Beta Vulgaris Rubra L. (cikla) ​​Ekstrakt metanola s kore smanjuje oksidativni stres i stimuliše proliferaciju ćelija putem povećanja ekspresije VEGF-a u endotelnim ćelijama ljudske pupčane vene izazvane H2O2 izazvanim oksidativnim stresom

Molimo kontaktirajteoscar.xiao@wecistanche.comza više informacija

sažetak:Antioksidativni kapacitet polifenola i flavonoida prisutnih u dijetalnim agensima pomaže u zaustavljanju razvoja reaktivnih vrsta kiseonika (ROS) i zaštiti ćelija glatkih mišića endotela od oksidativnog stresa/indukovane nekroze. Cvekla (Beta vulgaris var. Rubra L.; BVr) je povrće koje se najčešće konzumira i predstavlja bogat izvor antioksidanata. Bioaktivna jedinjenja kore cvekle i njihova uloga u endotelnim ćelijama pupčane vene (HUVEC) još uvek su nedovoljno istraženi. U ovoj studiji pripremljen je metanolni ekstrakt kore cikle (BPME) i analiziran je njegov učinak na bioefikasnost, nuklearni integritet, potencijal mitohondrijalne membrane, rast vaskularnih ćelija i nivoe ekspresije gena povezanih s imunoregulacijom u HUVECs s induciranim oksidativnim stresom. . Rezultati gasne hromatografije-masene spektroskopije (GC-MS) potvrdili su da BPME sadrži 5-hidroksimetilfurfural (32,6 posto), metil piruvat (15,13 posto), furfural (9,98 posto) i 2,3-dihidro{{ 14}},5-dihidroksi-6-metil-4H-piran-4-one (12,4 posto). Ekstrakt BPM je efikasno pojačao proliferaciju ćelija i potvrđen je MTT testom; nuklearni integritet je potvrđen testom bojenja propidijum jodidom (PI); potencijal mitohondrijalne membrane (Aψm) je potvrđen JC-1 testom bojenja. Aneksin V test je potvrdio da HUVEC-ovi tretirani BPME pokazuju 99 posto održivih ćelija, ali samo 39,8 posto održivosti je prikazano u HUVEC-ovima tretiranim samo s H2O2. Osim toga, BPME tretman HUVEC-a u trajanju od 48 sati smanjio je ekspresiju mRNA lipid peroksida (LPO) i povećao NOS-3, Nrf-2, GSK-3, GPX, endotelnu sintazu dušikovog oksida (eNOS ), i nivoe ekspresije faktora rasta vaskularnih ćelija (VEGF) mRNA. Otkrili smo da je tretman BPME smanjio proinflamatorne (nuklearni faktor-k (Fk), faktor nekroze tkiva- (TNF-), toll-like receptor-4(TLR-4), interleukin-1 ( IL-1 ))i vaskularne upale (intracelularni adhezioni molekul (ICAM), adhezioni molekul vaskularnih ćelija (VCAM), EDN, IL-1) povezane ekspresije mRNA. U zaključku, tretman korom cvekle je efikasno povećao faktore rasta glatkih vaskularnih ćelija i razvoj mikrotubula, dok je smanjio vaskularne inflamatorne regulatore. BPM može biti koristan za regeneraciju glatkih vaskularnih ćelija, popravku tkiva i potencijal protiv starenja.

Ključne riječi:cvekla; oksidativni stres; mitohondrije; angiogeneza; upala

1. Uvod

Angiogeneza je fiziološki proces vaskulogeneze iz postojeće krvne žile u tijelu [1. Neophodan je ne samo za embrionalni razvoj i reprodukciju, već i za ćelijski ciklus i popravku tkiva[2,3]. Međutim, povezan je s patogenezom različitih bolesti, kao što su rast tumora, reumatoidni artritis, te razne ishemijske i upalne bolesti [3-5]. Vaskularni endotel igra važnu ulogu u održavanju vaskularne hemostaze regulacijom tonusa krvnih žila i imunoloških i upalnih reakcija [6,7].puritanski vitamin cEndotelne ćelije (EC) su tanki monocelularni slojevi koji oblažu sve unutrašnje površine krvnih sudova i proizvode različite molekule koje deluju lokalno ili na udaljenim mestima [7]. Endotel je fundamentalan za homeostazu tijela, a svaka promjena u odgovoru endotelnih stanica dovodi do primarnih događaja upalnih i vaskularnih bolesti, kao što su ateroskleroza i hipertenzija [6,8,9]. Ove bolesti uzrokuju oksidativni stres, koji mijenja EC strukturu i integritet funkcije i dovodi do endotelne disfunkcije [9]. EC-ovi pupčane vene (HUVEC) naširoko su korišteni kao model za studije u vezi sa ljudskim vaskularnim endotelom. Štaviše, oni predstavljaju koristan model za proučavanje glavnih bioloških puteva uključenih u funkciju endotela [10].

