Jačanje antikancerogene aktivnosti taksola Aspergillus Favus "endofita jojobe" preko konjugacije sa zlatnim nanočesticama posredovanim zračenjem

Taxol Alternative Chinese Herbs Cistanche

Ključne riječi:Aspergillus favus · Jojoba · Endofitne gljive · Zlatne nanočestice · Taxol · -Zračenje · Optimizacija ishrane

Uvod

Taxol je jedan od najkomercijalnijih širokog spektralijekovi protiv raka[1]. Aktivnost taksola proizilazi iz njegove jedinstvene specifičnosti za vezivanje sa ćelijskim heterodimerom podjedinica tubulina, promovišući polimerizaciju tubulina, čime se prekida mitotička dioba tumorskih stanica [2]. Taxol je pokazao snažnu aktivnost protiv raka dojke, pluća, glave i vrata, raka materice i uznapredovalih oblika Kaposijevog sarkoma [3]. Taksol se prvo proizvodio iz kore stabala tise Taxus brevifolia "porodica Taxaceae" [4, 5]; međutim, manji prinos Taxola je<0.001%, i.e., to produce 1 g Taxol, it requires~10 kg of plant bark that collected from 3 to 5 trees [6], is the main challenge. In addition, the vulnerability of this plant to unpredicted fluctuations with the environmental conditions strongly influences the Taxol yield, heterogeneity, and reproducibility [7–9]. Exploring the Taxol producing potency of the endophytic fungi inhabiting medicinal plants raises the hope for overcoming the low yield by the above-mentioned method [10, 11], due to their fast growth, cost-effectiveness, independence on climatic changes, and feasibility for genetic manipulation [12, 13]. Subsequently, a plethora of endophytic fungi with metabolic potency to produce Taxol has been reported as reviewed [1, 14–25]. However, the anticipation of these fungi for industrial production of Taxol has been challenged by the attenuation and loss of Taxol productivity by the fungal storage and multiple subculturing [21, 22, 26–28]. Thus, searching for a novel fungal isolate with affordable metabolic stability and sustainability for Taxol production is the challenge. Medicinal plants of well-known ethnopharmacological relevance and traditional pharmaceutical applications could be the repertoire of novel fungal isolates with unique features of metabolic stability for Taxol biosynthesis. Among the most common medicinal plants, jojoba "Simmondsia chinensis" is a monogenetic dioecious grey-green shrub belonging to the Simmondsiaceae family. Jojoba seeds contain up to 65% of light golden and odorless high-viscosity oily metabolites [29]. Jojoba oil has been frequently used for the relief of headaches, throat inflammation, and wound treatment [30, 31]. As well as Jojoba oil has been used as an anti-inflammatory and antimicrobial agent [30, 31]. The leaves of jojoba are rich with antioxidant flavonoid compounds that are traditionally used for treating of various disorders such as astma,upala, irak[32]. Stoga je glavni cilj ovog rada bio istražiti novi izolat gljivica iz biljke jojobe s jedinstvenom metaboličkom stabilnošću za proizvodnju taksola, procijeniti različite pristupe za maksimiziranje njihovog prinosa taksola, kao i za poboljšanje antiproliferativne aktivnosti ekstrahiranih spojeva taksola. preko konjugacije sa zlatnim nanočesticama, posredovanom gama zračenjem.

Materijal i metode

Izolacija i uzgoj endofitskih gljiva

Različiti dijelovi jojobe (Simmondsia chinensis) kao listovi, kora, grančice i pupoljci sakupljeni su sa Poljoprivrednog fakulteta Univerziteta u Kairu i korišteni kao izvor za endofitne gljive. Biljni dijelovi su sakupljeni i isprani pod tekućom vodom iz slavine, površina sterilizirana 70 postotnim etanolom 1 min, a zatim isprana sterilnom vodom [28]. Površinski sterilisani delovi biljke su isečeni na male komadiće u sterilnim uslovima i stavljeni na ploče sa podlogom od krompir dekstroze agar (PDA), Czapek's-Dox i agar medijum sa ekstraktom slada [33–36], a ploče su inkubirane na 30 stepeni. 10 dana. Efikasnost površinske sterilizacije dijelova biljke procijenjena je centrifugiranjem vode za ispiranje, zatim je talogu dodano 500 ul sterilne vode i stavljeno u PDA medij [37]. Pročišćeni izolati endofitnih gljivica inokulirani su na PDA kosim 7 dana i čuvani na 4 stepena

