Aptamer aplikacije u neuronauci, 2. dio

Drugi neurotransmiter, serotonin, igra ulogu u neuromodulacijskim aktivnostima koje utiču na san, agresiju, apetit i seksualnu aktivnost. Proizvodi se u različitim dijelovima tijela, kao što su mozak, kičmena moždina, trombociti i crijeva [81-84].

Serotonin je neurotransmiter koji igra važnu ulogu u ljudskom fizičkom i mentalnom zdravlju. U ljudskom tijelu, serotonin reguliše raspoloženje, kontrolira apetit i san, te potiče osjećaj fizičkog zadovoljstva i blagostanja. Međutim, serotonin također igra važnu ulogu u utjecaju na pamćenje.

Istraživanja su pokazala da serotonin može promovirati poboljšanje pamćenja regulacijom signalizacije između neurona. Kada su ljudi pozitivno stimulirani, tijelo oslobađa serotonin, koji pomaže u jačanju veza između neurona i poboljšava efikasnost pamćenja. Serotonin također može učiniti ljude kreativnijima, poboljšati mentalnu agilnost i pomoći ljudima da brže uče i razmišljaju.

Osim toga, serotonin može pomoći u smanjenju simptoma anksioznosti i depresije, problema s raspoloženjem koji mogu negativno utjecati na koncentraciju i pamćenje ljudi. Sretno raspoloženje i mentalno stanje često mogu promovirati prepoznavanje i sposobnost ljudi za učenje novih stvari.

Ukratko, serotonin igra nezamjenjivu ulogu u našem fizičkom i mentalnom zdravlju, učenju i pamćenju. Možemo povećati oslobađanje serotonina i [poboljšati pamćenje] mijenjajući naše navike u ishrani, količinu vježbanja, metode učenja itd., njegujući pozitivan i zdrav mentalitet i konstantno izazivajući sebe da kontinuirano promoviramo poboljšanje pamćenja. Vidi se da moramo poboljšati pamćenje, a Cistanche deserticola može značajno poboljšati pamćenje, jer Cistanche deserticola djeluje antioksidativno, protuupalno i protiv starenja, što može pomoći u smanjenju oksidacije i upalnih reakcija u mozgu, čime se štiti zdravlje nervnog sistema. Osim toga, Cistanche deserticola također može promovirati rast i popravak nervnih ćelija, čime se poboljšava povezanost i funkcija neuronskih mreža. Ovi efekti mogu pomoći u poboljšanju pamćenja, učenja i brzine razmišljanja, a također mogu spriječiti razvoj kognitivne disfunkcije i neurodegenerativnih bolesti.

Kliknite znati suplemente za jačanje pamćenja

Neravnoteža nivoa perifernog serotonina povezana je sa nekoliko bolesti, uključujući hipertenziju, bolest bubrega i depresiju. Stoga korištenje serotonina za predviđanje stanja bolesti i započinjanje pravilnog liječenja ima klinički značaj.

Razvijen je plazmonski test za serotonin sa konjugatom aptamer-AuNP za koji se agregacija mijenja u prisustvu serotonina. Promjena u agregaciji čestica može se izmjeriti kao pomak vršne talasne dužine apsorpcije.

Test je pokazao specifičan odgovor na serotonin i nije dao statistički značajan signal sa njegovim metabolitima, 5-hidroksiindoloctenom kiselinom (5-HIAA), epinefrinom ili norepinefrinom kada je svaki testiran na 1 µM.

Fetalni bovineserum, kao imitacija ljudskog seruma, također nije inicirao nikakav signal [85]. Nedavno su razvijene neurosonde implantabilne aptamer-tranzistor sa efektom polja (FET) za praćenje nivoa serotonina u moždanom tkivu. Ultratanke In2O3 površine nanorazmjernih FET-ova modificirane su aptamerima i ove neurosonde su omogućile fM granice detekcije serotonina in vivo uz minimalno bioobraštanje [86].

Uz dodatne neuro sonde, prostorno-vremenska snimanja neuroaktivnosti će biti moguća tako da se moždane funkcije mogu razumjeti na mnogo dubljem nivou. Epinefrin je kateholaminski neurotransmiter sa širokim spektrom fizioloških funkcija za koje abnormalni nivoi mogu uzrokovati zdravstvene probleme poput aritmije, infarkta miokarda, krvi povećanje pritiska i plućni edem.

Važno je kvantificirati cirkulirajući epinefrin za promatranje ovih povezanih bolesnih stanja. S tim ciljem razvijena je kolorimetrijska metoda detekcije, zasnovana na interakciji epinefrina sa aptamerom funkcionaliziranim Au-NP. Sistem je jeftiniji i specifičniji od drugih tehnika za kvantifikaciju epinefrina, kao što je tečna hromatografija i spektrofotometrija.