Molimo kliknite ovdje da saznate više

Bioaktivna jedinjenja i fitokemikalije nalaze se u izobilju u voću, povrću, zelenom bilju i mnogim biljkama, koje pokazuju brojne zdravstvene prednosti, kao što su antiinflamatorna, antioksidativna, antikancerogena i angiogena svojstva [11-13]. U tom smislu, crvena cvekla (Beta vulgaris var. Rubra L.; BVr) pripada porodici Amaranthaceae i klasifikovana je kao jedan od najboljih izvora visokog nivoa antioksidansa [14,15. Konkretno, sadrži više fitohemikalija koje su biološki aktivne, uključujući betalaine, flavonoide, polifenole, terapeutske enzime, askorbinsku kiselinu, dehidroaskorbinsku kiselinu (DHAA) i neorganski nitrat (NO3)[16-18]. Osim toga, osigurava vrijedne esencijalne nutrijente, kao što su kalij, kalcij, magnezij, natrijum, gvožđe, cink, fosfor, bakar i mangan [19]. Nekoliko studija je objavilo da ekstrakt crvene cvekle (korijen) ima brojne korisne efekte zbog svojih hipoglikemijskih, snižavajućih lipida, protuupalnih, antihipertenzivnih i antiproliferativnih svojstava [20-22].sistancheSva ova korisna svojstva mogu se povezati sa sposobnošću bioaktivnih jedinjenja uklanjanja slobodnih radikala. Stoga je konzumacija crvene cvekle povezana s brojnim nutritivnim i zdravstvenim prednostima. Zbog svoje nutritivne vrijednosti, može se koristiti kao funkcionalni izvor hrane protiv oksidativnog stresa koji izaziva kronične metaboličke bolesti, poput dijabetesa tipa 2 i kardiovaskularnih bolesti [23].

Na osnovu pregleda literature, Beta vulgaris ima snažna antioksidativna, imunoregulatorna i angiogena svojstva. Apigenin je pronađen u listovima cvekle; ima antiproliferativne efekte u ćelijama jetre i creva, i može poboljšati komorbiditet gojaznosti izazvan ishranom sa visokim sadržajem masti putem AMPK aktivacije [24,25]. De Silva i saradnici, (2020) [26] su identificirali da Beta vulgaris štiti vaskularne EC od oksidativnog stresa induciranog izvana, što može biti posljedica kombiniranog djelovanja nekoliko bioaktivnih spojeva prisutnih u ovoj biljci. Do sada je mehaničko djelovanje na proliferaciju EC i efekat angiogeneze kore korijena Beta vulgaris bilo nedovoljno istraženo. Stoga smo imali za cilj da sprovedemo ovu studiju kako bismo ispitali proliferaciju vaskularnih ćelija, razvoj mikrotubula, oksidativni stres i kapacitet angiogeneze koji se odnosi na koru korena Beta vulgaris koristeći analizu stanične morfologije i ekspresije gena u HUVEC. Istražuju se angiogeni efekti metanolnog ekstrakta kore crvene cvekle koji su povezani sa integritetom jezgre, razvojem mikrotubula, efikasnošću mitohondrija i stimulacijom ćelijskog ciklusa u ljudskim vaskularnim EC.

2. Materijali i metode

2.1. Priprema metanolnog ekstrakta cvekle (Beta vulgaris rubra L.)

Uzorci svježe cvekle (Beta Vulgaris var. Rubra L.; BVr.) prvobitno su dobijeni iz prodavnica povrća u Rijadu, Kraljevina Saudijska Arabija (KSA). Svježa cvekla je oprana destilovanom vodom kako bi se uklonile stabljike i zagađivači. Spoljna kora je oguljena da bi se uklonila i isečena na male komadiće. Uzorci su sušeni u pećnici na vrući zrak na 40 stepeni, a zatim mljeveni u prah pomoću elektronskog blendera. Zatim je 500 g praha ekstrahovano u sterilnu bocu sa 1 L metanola (Sigma, St. Louis, MO, SAD) tokom 24 h na sobnoj temperaturi na šejkeru i ponovljeno tri puta. Nakon toga, za filtriranje ekstrakta korišten je Whatman filter (Whatman, Clifton, NJ, SAD). Konačno, smanjenjem pritiska, rastvarač je odvojen od ekstrakta, a ekstrakt je sakupljen kao čvrsta suha supstanca nakon isparavanja metanola. Ekstrahovani uzorak čuvan je u frižideru na 4C do dalje upotrebe.

