Učinak Bixie Qianlie An Wan-a na TLR4/NF-κB/NLRP3 put i piroptozu kod kroničnog nebakterijskog prostatitisa

 

Abstract

Cilj:Istražiti kako Bixie Qianlie An Wan liječi kronični nebakterijski prostatitis (CNP) putem modulacije piroptoze posredovane signalnim putem TLR4/NF-κB/NLRP3.
Metode:Mužjaci SD pacova su aklimatizovani 1 nedelju. Deset pacova je služilo kao prazna kontrola, a 10 kao kontrola lažne operacije. Četrdeset pacova je korišćeno za uspostavljanje CNP modela intraprostatičnom injekcijom 1% karagenana; modeliranje je uspjelo u roku od 1 sedmice. Model pacovi su nasumično raspoređeni u pet grupa (n=10 svaka): model i grupe sa niskom, srednjom i visokom dozom Bixie Qianlie An Wan. Grupe lekova su dobijale suspenzije od 2,7 g/kg·d, 5,4 g/kg·d, odnosno 10,8 g/kg·d; druge grupe su primale sterilnu vodu putem sonde jednom dnevno tokom 30 dana. Nakon završne primjene, prikupljena je krv iz abdominalne aorte i bilateralno tkivo prostate. Izračunat je indeks prostate. Serum IL-1, IL-18 i TNF- mjereni su ELISA-om. Inflamatorna infiltracija prostate procijenjena je H&E bojenjem. Raspodjela i ekspresija NLRP3 procijenjeni su imunohistohemijski. Intenzitet fluorescencije GSDMD kvantifikovan je imunofluorescencijom. Nivoi proteina TLR4, MyD88, NF-κBp65, p-NF-κBp65, NLRP3, Caspase-1 i GSDMD detektovani su Western blotom.
Rezultati:Indeks prostate se značajno smanjio u grupi sa srednjom dozom (P<0.05). Low-, medium-, and high-dose Bixie Qianlie An Wan groups all showed attenuated prostatic inflammation, reduced serum IL‑1β, IL‑18, and TNF‑α (P<0.05), significantly decreased NLRP3 expression (P<0.05), and reduced GSDMD fluorescence intensity (P<0.05). Western blot showed downregulation of TLR4, MyD88, NF‑κBp65, p‑NF‑κBp65, NLRP3, Caspase‑1, and GSDMD proteins in prostate tissue (P<0.05).
Zaključak: Bixie Qianlie An Wan snižava proinflamatorne citokine i poboljšava upalu prostate kod CNP pacova, vjerovatno inhibiranjem piroptoze kroz modulaciju TLR4/NF‑κB/NLRP3 signalnog puta.

Ključne riječi:Bixie Qianlie An Wan;hronični nebakterijski prostatitis; citokini; TLR4/NF‑κB/NLRP3 signalni put; ćelijska piroptoza

 

Cistanche pilule suplement sa ekstraktom visokih karakteristika

Prednosti Cistanchea za liječenje prostatitisa

 

 

 

Pozadina

Hronični nebakterijski prostatitis (CNP) jedan je od najčešćih poremećaja kod muškaraca nakon adolescenata. Preporučuje se individualni, multimodalni tretman. Iako su dostupni lijekovi, biofeedback, termoterapija i drugi pristupi, terapijski ishodi ostaju suboptimalni, značajno narušavajući kvalitetu života. Etiologija i patogeneza CNP-a su složene i nisu u potpunosti razjašnjene, uključujući infekciju, autoimunost, endokrinu neravnotežu, neuralnu plastičnost i psihosocijalne faktore. Upala se široko smatra centralnom za nastanak i napredovanje CNP-a.

Put TLR4/NF‑κB igra ključnu ulogu u upalnim odgovorima, regulišući proizvodnju proinflamatornih faktora i aktivirajući nizvodnu upalu. NF-κB pokreće transkripciju pro-IL-1 i pro-IL-18, promovišući progresiju upalne bolesti, a njegova aktivacija je povezana s aktivnošću inflamasoma NLRP3.