Također, UV-vidljivom spektroskopijom je određena granica detekcije od 0.9 nM, što je najniža granica detekcije zabilježena za epinefrin korištenjem bilo koje kolorimetrijske metode. Analozi epinefrina, 3,4-dihidroksifeniloctene kiseline (DOPAC), triptofana, askorbinske kiseline, dopamina, tirozina i homovanilne kiseline, pokazali su vrlo mali ili nikakav odgovor, što ukazuje na visoku specifičnost aptasenzora [87].

Promjena nivoa jednog neurotransmitera može ukazivati ​​na bilo koju od nekoliko bolesti, što čini vrlo malo vjerojatnim da se dijagnoza bolesti može postići na osnovu mjerenja jednog neurotransmitera. Stoga će sposobnost većine aptasenzora da se integrišu u multipleks platformu rezultirati dijagnostičkim alatima koji su bolje prilagođeni klinikama i sa potencijalom da podrže preciznije identifikacije bolesti.

2.3. Biomarker Detection
Biomarker je svaka tvar, struktura ili proces u tijelu koji ili rezultira ishodom ili ukazuje na prisutnost određene bolesti. Mnogi biomarkeri su tvari koje se mogu mjeriti u biofluidima kao što su krv, pljuvačka i urin.

Glavni problem karakterizacije biomarkera za neurološke bolesti je krvno-moždana barijera (BBB) ​​kroz koju mnogi molekuli, uključujući mnoge proteine, ne mogu proći. Iako su proteini dominantni biomarkeri za određene bolesti, verovatnije je da će mali peptidi, kao što je neuropeptid Y ili fragmenti proteina, proći kroz BBB i biti otkriveni u cirkulaciji.

Metaboliti su još jedna važna grupa biomarkera za neurološke poremećaje. NeoVentures Biotechnology Inc. je razvio pristup selekcije aptamera pod nazivom FRELEX, koji omogućava odabir aptamera na osnovu konkurencije između kratkooligonukleotida vezanog za površinu i mete. Kao i za cell-SELEX i druge oblike SELEX-a sa promjenom strukture, ovaj protokol se može izvesti sa uzorkom koji sadrži mješavinu komponenti bez prethodnog znanja o cilju(ima) za koje će biti odabrani aptameri.

Sa ovim oblicima SELEX-a, kontra selekcije se izvode sa određenim podskupovima komponenti kako bi se pokrenula selekcija aptamera koji ispunjavaju željene specifičnosti. Koristeći FRELEX, aptameri su odabrani protiv seruma transgenih miševa koji su prekomjerno eksprimirali humani tau protein.

Kako bi se selekcija aptamera potaknula prema ljudskom tau i posljedicama prekomjerne ekspresije taua, u kontraselekciju je korišten serum miševa divljeg tipa. Grupa je identifikovala obogaćene sekvence aptamera koristeći NGS i karakterisala određene aptamere za transgene miševe u kasnoj fazi i miševe divljeg tipa upoređujući njihovu relativnu zastupljenost.

Oni su pretpostavili da razlika u obilju odražava odgovarajuću koncentraciju epitopa (povećanu kao odgovor na prekomjernu ekspresiju tau) s kojima aptameri mogu komunicirati [29].

3. Dijagnostičke i terapeutske primjene

Neurodegenerativne bolesti (ND) uključuju degeneraciju neurona u mozgu što dovodi do gubitka struktura i funkcija centralnog nervnog sistema. ND može biti uzrokovan starenjem, genetskim i okolišnim faktorima.

Demencija je jedan od najčešćih ND-a povezanih sa starenjem, kao i Alchajmerova bolest (AD). Parkinsonova bolest (PD) može biti posljedica genetskih mutacija i/ili toksina iz okoliša. Amiotrofična lateralna skleroza (ALS), multipla skleroza (MS), Huntingtonova bolest (HD) i prionske bolesti su druge česte ND s genetskim vezama.

Nažalost, za ove bolesti nisu dostupni ni učinkoviti lijekovi niti strategije za rano otkrivanje. Poput široko korištenih antitijela, aptameri su postali privlačni agensi za primjenu u razvoju novih biosenzora za ranu dijagnozu ND i liječenje ovih bolesti [88].

3.1. Alchajmerova bolest

Kao progresivni poremećaj mozga povezan sa starenjem koji rezultira mentalnim nedostacima, AD je najčešći oblik demencije. Njegovu patologiju karakterizira agregacija amiloida- (A ) izvedenog iz amiloidnog prekursorskog proteina (APP) i pokrenuta u području mozga hipokampusa.