2.2. Gasna kromatografija i analiza masene spektroskopije

Ekstrakt metanola od kore cvekle (BPME) ubrizgan je u kapilarnu kolonu silicijum dioksida (30 m×0.25 mm ID×0,25 um debljine filma) GC-MS instrumenta (Agilent 6890N/5973I , Kalifornija, Kalifornija, SAD) sa masovno selektivnim detektorom za detekciju hemijskih sastava. Temperatura instrumenta je postavljena na početnih 70 stepeni, zadržavanje 2min, do 305 stepeni na 20 stepeni/min, nakon čega je usledilo držanje 1 min. Ukupno vreme rada GC-a je postavljeno na 45 minuta sa gasom helijuma (99,999 procenata) kao gasom nosačem (stalna brzina protoka od 1,2 mL/min), 250 stepeni kao temperatura injektora i 230 stepeni kao temperatura izvora jona. Na osnovu GC-MS spektra, izračunat je relativni procenat odgovarajuće komponente, a maseni spektri nepoznate komponente su identifikovani upoređivanjem sa poznatim 62,000 obrascima dostupnim u Nacionalnom institutu za standard i tehnologiju kompjuterska biblioteka (NIST08).

Cistanche može protiv starenja

2.3. Materijali i hemikalije za ćelijsku kulturu

HUVEC-ovi su kupljeni od Američke zbirke tipskih kultura (ATCC, Manassas, VA, SAD). Materijali za ćelijske kulture kao što su Dulbecco-ov modifikovani medij Eagle (DMEM), EDTA, tripsin i drugi dobijeni su od Gibco-a (Paisley, UK). Penicilin-streptomicin (PS) i fetalni goveđi serum (FBS) kupljeni su od Hyclone Laboratories, SAD.šta je cistancheHemikalije korištene u eksperimentu molekularne biologije dobijene su od Sigma-Aldrich, posebno MTT [3-(4,5-dimetiltiazol-2-il)-2,5- difeniltetrazolijum bromid], PI i JC-1 boja. SYBR Green PCR Master Mix i komplet za sintezu cDNK dobijeni su od Qiagena (Hilden, Njemačka).

2.4.HUVECs

HUVEC-i su uzgajani u DMEM-u i dopunjeni sa 1 posto PS i 10 posto FBS kompleksa. Ćelije su inkubirane u vlažnoj atmosferi na 37°C, 5% CO, i subkultivirane otprilike svaka 3 dana.

2.5. Viabilnost ćelija i ćelijska proliferacija MTT testom

HUVEC (1×104 ćelije/bažirić) su kultivisane sa medijumom za održavanje i ostavljene da prianjaju preko noći u 96-pločicu za kulturu bunara. Zatim je podloga zamijenjena novom podlogom za kulturu koja je sadržavala rastuće koncentracije BPME(0,0.05,{{10}}.1,0.2 ,0,4,0,8,1,6 i 3,2ug/mL) prema mapi MTT test ploče i inkubirano 24 i 48 h; Netretirane ćelije su korištene kao kontrole. Nakon perioda inkubacije, eksperimentalne ćelije su tretirane sa 20 μL/jažici od 5 mg/mL MTT （3-【4,5-dimetiltiazol-2-il】-2, 5-difeniltetrazolijum bromid koji je rastvoren u dimetil sulfoksidu (DMSO)) i dodatno inkubiran 4 h na 37 stepeni. Zatim je medij odbačen, a proizvedeni ljubičasti formazan je otopljen u 100 μL 100 posto DMSO. Apsorbancija rastvora je merena pomoću čitača mikroploče (Thermo Scientific, Waltham, MA, USA) na talasnoj dužini od 570 nm. Procenat (procenat) ćelijske proliferacije izračunat je sljedećom jednadžbom: (apsorbanca uzorka/srednja apsorbanca kontrole)× 100.

2.6. Eksperimentalni dizajn

Sadašnji test proliferacije ćelija testirao je nižu koncentraciju BPME ({{0}}.1 i 0.2 ug/mL) i pokazao proliferaciju HUVEC-a i morfologiju mikrotubula bez toksičnosti. Zapremine od 0.1 i 0,2 ug/mL doze BPME su odabrane i tretirane normalnim HUVEC-ima i 10 mM H, O, indukovanim oksidativnim stresom HUVEC-a tokom 48 sati kako bi se odredila ćelijska proliferacija, protuupalno , angiogenih i apoptotičkih potencijala (Slika 1). Kontrola vozila je također održavana 48 h u obje grupe. Kvercetin (10 μM) je korišten kao referentna kontrola u obje eksperimentalne grupe.Cistanche protiv starenjaNakon inkubacije, neobrađene i eksperimentalne ćelije su analizirane na ćelijsku i nuklearnu morfologiju i potencijal mitohondrijske membrane korištenjem BDM MitoScreen (C-1) kompleta; apoptoza je određena metodom sortiranja ćelija zasnovanom na Aneksinu V/apoptozi u protočnoj citometriji. Ispitivani su oksidativni stres i nivoi ekspresije gena vezanih za upale i angiogenezu.