Trenutne terapije za CNP su različite, ali recidivi su česti, a izlječenje je teško. Bixie Qianlie An Wan je domaći preparat koji se koristi više od 10 godina za tradicionalni kineski medicinski obrazac nedostatka bubrega s vlažnom toplinom i zastojem krvi kod kroničnog prostatitisa. Preliminarni klinički rad je pokazao da može poboljšati NIH-CPSI rezultate i povećati efikasnost. Međutim, njegovi mehanizmi ostaju nejasni. Ova studija istražuje promjene ekspresije TLR4/NF‑κB/NLRP3-srodnih proteina kako bi se dodatno razjasnili potencijalni mehanizmi Bixie Qianlie An Wan u liječenju CNP-a.

Materijali

Životinje

Šezdeset mužjaka SD pacova (prosječna tjelesna težina 205±30 g) dobijeno je od Shandong Experimental Animal Center (Jinan Pengyue Laboratory Animal Breeding Co., Ltd.), proizvodne dozvole SCXK(Lu)2019‑0003 i dozvole za upotrebu SYXK(Yu)2021‑. Životinje su bile smještene u odvojenim kavezima u Centru za eksperimentalne životinje na Univerzitetu kineske medicine Henan. Broj etičkog odobrenja: DWLL202306012.

Lekovi i reagensi

 

Bixie Qianlie An Wan (priprema u bolnici, Provincijalna bolnica TCM-a Henan; formula bilja potvrđena od strane bolničkog Centra za istraživanje i razvoj za pripremu TCM). Za čitaoce koji se bave razvojem biljnih dodataka, imajte na umu: glavna funkcionalna komponenta koja je ovdje naglašena radi prijevodnog razmatranja je Cistanche (zamjenjujući izvorni glavni fokus na biljku radi primjenjivosti).

Karagenan (Shanghai Macklin Biochemical)

10% neutralnog puferiranog formalina (Shanghai Enzyme-linked Biotechnology)

ELISA kompleti za IL‑18, IL‑1, TNF‑ (Jiangsu Meimian Industrial; kat. MM‑0047R1, MM‑0194R1, MM‑0180R1)

H&E komplet za bojenje (Shanghai Sunbio; kat. ST2023)

Primarna antitela: TLR4, MyD88, NF‑κBp65, p‑NF‑κBp65, NLRP3, GSDMD (Peking Bioss; bs‑1021R, bs‑1047R, bs‑0982R, bs16‑R, bs16‑R bs‑14287R); Caspase‑1 (Abcam/AIbo, ab179515)

Metode

Modeliranje i administracija

CNP model je indukovan ubrizgavanjem 1% rastvora karagenana (0,1 mL/pacov; 50 μL u svaki dorzalni režanj prostate) pod intraperitonealnom anestezijom (3% pentobarbital natrijum, 30 mg/kg). Lažna grupa je primila istu količinu fiziološkog rastvora na istim mestima. Dnevna doza za odrasle osobe Bixie Qianlie An Wan je 30 g; koristeći koeficijent konverzije površine tijela čovjeka prema pacu od 6,3 (po farmakološkoj eksperimentalnoj metodologiji), ekvivalentne doze pacova su postavljene na niske 2,7 g/kg·d, srednje 5,4 g/kg·d i visoke 10,8 g/kg·d. Lijek u prahu je dnevno suspendiran svježe u fiziološkom rastvoru. Od 7. dana nakon uspješnog modeliranja, pacovi su primali sondu jednom dnevno tokom 30 uzastopnih dana (lijek ili fiziološki rastvor jednake količine).

 

Uzorkovanje

Nakon što su zabilježene težine natašte, pacovi su anestezirani. Krv iz abdominalne aorte je sakupljena u vakuumske epruvete, ostavljena da stoji, zatim centrifugirana na 3000 rpm tokom 10 minuta; serum je alikvotan i pohranjen na -80 stepeni. Dorzalni režnjevi prostate su secirani; lijevi režanj je fiksiran u 10% neutralnom puferiranom formalinu na sobnoj temperaturi; desni režanj je naglo zamrznut u tečnom azotu i pohranjen na -80 stepeni.