Iako su naučnici pretpostavili da je neurotoksičnost izazvana A u korelaciji sa nerastvorljivim A plakovima (AP) i fibrilima (AF), nedavni dokazi ukazuju da su rastvorljivi A oligomeri (AO) takođe povezani sa početkom AD.
Stoga je AO identificiran kao atraktivan biomarker za ranu dijagnozu AD, a A i tau se smatraju značajnim terapijskim ciljevima za liječenje AD [89].

3.1.1. AD Diagnostics

Rano opisani aptameri protiv AO imali su niske afinitete i specifičnosti, ali kasnije studije su bile uspješnije u identifikaciji aptamera koji su selektivno prepoznavali fibrile 40-ostatnog oblika A (A 40), ali ne i A 40 polimera [90].

Međutim, aptamer je izgubio visoku specifičnost za A 40 fibrile u odnosu na fibrile nekoliko drugih amiloidogenih proteina koji su testirani. DNK aptamer odabran za interakciju sa -sinuklein (-syn) oligomerom sa 68-nM afinitetom također je pokazano da veže AO sa 25-nM afinitetom [91]. Godine 2019., koristeći iste aptamere koje su dobili Tsukakoshi et al., razvijen je elektrokemijski aptasenzor bez oznaka za specifičnije prepoznavanje AO [92].

Aptamer samo-sastavlja elektrode od zlatne šipke putem tiol (-S) interakcije i sistem ima granicu detekcije od 30 ppm, koju određuje EIS. Ovo je bio prvi aptasenzor koji je uspješno korišten za praćenje agregacije proteina A na osnovu EIS-a, što je bilo moguće zbog visoke selektivnosti aptamera među A vrstama. Uz laku proizvodnju i efikasnu regeneraciju, ovaj aptasenzor bi mogao biti obećavajući dijagnostički alat za rano otkrivanje AD i za demonstriranje akumulacije proteina A [92].

Razvijen je aptasenzor za detekciju A oligomera korištenjem -syn DNK aptamera [91] u kompleksu s metilenskim plavim (MB) i vezan za nanoporozni anodikaluminij. Visok koeficijent apsorpcije MB za bijelu svjetlost rezultirao je niskim intenzitetom reflektirane bijele svjetlosti.

U prisustvu A oligomera, aptamer/MB kompleks je disociran i povećanje reflektovane svjetlosti je detektovano interferometrijskom refleksivnom spektroskopijom (IRS) [93]. Aptasenzor je imao granicu detekcije od 8 pM i dobar odgovor na A oligomere, u rasponu koncentracija od 0.5 do 50 nM. Neurofibrilarni čvorovi (NFT) su patološki znakovi AD.

Formiranje NFT-a počinje u hipokampusu, a opseg formiranja NFT-a je povezan sa težinom demencije u AD. Hiperfosforilacija proteina povezanog s mikrotubulama, tau promovira njegovu sposobnost da regrutuje i organizira normalni tau u filamente, koji postaju NFT. Stoga se hiperfosforilacija taua predlaže kao jedan od glavnih uzroka AD.

Pored svoje normalne uloge u promicanju sklapanja mikrotubula i stabilizaciji sklopljenih mikrotubula, tau je opažen neravnotežnom kapilarnom elektroforezom (CE) da veže tri nasumično odabrana ssDNA oligonukleotida, od kojih je jedan, ssDNA1, vezan za tau381 (sa visokim {{K) afinitetom 3}} nM) [94].

Analiza aptamera/antitijela u sendviču razvijena je korištenjem ssDNA1 za detekciju femtomolarnih koncentracija tau proteina u ljudskoj plazmi površinskom plazmonskom rezonancom (SPR) [95].

U drugoj studiji, DNK aptameri su odabrani protiv cijelog tau proteina od 441 aminokiseline (tau441) tehnikom brze selekcije zasnovanom na podjelu kapilarne elektroforeze s tri kruga selekcije završenih u jednom danu. SPR je procijenio pet aptamera odabranih iz rezultata sekvenciranja visoke propusnosti zbog njihove sposobnosti prepoznavanja taua.

Analitički potencijal aptamera sa većim afinitetom demonstriran je testom anizotropije homogene faze fluorescencije. Ovaj aptamer visokog afiniteta vezan je za tau441 protein i kraće izoforme, tau352, tau381 i tau383 sa granicama detekcije od 28 nM, 6,3 nM, 3,2 nM i 22 nM, respektivno, u ovom testu [96].