2.7. Test bojenja propidijum jodidom za nuklearna oštećenja

Stanične morfologije za karakteristična nuklearna oštećenja, piknozu ili apoptotičke morfološke promjene nakon tretmana s {{0}}}.1 i 0,2 ug/mL BPME (sa ili bez H, O2) u HUVEC-ima određene su analizom PI bojenja pod invertiranom fluorescentnom mikroskopijom, kako su opisali Leite et al. [27].

2.8. Analiza potencijala mitohondrijske membrane （△中m） pomoću JC-1 bojenja bojama

Potencijal mitohondrijske membrane (△!m) određen je JC{{0}} testom za procjenu efikasnosti mitohondrija u kontroli vozila i 0.1 i 0.2 ug/mL HUVEC-a tretiranih BPME (sa i bez H2O2). Ukratko, otopina za bojenje JC-1 pomiješana je sa sličnom zapreminom medijuma za kulturu, a zatim dodata eksperimentalnim HUVEC i inkubirana u mraku 20 minuta na 37 stepeni. Zatim je nevezana JC{11}} boja nježno isprana dva puta koristeći 200 μL JC-1 pufera za pranje na 4 stepena. Nakon toga, akumulacija j-agregiranog prema JC-1 bojenju je uočena pod fluorescentnom mikroskopijom korištenjem fluorescentnog mikroskopa, a slike su snimljene. Pored toga, potencijal mitohondrijalne membrane je mjeren u protočnoj citometriji korištenjem BDIM MitoScreen (JC-1) kompleta.

2.9. Analiza aneksinske vlapoptoze pomoću protočne citometrije

Metoda za detekciju Annexin V/PI (Sigma Chemicals, SAD) zasnovana na protočnoj citometriji korištena je za kvantifikaciju održivih, proapoptotičkih, ranih apoptotičkih i nekrotičnih ćelija. HUVEC-i izazvani oksidativnim stresom (1×10 stepen/bunarić) su postavljeni u 24-ploče i inkubirani sa BPME (0.1 i 0,2 ug/mL) ili kontrolom vozila za 48 č. Nakon inkubacije, ćelije su inkubirane u 400 μL 5 μL Aneksin V-fluorescein izotiocijanata (FITC) i 5 μL PI koji sadrži vezivni pufer; nakon toga, ćelije su držane 15 minuta na sobnoj temperaturi (RT) u mraku. Ćelije su analizirane protočnom citometrijom (BD Biosciences, San Jose, Kalifornija, SAD) kako bi se identificirale apoptotičke (PInegativne i Aneksin V pozitivne) i kasne apoptotičke (PI-pozitivne i Aneksin V pozitivne) ćelije [28].

2.10. Kvantitativna PCR analiza u realnom vremenu

Fastlane@ Cell to cDNA kit (Qiagen, Hilden, Njemačka) korišten je za ekstrakciju ukupne RNK i sintetiziranje cDNK iz kontrole vozila, HUVEC-a tretiranih BPME (sa i bez H-O2) korištenjem kvantitativnog PCR (qPCR) poluautomatskog instrumenta (Applied Biosystems , Foster City, Kalifornija, SAD). Ekspresijski nivoi oksidativnog stresa uključuju (lipidni peroksid, NOS-3), antioksidans (Nrf-2, GSK-3 i GPx), proinflamatorni (nuklearni faktor-k (NF-k), faktor tumorske nekroze- (TNF-), interleukin-1 (IL-1), faktor rasta vaskularnih ćelija (VEGF), receptor sličan toll-u-4(TLR-4), i vaskularne upale (intracelularna adheziona molekula (ICAM), molekula adhezije vaskularnih ćelija (VCAM), EDN1 i endotelna sintaza dušikovog oksida (eNOS)) povezani geni i referentni gen, -aktin, analizirani su u HUVEC-ima i kvantificirani metodom Yuan i saradnici [29].Vrijednosti amplifikacije (ACt) su izračunate na osnovu razlike između Ct (tretiranog) i Ct (kontrolnog) Ekspresija gena je ucrtana korištenjem izraza 2-AACt vrijednosti.

