veličinuimunodgovor. Imunitet 39, 160–170.
Kineska farmakopejska komisija, 1992. Kinesko Ministarstvo zdravlja Standard za lijekove Kineska biljna medicina, tom jedan. Štampa Kineske komisije za farmakopeju, Peking, str. 1.

Dong, Q., Yao, J., Fang, J., Ding, K., 2007. Strukturna karakterizacija i imunološka aktivnost dva polisaharida koja se ekstrahuju hladnom vodom izCistanchedeserticolaYC Ma. Ugljikohidrati. Res. 342 (10), 1343–1349.
Dubois, M., Gilles, K., Hamilton, JK, Rebers, PA, Smith, F., 1951. Kolorimetrijska metoda za određivanje šećera. Priroda 168, 167.
Fu, Z., Fan, X., Wang, X., Gao, X., 2018.CistanchesHerba: pregled njene hemije, farmakologije i farmakokinetike. J. Ethnopharmacol. 219, 233–247.
Giuseppe, DG, Rino, R., Didierlaurent, AM, 2018. Korelati adjuvantičnosti: pregled adjuvansa u licenciranim vakcinama. Semin. Immunol. 39, 14–21.
Inaba, K., Inaba, M., Romani, N., Aya, H., Deguchi, M., Ikehara, S., Muramatsu, S., Steinman, RM, 1992. Generacija velikog broja dendritskih ćelija od miša kulture koštane srži dopunjene faktorom stimulacije kolonija granulocita/makrofaga. J. Exp. Med. 176, 1693–1702.
Li, P., Wang, F., 2015. Polisaharidi: kandidati obećavajućih adjuvansa za vakcinu. Drug Discov Ther 9, 88–93.
Li, X., Zhao, R., Li, H., De, Z., Wu, H., 2012. Deproteinizacija polisaharida iz stigma maydis metodom Sevag. Adv. Mater. Res. 340, 416–420.
Li, J., Li, J., Zhang, F., 2015. Imunoregulatorni efekti kineske biljne medicine na sazrijevanje i funkciju dendritskih ćelija. J. Ethnopharmacol. 171, 184–195.
Li, T., Zhang, L., Jin, C., Xiong, Y., Cheng, YY, Chen, K., 2020. Ekstrakt cvijeta nara dvosmjerno reguliše proliferaciju, diferencijaciju i apoptozu 3T3- L1 ćelije kroz regulaciju ekspresije PPAR posredovane signalnim putem PI3K-AKT. Biomed. Pharmacother. 131, 110769.
Morrison, DC, Jacobs, DM, 1976. Vezivanje polimiksina B za lipid A dio bakterijskih lipopolisaharida. Immunochemistry 13, 813–818.
Park, MJ, Ryu, HS, Kim, JS, Lee, HK, Kang, JS, Yun, J., Kim, SY, Lee, MK, Hong, JT, Kim, Y., 2014. Polisaharid Platycodon grandiflorum inducira dendritske stanice sazrijevanje putem TLR4 signalizacije. Food Chem. Toxicol. 72, 212–220.
Qi, C., Guo, Y., Zhou, W., Zhang, Y., 2016. Imunostimulacijski polisaharidi koji se odnose na receptore sličnih cestarini 4-: primarna struktura, odnosi aktivnosti i mogući modeli interakcije. Ugljikohidrati. Polym. 149, 186–206.
Re, F., Strominger, JL, 2001. Toll-like receptor 2 (TLR2) i TLR4 različito aktiviraju ljudske dendritske ćelije. J. Biol. Chem. 276, 37692–37699.
Reed, SG, Orr, MT, Fox, CB, 2013. Ključne uloge adjuvansa u modernim vakcinama. Nat. Med. 19, 1597–1608.
Reed, SG, Tomai, M., Gale, MJ, 2020. Novi horizonti u adjuvansima za razvoj vakcine. Curr. Opin. Immunol. 65, 97–101.
Rey-Ladino, J., Ross, AG, Cripps, AW, Mcmanus, DP, Quinn, R., 2011. Prirodni proizvodi i potraga za novim adjuvansima za vakcinu. Vakcina 29, 6464–6471.
Schijns, V., Fernandez´ Ejada, A., Barjaktarovi, A., Bouzalas, I., Lavelle, EC, 2020. Modulacijaimunodgovorekorištenje pomoćnih sredstava za olakšavanje terapijske vakcinacije. Immunol. Rev. 296, 169–190.
Seder, RA, Darrah, PA, Roederer, M., 2008. Kvaliteta T-ćelija u memoriji i zaštiti: implikacije na dizajn vakcine. Nat. Rev. Immunol. 8, 247–258.
Steinman, RM, 2012. Odluke o dendritskim ćelijama: prošlost, sadašnjost i budućnost. Annu. Rev. Immunol. 30, 1–22.
Sun, B., Yu, S., Zhao, D., Guo, S., W, X., Zhao, K., 2018. Polisaharidi kao pomoćna sredstva za vakcinu. Vaccina 36, ​​5226–5234.
Tian, ​​H., Liu, Z., Pu, Y., Bao, Y., 2019. Imunomodulatorni efekti polisaharida Poria Coco putem TLR4/TRAF6/NF-κB signalizacije in vitro i in vivo. Biomed. Pharmacother. 112, 108709.
Wei, W., Xiao, HT, Bao, WR, Ma, DL, Leung, CH, 2016. TLR-4 može posredovati u signalnim putevima ekspresije citokina ćelija RAW264.7 izazvane polisaharidom Astragalus polisaharidom RAP. J. Ethnopharmacol. 179, 243–252.
Zhang, A., Yang, Y., Wang, Y., Zhao, G., Yang, X., Wang, D., Wang, B., 2017. Adjuvantni vodeni ekstrakti iz Artemisia rupestris L. poboljšavajuimunodgovorekroz TLR4 signalni put. Vakcina 35, 1037–1045
Zhang, A., Yang, X., Li, Q., Yang, Y., Zhao, G., Wang, B., Wu, DC, 2018. Imunostimulativna aktivnost polisaharida koji se ekstrahiraju vodom izCistanchedeserticolakao biljni adjuvans in vitro i in vivo. PloS One 13, e0191356.
Zhao, B., Lian, J., Wang, D., Li, Q., Zhang, A., 2019. Evaluacija vodenih ekstrakataCistanchedeserticolaje polisaharidni adjuvans za vakcinu protiv sezonske gripe kod mladih odraslih miševa. Immunol. Lett. 213, 1–8.
Zhou, L., Liu, Z., Wang, Z., Yu, S., Long, T., Zhou, X., Bao, Y., 2017. Astragalus polisaharidi ispoljavaju imunomodulatorne efekte putem TLR{1}}posredovanog MyD88-ovisni signalni putevi in ​​vitro i in vivo. Sci Rep-UK 7, 44822.
Zhu, J., Zhang, Y., Shen, Y., Zhou, H., Yu, X., 2013. Lycium barbarum polisaharidi induciraju receptore slične Tollu 2- i 4-posreduju fenotipske i funkcionalne sazrevanje mišjih dendritskih ćelija putem aktivacije NF-κB. Mol. Med. Rep. 8, 1216–1220.
Zhu, N., Lv, X., Wang, Y., Li, J., Liu, Y., Lu, W., Yang, L., Zhao, J., Wang, F., Zhang, LW, 2016. Poređenje imunoregulatornih efekata polisaharida iz tri prirodne biljke i ćelijske apsorpcije u dendritskim ćelijama. Int. J. Biol. Macromol. 93, 940–951.