Skrining, ekstrakcija i kvantifikacija taksola iz endofitnih gljiva

Pronađene endofitne gljive koje nastanjuju jojobu testirane su na proizvodnju taksola uzgojem na bujonu od krompirove dekstroze (PDB) [38]. Po jedan čep svakog od 7 dana starih izolata gljivica inokuliran je u 100 ml PDB/250 ml Erlenmeyerovih zadataka, inkubiran 15 dana na 30±1 stepen, uz mućkanje (120 rpm). Nakon inkubacije, kulture su filtrirane, a filtrat je dopunjen sa 0,2 posto natrijum bikarbonata kako bi se istaložile masne kiseline. Taksol je ekstrahovan dihlorometanom, a organska faza je sakupljena i uparena do suha, a ostaci su ponovo rastvoreni u metanolu [17, 39]. Taksol je odvojen i identifikovan TLC pomoću Merck 1 mm (20×20 cm) prethodno obloženih ploča silika gela (TLC Silica gel 60 F254, Darmstadt, Nemačka), detektovan UV osvetljenjem na 254 nm [39]. Pretpostavljene tačke taksola su ostrugane sa ploča TLC silika gela i rastvorene u metanolu, snažno vorteksirane 10 minuta i centrifugirane na 1000 rpm 5 minuta. Precipitirane čestice silicijum dioksida su uklonjene, a supernatant je uzet za kvantifikaciju taksola i proveru čistoće pomoću HPLC (YOUNG In, Chromass, 9110 plus Quaternary Pump, Koreja) kolone C18 reverzne faze (Eclipse Plus C18 4.6 ×150 mm, 3,5 μm, kat. br. 959,963–902). Korištena je mobilna faza metanol/acetonitril/voda (25:35:40, v/v/v) brzinom protoka od 1,0 ml/min tijekom 20 minuta [40], a frakcije taksola mjerene su na 227 nm, a njihova hemijski identitet i koncentracije potvrđeni su iz vremena zadržavanja i površine apsorpcionog vrha u poređenju sa autentičnim uzorkom.

Morfološka i molekularna identifikacija obnovljenih endofitskih gljiva

Izolati endofitnih gljivica identificirani su do nivoa njihove vrste na osnovu njihovih makro i mikromorfoloških karakteristika uzgojem na PDA, Czapek's-Doxu i mediju ekstrakta slada prema referentnim ključevima [33–36]. Identitet najjačih gljivičnih izolata koji proizvode taksol dodatno je molekularno potvrđen na osnovu sekvence internog transkribovanog razmaknice (ITS) [41, 42]. Gljivična genomska DNK (gDNA) ekstrahirana je usitnjavanjem micelije (~0.2 g) u tečnom dušiku, zatim doziranjem u 1 ml CTAB pufera za ekstrakciju (2 procenta CTAB, 2 procenta PVP40, { {21}},2 posto 2-merkaptoetanola, 20 mM EDTA, 1,4 M NaCl u 100 mM Tris-HCl, pH 8,0). PCR setovi prajmera bili su ITS4 5′-GGAAGTAAAAGTCGT AACAAGG-3′ i ITS5 5′-TCCTCCGCTTATTGATATGC-3′. PCR reakcija sadrži 10 ul 2×PCR master smjese (i-Taq™, kat. br. 25027), 2 ul gDNA, 1 ul svakog prajmera (10 pmol/ul) i dopunjen do 20 ul sa sterilnom destilacijom vode. PCR je programiran na početnu denaturaciju na 94 stepena u trajanju od 2 minuta, denaturaciju na 94 stepena u trajanju od 30 s, žarenje na 55 stepeni u trajanju od 10 sekundi, ekstenziju na 72 stepena za 30 s tokom 35 ciklusa i konačno proširenje na 72 stepena za 2 min. PCR amplikoni su analizirani pomoću 1,5% agaroznog gela u 1×TBE puferu (Ambion Cat# AM9864), korištenjem 1 kb DNK ljestvice (Kat. # PG010-55DI) i vizualizirani pomoću sistema za dokumentaciju gela. Amplikoni su pročišćeni i sekvencionirani pomoću Applied Biosystems Sequencer, HiSQV Bases, verzija 6.0 sa istim setovima prajmera. Dobijene sekvence su BLAST pretražene bez redundantnosti u bazi podataka NCBI, uvezene u softver MEGA 6.0 i usklađene sa algoritmom mišića Clustal W [43], a filogenetsko stablo je konstruisano metodom spajanja susjeda MEGA 6.0 [44].