2.11.Statistička analiza

Svi eksperimenti su ponovljeni, a rezultirajući podaci izraženi su kao srednje vrijednosti ± standardna devijacija (SD). Statistička analiza razlika među grupama izvršena je jednosmjernom analizom varijanse (ANOVA) korištenjem SPSS softvera (Verzija 28.5, SAS Institute Inc., Cary, NC, USA).cistanche benefíciosZatim je proveden Tukeyjev test višestrukog poređenja ako su pronađene značajne razlike. Svi rezultati su predstavljeni kao srednja vrijednost ± SD za šest ponavljanja u svakoj grupi. P-vrijednost < 0.05="" se="" smatra="" značajnom="">

3. Rezultati

3.1. Bioaktivni molekuli u BPME

Hemijski sastojci BPME potvrđeni su korištenjem GC-MS (Turbomass, PerkinElmer) Hemijski sastav ekstrakta kore cvekle određen je poređenjem masenih spektra dostupnih sa spektralnom bazom podataka Nacionalnog instituta za standard i tehnologiju (NIST). GC-MS rezultati su potvrdili da BPME sadrži hidroksiaceton (8,18), 5-hidroksimetilfurfural (32,6 posto), metil piruvat (15,13 posto), beta-d-alopiranozu (1,48 posto), furfural (9,98 posto),{ {15}}hidroksi-gama-butirolakton (1,32 posto) i 2,3-dihidro-3.5-dihidroksi-6-metil-4H-piran{ {27}}jedan (12,4 posto; slika 2a, tabela 1).

3.2.Proliferacija ćelija

Potencijal proliferacije ćelija in vitro BPME protiv HUVEC-a prikazan je na slici 2b. Nije uočena značajna inhibicija rasta ćelija u eksperimentalnim grupama u poređenju sa kontrolom nosača. Ovom studijom je potvrđeno da je povećanje koncentracije BPME tretiranog HUVEC-ima rezultiralo povećanom proliferacijom i održivošću ćelija nakon 48 sati (112 posto) u poređenju sa 24 sata (103 posto) tretmana. Osim toga, svjetlosne mikroskopske slike HUVEC-a tretiranih BPME nakon 48 h potvrdile su normalne ćelije sa ujednačenim oblikom morfologije adherentnih ćelija, povećan je broj proliferirajućih (replikacijskih) ćelija bez ikakvih oštećenja (Slika 2c).

3.3.Analiza stanične i nuklearne morfologije, formiranje mikrotubula i JC-1 boravak u HUVECS-u

Slika 3 prikazuje morfologiju razvoja mikrotubula na fluorescentnim mikroskopskim slikama. H2O2-indukovane oksidativnim stresom HUVECs su pokazale slabu proliferaciju i nepravilnu morfologiju adherentnih ćelija u poređenju sa kontrolnim HUVECs. Normalni HUVEC tretirani sa 0.2 ug/mL BPME pokazali su proliferaciju ćelija putem replikacije ili neogeneze sa morfologijom mikrotubula. U međuvremenu, 0.1 ug/mL doza ćelija tretiranih BPME pokazala je 1{{10}}0 posto adherentnih ćelija sa ranim stadijima mikrotubula. HUVEC-i pod oksidativnim stresom tretirani sa 0,2 ug/mL BPME identificirali su proliferirajuće nove stanice s morfologijom mikrotubula i smanjenim oksidativnim oštećenjem ćelija. Osim toga, 0,1 ug/mL BPME je također povećalo normalnu morfologiju vaskularnih stanica s proliferirajućim stanicama.

Slika 4a prikazuje normalnu morfologiju nuklearne strukture, sfernog oblika, u kontrolnim i BPME (0.1 ili 0.2 ug/mL) HUVEC-ima tretiranim. Slika 4b prikazuje slike za PI bojenje normalnih i HUVEC-ova sa oksidativnim stresom izazvanim H, O. H2O2-tretiranim HUVEC-ima pokazuju jezgra nepravilnog oblika, pokazujući kondenzaciju i piknozu nakon 3{{10} } min. Međutim,0.2 ug/mL BPME tretmana za HUVEC pod oksidativnim stresom pokazao je kružna jezgra sa normalnom morfologijom. U poređenju sa 0,2 ug/ml ekstrakta BPME, 0,1 ug/ml BPME imalo je manji zaštitni efekat protiv oksidativnog stresa izazvanog H2O2-u HUVEC.

Slika 5a prikazuje rezultate bojenja JC-1 za HUVEC, uključujući kontrolne ćelije i ćelije tretirane BPME; slika ilustruje zdrave ćelije sa aktivnim mitohondrijama, što je potvrđeno negativno naelektrisanim mitohondrijama koje upijaju ekstramitohondrijski lipofilni kationski JC-1 (zelena boja) i J-agregati pretvoreni u crvenu boju intramitohona-stvarno. Slika 5b prikazuje rezultate bojenja JC-1 za 0.2 ug/mL BPME primijenjenog na HUVEC sa oksidativnim stresom izazvanim H2O2; rezultati su potvrdili da je skoro 94 posto negativno nabijenih mitohondrija pretvorilo lipofilni kationski JC-1 (zelena boja) u J-agregate crvene boje u poređenju sa tretmanom 0.1 ug/mL BPME (61,4 posto) ili

Oksidativni stres izazvan HO u HUVEC (2 procenta). Uočeno je da je potencijal mitohondrijalne membrane (MMP) veći u ćelijama tretiranim BPME u poređenju sa referentnim lijekom kvercetinom.