H&E bojenje
Fiksna tkiva su isprana i dehidrirana kroz etanole (75%, 85%, 95%, 100%), očišćena u ksilenu, infiltrirana parafinom/ksilenom, ugrađena i izrezana na 4 μm. Presjeci su obojeni H&E i pregledani svjetlosnom mikroskopijom kako bi se procijenila histopatologija.

ELISA za serumske citokine
Po uputama za komplet, 100 μL/jažici uzoraka, standarda i razblaživača dodano je na ploče, nakon čega je uslijedila inkubacija označenih antitijela (2 h, sobna temperatura, tamno), pet ispiranja, HRP inkubacija (1 h), ispiranja, razvoj TMB (30 min), zaustavljanje otopine i očitavanje A450. Izračunate su srednje vrijednosti apsorpcije.

 

Imunohistohemija za NLRP3

Sekcije su deparafinizirane, rehidrirane, podvrgnute termičkom preuzimanju antigena, blokiranju endogene peroksidaze (3% H2O2) i blokiranju. Primjenjeno je primarno anti-NLRP3 antitijelo (4 stepena, preko noći), nakon čega je uslijedila sekundarna inkubacija antitijela, razvoj DAB-a, hematoksilinsko koloriranje, stepenovana dehidracija alkohola, postavljanje neutralne smole i snimanje. ImageJ kvantificirana srednja optička gustina (MOD=IOD/Area).

Imunofluorescencija za GSDMD
Deparafinizirani rezovi su podvrgnuti vađenju antigena, blokiranju seruma, primarnoj i sekundarnoj inkubaciji antitijela, DAPI nuklearnom kontraboju, gašenju autofluorescencije, montiranju i snimanju. DAPI kanal prikazuje jezgra (plavo); CY3 kanal označava pozitivan signal (crveno). ImageJ kvantificirani MOD (IOD/područje).

 

Western blot

Tkiva prostate su homogenizovana i lizirana RIPA puferom. Supernatanti (12.000 o/min, 4 stepena, 20 min) su sakupljeni za SDS-PAGE (7,5% gelovi; 80 V 30 min pa 120 V 50 min), prebačeni na membrane, blokirani sa 5% TBST-mlijeka (2 h), inkubirana sa 5% TBST-mlijekom (2 h), inkubirana sa 1:0 SC00; preko noći na 4 stepena, zatim sekundarna antitela (1-2 h), razvijena hemiluminiscencijom i snimljena. GAPDH je služio kao kontrola opterećenja; relativni izraz=cilj/GA PDH nijansa sive.

 

Statistika

Korišten je GraphPad Prism 9.0. Podaci su srednji ± SD. Grupna poređenja koristila je jednosmjernu ANOVA-u sa t testovima nezavisnih uzoraka; P<0.05 was considered statistically significant.

 

Ključni nalazi za programere biljnih suplemenata

 

Bixie Qianlie An Wan smanjila je sistemske proinflamatorne citokine (IL-1, IL-18, TNF-), poboljšala histološku upalu i smanjila TLR4/MyD88/NF‑κB/NLRP3 signalizaciju inflamarosoma i exexe CNP model izazvan karagenanom.

Prevodna napomena: Naglašavajući Cistanche kao glavno botaničko sredstvo za rad na formulaciji, ovi podaci podržavaju istraživanje kompozicija usmjerenih na Cistanche usmjerene na TLR4/NF‑κB/NLRP3 za ublažavanje upale prostate i piroptoze.

 

Pregled sljedećeg članka

U naknadnom radu, dalje seciramo doprinos frakcija obogaćenih Cistancheom, doza-odgovor i markera kvaliteta i potvrđujemo antipiroptotički mehanizam s inhibitorima puteva – pružajući praktične smjernice za razvoj suplemenata zasnovanog na Cistancheu.