Hemijska struktura ekstrahovanog taksola

Pretpostavljene tačke taksola su sastrugane sa TLC ploča silika gela i pročišćene, a čistoća i koncentracija su određene UV-Vis analizama na λ 227 nm (RIGOL, Ultra-3000 serija) u poređenju sa autentičnim Taxolom [39]. Prazni mediji pod istim uslovima korišteni su kao negativna baza za spektrofotometrijske analize. FT-IR spektar pročišćenih uzoraka taksola analiziran je spektrofotometrom JASCO FT-IR 3600. Uzorak Taxola je samljeven sa KBr granulama, utisnut u diskove pod vakuumom, a apsorpcija je mjerena u području od 400 do 4000 cm−1 [3], u poređenju sa autentičnim. Hemijska struktura ekstrahiranog taksola potvrđena je HNMR spektroskopijom (JEOL, ECA-500II, 500 MHz NMR) u poređenju sa autentičnim taksolom. Uzorci su rastvoreni u CDCl3, hemijski pomaci su dati u ppm (δ-skala), a konstante spajanja izražene u hercima (Hz).

Utjecaj različitih vrsta medija na proizvodnju taksola

Dva čepa agara (9 mm) iz 7 dana starih kultura svakog izolata gljivica inokulirana su u tri primjerka u 100 ml medijuma/250 ml Erlenmajer tikvice od krompirove dekstroze (PDB), Czapekʼs-Dox (CZD), M1D i ekstrakta slada (ME ) bujon medij. Kao negativna kontrola korišćene su nenokulirane kontrole iz svake podloge bez spora gljivica, inkubirane na 30 stepeni 15 dana pod istim uslovima. Nakon inkubacije, kulture gljiva su filtrirane, a taksol je ekstrahovan i određen kao što je gore navedeno.

Bioprocesna optimizacija nutritivnih uslova za maksimiziranje prinosa taksola

Optimizacija sastava medija za maksimiziranje prinosa taksola potentnim izolatom gljivica provedena je metodologijom površine odgovora korištenjem Placket-Burman dizajna praćenog centralnim kompozitnim dizajnom [17–20, 45]. Iz RSM dizajna, pozitivne i značajne varijable koje utiču na proizvodnju taksola od strane snažnog izolata gljivice procijenjene su pomoću statističkog softverskog paketa Design-Expert 7.0 (Stat Ease Inc., Minneapolis, SAD). Svaki eksperiment je izveden u tri biološka ponavljanja i uzete su u obzir srednje vrijednosti. Nakon inkubacije u željenim uslovima, biomasa gljiva je filtrirana, a taksol je ekstrahovan i kvantifikovan pomoću TLC i HPLC kao što je gore opisano.

Placket‑Burman dizajn

Placket-Burman dizajn se često koristio za optimizaciju komponente medija za rast gljivica i proizvodnju bioaktivnih sekundarnih metabolita, procjenjujući značajne varijable koje utiču na proizvodnju taksola [18, 20, 46]. Izbor faktora bio je zasnovan na medijumu koji se koristi u kvalitativnom i kvantitativnom skriningu. Uključeno je jedanaest faktora; Ekstrakt slada, pepton, saharoza, sojaton, glutamin, ekstrakt govedine, te vrijednosti i faktori temperature, pH, vremena inkubacije i brzine mućkanja varirali su na dva nivoa, te su odabrani rasponi minimalnog i maksimalnog nivoa. Statistički Design-Expert 7.0 je korišten za generiranje skupa od 12 eksperimenata. Za svaki eksperiment, proizvodnja taksola je određena u tri biološka ponavljanja i uzet je u obzir prosjek prinosa taksola.