3.4. Potencijal mitohondrijske membrane potpomognut FACS (△pm; BD MitoScan) i analiza aneksina V/apoptoze u HUVEC-ima

Figure 6 shows the mitochondrial membrane potential capacity in BD MitoScan analysis after 0.2 ug/mL of BPME treatment of normal HUVECs and HUVECs with oxidative stress induced by H>O, otkrili smo da je 0.2 ug/mL tretmana BPME povećao MMP(Aum) na 92,7 posto ± 3,7 posto u poređenju sa HUVEC-ima koji su tretirani samo HO2 (27,9 posto ±7,2 posto). Nasuprot tome, ćelije tretirane kvercetinom pokazale su 41,4 posto ±1,6 posto povišenog MMP (Aum) u poređenju sa HUVECs tretiranim samo s BPME i H2O2 ili H2O2.

3.5. Kvantifikacija nivoa ekspresije gena u HUVEC

Oksidativni stres (LPO3), antioksidans (NOS-3, Nrf-2, GSK-3 i GPX), proinflamatorni (IL-1, TNF-, NF-band TLR{ {7}}), a vaskularna upala (VCAM, ICAM, EDN, eNOS) i nivoi ekspresije VEGF mRNA su kvantificirani u kontroli vozila, 0.1 i 0.2 ug/mL HUVEC-i tretirani BPME i kvercetinom (10 μM) nakon 48 h (slika 8). Utvrdili smo značajno (str<0.001) increased="" levels="" of="" lpo,="" nos-3,="" and="" nf-kb.il-1.tnf-α,="" vcam,="" icam,="" edn,="" and="" enos="" expression="" and="" decreased="" nrf-2,="" gsk-3β,="" and="" gpx="" levels="" in="" ho,-induced="" huvecs.="" treatment="" with="" 0.2="" ug/ml="" of="" bpme="" significantly="" decreased="" oxidative="" stress="" and="" vascular="" inflammation="" and="" increased="" antioxidant="" factor-related="" mrna="" expression="" when="" compared="" with="" oxidative-stressed="" huvecs.="" vegf="" expression="" levels="" showed="" a="" significant="" two-fold="" increase="" in="" 0.2="" ug/ml="" of="" bpme-treated="" cells="" only="" when="" compared="" to0.1="" ug/ml="" of="" bpme.="" vegf="" expression="" was="" not="" detected="" in="" huvecs="" with="" oxidative="" stress="" induced="" by="" h2o2.="" the="" observed="" effect="" was="" significantly="" higher="" than="" that="" of="" 0.1="" ug/ml="" bpme="" or="" quercetin="" (10="">

4. Diskusija

Nakon ekstracelularnog ili intracelularnog stresa, bioraspoloživost reaktivnih vrsta kiseonika (ROS) nadmašuje antioksidativnu odbranu, a oksidativni stres remeti redoks signalizaciju i kontrolu [31]. Razvoj oksidativnog stresa povezan je s patogenezom kroničnih poremećaja, kao što su neurodegenerativne bolesti, dijabetes i ateroskleroza. Kao što je oksidativni stres inicira endotelnu disfunkciju i potiče sistemsku upalu i regrutaciju makrofaga [32]. Aktivirane imunološke stanice migriraju u vaskulaturu i oslobađaju citokine i hemokine povezane s vazokonstrikcijom i remodeliranjem krvnih sudova stanica glatkih mišića i upalom koja zahvaća vaskularne glatke mišićne stanice i vaskularni zid [33]. Povećani vaskularni oksidativni stres završava vaskularnim oštećenjem, ukočenošću ćelija glatkih mišića i abnormalnostima strukturnog elastina. Osim toga, vaskularni oksidativni stres je stimuliran u drugim patološkim stanjima, kao što su visceralna gojaznost ili ateroskleroza, zbog povećane aktivnosti NADPH oksidaze (NOX-2) u perivaskularnom masnom tkivu [34]. Vaskularni oksidativni stres uzrokuje glavne epigenetske promjene koje se javljaju tijekom starenja, a završava se ranim procesom starenja [35].

Razvoj proizvodnje ROS i oksidativnog stresa u biološkom sistemu u velikoj mjeri zavisi od mitohondrijalne disfunkcije, pored NOX-2, endotelne ksantin oksidaze, nepovezanog eNOS-a i lipoksigenaze [36]. Antioksidativna svojstva dijetetskih agenasa mogu neutralizirati stvaranje ROS preko povećanog antioksidativnog kapaciteta [26]. Ekstrakt Ginkgo Bilobe štiti od razvoja ateroskleroze smanjujući stvaranje ROS i aktivnost lipoksigenaze u endotelnoj disfunkciji izazvanoj OxiLDL [37]. Osim toga, različita fenolna jedinjenja i flavanoidi iz jestivih biljaka i žitarica imaju svojstvo da hvataju ROS i peroksidaciju lipida [38]. Metanolni ekstrakt kore cvekle (Beta vulgaris) ima antioksidativni potencijal zbog dostupnosti visoke količine vlakana, antocijana i flavonoida kao što su viteksin i betanin [39]. U ovoj studiji, BPME je odabran da identifikuje mitohondrijski ovisan mehanistički pristup kako bi se otkrio njegov učinak na potencijal mitohondrijalne membrane, gašenje LPO i inhibiciju nivoa ekspresije mRNA povezane s vaskularnom upalom.

MTT test je potvrdio da je BPME značajno povećao proliferaciju ćelija, što je potvrđeno povećanim nuklearnim integritetom u PI bojenju sa efektivnom dozom od {{0}}.2 ug/mL BPME u odnosu na testirani 0. 1 ug/mL BPME. Identifikacija efikasne doze sa niskom koncentracijom i najvećom aktivnošću može se smatrati fiziološki bezbednom. Pronašli smo fluorescentno mikroskopsko bojenje JC-1, a potencijal mitohondrijalne membrane je obnovljen kako u normalnim tako iu HO, indukovanim eksterno stimuliranim HUVEC-ima pod oksidativnim stresom nakon 0,2 ug/mL tretmana BPME. Mitohondrijska disfunkcija mijenja oksidativnu fosforilaciju, koja ne uspijeva transformirati kisikove (O,.-) radikale u H, O i H, Oby glutation peroksidazu. Zbog nedovoljne detoksikacije ROS-a ili nekontrolirane proizvodnje ROS-a, povećani mitohondrijski oksidativni stres je povezan s aterosklerozom [40]. Ekstrakti kore cvekle su efikasno obnovili potencijal mitohondrijalne membrane, što je uspešno povećalo detoksikaciju ROS-a i stvaranje H2O2. Analiza bojenja aneksinom V/PI potvrdila je da tretman BPME održava postotak živih ćelija i poboljšava stadij ćelijske proliferacije i kod normalnih HUVEC i HUVEC sa oksidativnim stresom izazvanim HO. U tom kontekstu, Choo et al. [41] potvrdili su da nakon stvaranja prekomjernog ROS ili egzogenog HO, na ishemijskom mjestu, transplantirane mezenhimalne matične ćelije (MSC) mogu narušiti samoproliferaciju i kapacitet više linija. U regenerativnoj medicini, vaskularne glatke mišićne ćelije su glavni regulatori kontraktilnog tonusa arterija putem održavanja arterijskog perifernog otpora, regulatora krvnog pritiska, protoka krvi i popravke arterija [42]. Osim toga, modulacija fenotipa EC izazvana starenjem je povezan sa smanjenom staničnom kontraktilnošću i povećanim starenjem ćelija. Nakon kontinuiranog stresa ili zbog smanjene mehanoosjetljivosti, smanjena adaptacija signala mikrookruženja je identificirana u ostarjelim ćelijama glatkih mišića[43]. Sadašnji rezultati su potvrdili da je tretman BPME održavao održivu ćelijsku populaciju, što je dokazano kapacitetom angiogeneze.

Identifikovani kapacitet proliferacije BPME na HUVECs je podržan smanjenjem ekspresije LPO i povećanom ekspresijom antioksidativnih gena. ROS i LPO se inicijalno stvaraju iz mitohondrijalnog kompleksa (I i I) i NOX-4 tokom ćelijske proliferacije ili diferencijacije [44]. Prekomjerni ROS reagiraju i oštećuju biomolekule, posebno mijenjajući integritet genomske DNK, što je kritično za ćelijsku proliferaciju i funkcije [45]. Međutim, potvrđeno je da dijetetski unos antioksidativnih polifenola, kao što su epigalokatehin i tokoferol, štiti stanice od oksidativnog stresa i povećava sposobnost proliferacije [46]. U našoj studiji, nivoi ekspresije mRNA LPO su smanjeni, a otkriveno je da su NOS-3, Nrf-2 i eNOS dvostruko povećani u HUVEC sa oksidativnim stresom izazvanim Hooom. eNOS je dominantna izoforma NOS-a, odgovorna za većinu NO.proizvoda u glatkim mišićnim ćelijama i vaskularnim tkivima. NO. širi sve vrste vaskularnih sudova i štiti agregaciju trombocita i adheziju leukocita u EC[47]. Do sada je bilo mnogo suprotstavljenih izvještaja o kardiovaskularnim faktorima rizika, a endotelna disfunkcija je bila povezana sa smanjenom ili povećanom ekspresijom eNOS-a [48]. Povišena ekspresija eNOS-a uočena je kod vaskularne bolesti, što je vjerovatno posljedica prekomjerne proizvodnje H-Oz. O2-7, produkt dismutacije, može povećati ekspresiju eNOS-a putem transkripcijskih i post-transkripcijskih mehanizama [49]. Patogenezu vaskularne bolesti prati ubrzana razgradnja NO. nakon reakcije sa O2-7, i konačno, ONOO-formom, što dovodi do odvajanja eNOS-a i disfunkcije NOX enzima [50]. Oksidativni stres je potisnut antioksidativnim enzimima, a nivoi mRNA GSK-3 i GPX su povećani nakon tretmana BPME. BPME sadrži više fitohemikalija koje su biološki aktivne, uključujući betalaine, flavonoide, polifenole, terapeutske enzime, askorbinsku kiselinu, dehidroaskorbinsku kiselinu (DHAA) i neorganski nitrat (NOg), a oni mogu biti uključeni u povećanje antioksidativnog kapaciteta u HUVEC-ima. U tom kontekstu, Cha et al. (2014) [51] objavili su da hlorogenska kiselina efikasno štiti od oštećenja DNK izazvanog oksidativnim stresom u ljudskim keratinocitima.