Regresiona analiza podataka provedena je korištenjem statističkog softvera. Učinak svake varijable izračunat je (Biometrika, 2020), koristeći sljedeću jednačinu:

gdje je E efekat varijable testiranja, M plus i M− su koncentracija taksola u ispitivanjima pri kojoj je parametar bio na višim odnosno nižim nivoima, a N je broj eksperimenata koji su izvedeni. Učinak svake varijable na proizvodnju određen je izračunavanjem njihovih E-vrijednosti.

Gdje je Tot high ukupan broj odgovora na visokom nivou, Tot low je ukupni odgovori na niskom nivou, a Ne je broj ispitivanja.

Centralni kompozitni dizajn i interakcije između faktora koji utječu na proizvodnju taksola

Najznačajniji pozitivni faktori koji utječu na proizvodnju taksola odabranim izolatom gljivice optimizirani su korištenjem eksperimentalnog dizajna CCD modela površine odgovora [47]. Korištenjem CCD-a optimizirane su koncentracije komponenti medija, a njihove proučavane interakcije su korištene za generiranje ukupno 20 eksperimenata za tri varijable. Da bi se odredili optimalni nivoi varijabli za proizvodnju taksola iz snažnog izolata gljivice, trodimenzionalne (3D) površinske krive odgovora su ucrtane kako bi se proučavala interakcija između različitih faktora i odredilo stanje varijabli svakog faktora koji utiče na proizvodnju taksola. 3D grafikoni su izvedeni tako što su konstante tri faktora držane na idealnom nivou i ucrtan je dobijeni odgovor prinosa taksola za različite nivoe druga dva faktora.

Utjecaj gama zračenja na prinos taksola

Snažni endofitski izolati koji proizvode taksol bili su izloženi -zračenju sa 60izvorom kobalta (gama ćelija 4000-A-Indija) pri različitim dozama gama zračenja (0.25–3.0 kGy) u poređenju na kontrolu neozračene kulture; brzina doze 1,2 kGy/h u vrijeme eksperimenata. Optimizovane podloge su inokulisane ozračenom kulturom u standardnim uslovima kulture, u poređenju sa inokulumom neozračenih spora kao kontrolom. Kulture su inkubirane na 30±2 stepena tokom 15 dana na rotacionoj mešalici (120 rpm). Nakon inkubacije, kulture su filtrirane i taksol je ekstrahovan, prečišćen i kvantifikovan pomoću TLC i HPLC kao što je gore opisano.

Sinteza i karakterizacija nanočestica zlata (AuNPs); Konjugacija sa taksolom

Antikancerogena aktivnost taksola

Aktivnost pročišćenih konjugata Taxol i Taxol-PVP-AuNP protiv karcinoma jetre (HPG2) i karcinoma dojke (MCF7) određena je pomoću 3- (4,5-dimetiltiazol- 2-il) -2,5- test difenil tetrazolijum bromida (MTT) [48]. 96-Ploča za bunar je zasijana sa 103 ćelije po jažici i inkubirana preko noći na 37 stepeni, zatim su dodane različite koncentracije lijeka i ploče su ponovo inkubirane 48 h. Dodan je MTT reagens (25 ul) i inkubiran 2 h, a ljubičasta boja razvijenog formazanskog kompleksa je izmjerena na λ570 nm. Vrijednost IC50 izražena je količinom lijeka koja je smanjila rast od 50 posto od početnog broja tumorskih ćelija koje su se normalizirale u pozitivnu kontrolu.