Endotelin-1 (Edn-1), vazokonstriktor izveden iz endotela, vrši migraciju ćelija glatkih mišića i djeluje kao antiapoptotički faktor u ćelijama sa stresom izazvanim dušičnim oksidom[52,53]. Procesi vaskularnog remodeliranja, migracije, proliferacije i akumulacije ekstracelularnog matriksa stimulisani su i Edn-1 i NO [54,5]. Uočili smo povećanu ekspresiju Edn-1 nakon tretmana BPME u HUVEC-ima sa oksidativnim stresom. Nakon oksidativnog stresa ili akumulacije LPO, rana faza vaskularne upale je adhezija leukocita na endotelne glatke mišićne ćelije, što je istaknuto za kritične događaje ishemije i ateroskleroze [56]. Posreduju ga VCAM i ICAM izrazi; stimulisana je od strane mnogih hemokina i agenasa hemotakse, kao što su ekspresije NF-kB, IL-1 i TNF-a[57]. Inhibicija aktivacije IL-1 praćena ekspresijom adhezionih molekula postignuta je dijetalnim fenolnim jedinjenjem elaginske kiseline [58]. Tretman BPME na eksterno stimulisane HUVEC sa oksidativnim stresom značajno je smanjio proinflamatorne faktore specifične za vaskularne ćelije, kao što su VCAM, ICAM, NF-KB, IL-1 i nivoi ekspresije TNF-x. U tom kontekstu, Crespo et al. [59] su izvijestili da kempferol i kvercetin inhibiraju proinflamatorne gene, kao što su VCAM, ICAM, NF-kB i IL{24}} ekspresije, respektivno. Sve u svemu, inhibicija oksidativnog stresa i potencijal ekspresije gena BPME povezan sa vaskularnom inflamacijom favorizuje ekspresiju faktora rasta vaskularnih ćelija i potencijalno potpomaže proliferaciju i rast vaskularnih ćelija.

5. Zaključci

Sadašnji nalazi potvrđuju da je povećana ekspresija antioksidativnih gena bila povezana sa gašenjem oksidativnog stresa, pomažući da se prevlada oštećenje HUVEC proliferacije i angiogeneze. Crni beli luk koji sadrži hidroksimetilfurfural suzbija upalni efekat TNF-indukovane adhezije ćelija monocita na HUVEC i dalje potiskuje stvaranje ROS, ekspresiju VCAM-1 i aktivaciju NF-kB [60]. Osim toga, He et al. [61] je potvrdio da hidroksimetilfurfural ima potencijal da zaštiti od hipoksije. Utvrđeno je da kora cvekle sadrži flavonoide, furan i antioksidativne komponente, kao što su 5-hidroksimetilfurfural, metil piruvat, furfural i 2,3-dihidro-3,5- dihidroksi-6-metil-4H-piran-4-on; ove komponente su odgovorne za povećani antioksidativni kapacitet i supresiju adhezionih molekula proinflamatornih vaskularnih glatkih mišićnih ćelija. Kora cvekle se koristila kao stimulans za antioksidativne bazene za gašenje spoljašnjeg ili unutrašnjeg patološkog stimulusa peroksidativnog ćelijskog stresa. Naši nalazi su pokazali da komponente cikle pomažu u smanjenju metaboličkog stresa i upale u HUVEC-ima, što može biti korisno za proliferaciju vaskularnih stanica i angiogenezu.

Ovaj članak je preuzet iz Genes 2021, 12, 1380. https://doi.org/10.3390/genes12091380 https://www.mdpi.com/journal/genes