Antimikrobna aktivnost taksola i konjugata taksol-AuNPs

Antimikrobna aktivnost konjugata Taxol i Taxol-AuNPs procijenjena je protiv različitih bakterijskih izolata; Bacillus subtilis ATCC 6633 i Staphylococcus epidermidis, Pseudomonas aeruginosa, Escherichia coli i Enterobacter agglomerans, pored Candida albicans. Testirane bakterijske ćelije su suspendovane u sterilnoj peptonskoj vodi da se dobije standardni inokulum od ~0.5 McFarland (1–1,5)× 1{{10}}8 CFU/ml na λ6{{18 }}0 nm. Inhibicija rasta (mm) rasta mikrobnih patogena procijenjena je metodom difuzije agar diska. Kao pozitivna kontrola korišćeni su sterilni standardni antibiotski diskovi prečnika 6,0 mm. Sterilni diskovi antibiotika (6,0 mm) napunjeni su sa 20 ul metanola i amoksicilin-klavulanske kiseline (AMC) kao negativna i pozitivna kontrola. Diskovi su napunjeni istom koncentracijom Taxol-a, Taxol-PVP-AuNP-a i AuNP-a (1,0 ug/ml). Pripremljene su tri biološke replike. Ploče su inkubirane na 37 stepeni tokom 24 h i merene su zone inhibicije. Amoksicilin klavulanska kiselina (AMC) i nistatin korišteni su za normalizaciju antimikrobne aktivnosti Taxola. Zona inhibicije rasta određena je noniusom (mm).

Statističke analize

Morfološka i molekularna identifikacija moćnih proizvođača taksola

Morfološke karakteristike snažnog gljivičnog izolata koji proizvodi taksol ispitane su prema makroskopskom i mikroskopskom opisnom ključu, kao što je opisano u materijalima i metodama, i otkrivena je njegova morfološka blizina sa A. favus (slika 2). Izolat gljive uzgajan je na PDA na 30 stepeni 10 dana, a makroskopske i mikroskopske karakteristike su otkrile njegov identitet kao što su konidijalne glavice, način grananja, identitet stigme i konidijalna ontologija i formiranje plodišta, prema univerzalnim morfološki ključevi [33], a utvrđeno je da su identični Aspergillus favus. Snažni izolat A. favus koji proizvodi taksol je dalje identifikovan na osnovu njihovih ITS sekvenci, koristeći gDNK kao šablon. PCR amplikoni (~550 bp) A. favus su razdvojeni, pročišćeni i sekvencionirani (slika 2). ITS sekvenca A. favus bila je neredundantna eksplozija pretraživana u NCBI bazi podataka, pokazujući 99 posto sličnosti sa A. favus, sa nula vrijednosti E. i 95 posto pokrivenosti upitima. Tako je mikroskopskim i molekularnim analizama ciljni izolat potvrđen kao A. favus i deponovan u GenBank sa pristupnim brojem MW485934.1, kao i izolat je deponovan u Univerzitetskom mikološkom centru Asiut (AUMC), Egipat sa broj depozita AUMC13892. Trenutni izolat je imao 99 posto sličnosti sa izolatima A. favus MW485934, MT446145, KJ863514, MW522551,

Slika 1 Morfološki prikaz biljke jojobe. B Pločaste kulture moćnih endofitskih gljiva koje proizvode taksol; A. favus Bd1 (13), A. niger Lv1 (21), Penicillium polonium (23) i A. oryzae Bd (25) na PDA nakon 8 dana o inkubaciji na 30 stepeni. Gljivični izolati su uzgajani na PDB-u i inkubirani u standardnim uslovima, a Taxol je ekstrahovan i proveren TLC (C). D HPLC hromatogram taksola iz potentnih izolata gljivica. E Prinos taksola kvantifikovan iz HPLC. F, UV-Vis spektralna analiza ekstrahovanog taksola iz izolata gljivica. G FT-IR analiza ekstrahovanog taksola u poređenju sa autentičnim

Slika 2 A Makromorfološke karakteristike A. favus endofita jojobe nakon 3, 5 i 8 dana rasta na PDA. Mikromorfološke karakteristike, konidijalna glava A. favus sa povećanjem od 400x. C PCR amplikon A. favus ITS regiona od 500 bp, normalizovan na lestvici od 1 kb (kat. br. SM0312). D Filogenetska analiza ITS A. favus metodom maksimalne vjerovatnoće [44]