3.1.2. AD Therapeutics

Kao jedna od potencijalnih terapija, RNA aptameri su odabrani da inhibiraju A 40 agregaciju. Tokom selekcije, A oligomer je konjugovan sa nanočesticama zlata (A-AuNPs), a dva aptamera su identifikovana kao kandidati za aptamer nakon SELEX-a.

Djeca 10-20 nM. Ovi aptameri su inhibirali formiranje plaka i fibrila, što je otkriveno transmisijskom elektronskom mikroskopom i A 40 enzimskim imunosorbentnim testom (ELISA) [97].

Alkohol dehidrogenaza (ABAD) peptid-mamca (DP), koji stupa u interakciju s A , antagonizira citotoksičnost A peptida. ABAD-DP sekvenca je umetnuta između dva tiola koji formiraju disulfidnu vezu u tioredoksinu (TRX) kako bi se stvorio TRX1-ABAD-DP-TRX2peptidni aptamer. Njegova stabilna ekspresija u NIH 3T3 ćelijama pomoću adeno-asociranih virusa je potvrđena imunofluorescentnim bojenjem.

Izraženi aptamer mogao bi vezati A peptid i poboljšati vitalnost stanica. Ovo istraživanje je potvrdilo efikasnu inhibiciju citotoksičnog efekta A peptida pomoću peptidnih aptamera [98]. Tau proteini se normalno povezuju i stabilizuju mikrotubule, ali njihova hiperfosforilacija može dovesti do proteinskih agregata nazvanih "tauopatija", što je toksično.

DNK aptamer Tau-1, koji je odabran protiv humanog tau441, inhibira oligomerizaciju Tau1 in vitro [99]. Ova inhibicija je takođe potvrđena u studijama ćelijske kulture korišćenjem ćelija HEK293 [100]. Beta-sekretaza (BACE1) ima ulogu u proizvodnji A, a inhibicija ekspresije BACE1 je smrtonosna kod miševa. Liječenje AD može uključivati ​​modulaciju BACE1.

Međutim, njegovo veliko aktivno mjesto čini BACE1 izazovnom metom za inhibitore malih molekula. Da bi se ovo zaobišlo, aptameri nukleinske kiseline mogu biti novi alati za inhibiciju BACE1 aktivnosti. Ovaj enzim ima citoplazmatski rep, B1-CT, koji služi kao mjesto za spajanje proteina kao što je bakarni šaperon za superoksid dismutazu-1 (CCS) i protein koji vezuje faktor ribozilacije (GGA1) ADP.

Fiziološka uloga B1-CT-a je uglavnom nepoznata. RNA aptamer koji pokreće B1-CT vezuje proksimalnu polovinu C kraja BACE1 na membrani spriječio je regrutaciju CCS-a dok je omogućio vezivanje GGA1 za BACE1 i regulirao transport BACE1 do endozoma za reciklažu [101].

Za specifično ciljanje BACE1, DNK aptameri, BI1 i BI2, generirani su protiv BACE1, koji inhibira BACE1, ali ni alfa- ni gama-sekretazu. Koristeći stabilno transfektiranu ćelijsku liniju HEK293, eksprimirali su prekursor amiloidnog proteina (APP) i, koristeći in-vitro test fluorescentnog rezonantnog prijenosa energije (FRET), pokazali su da je nivo A smanjen, a ćelijski nedostatak je spašen u primarno kultiviranoj liniji neurona. [102]. Efikasnost aptamera je dodatno poboljšana dodatkom holesteriltetra etilen glikola (TEG).

3.2. Parkinsonova bolest

Parkinsonova bolest (PD) je druga najčešća neurodegenerativna bolest od koje pogađa oko sedam miliona ljudi širom svijeta. Iako je progresivna bolest koju karakteriziraju motoričke i nemotoričke karakteristike, ona ima značajan klinički utjecaj na pacijente zbog njihovog gubitka pokretljivosti i kontrole mišića.

Gubitak strijatalnih dopaminergičkih neurona i gubitak neurona u nedopaminergičkim područjima karakterizira PD. Gubitak neurona općenito je povezan s karakterističnim formiranjem Lewyjevog tijela. Stoga se prisustvo Lewyjevih tijela koja sadrže -syn oligomere u mozgu smatra mogućim terapijskim i dijagnostičkim ciljem za PD.

3.2.1. PD Diagnostics

Prvi aptamer, "M5-15", odabran protiv -syn nije imao specifičnost za oligomere i mogao se također vezati za -syn monomere [103]. DNK aptameri, koji su potom odabrani, pokazali su interakciju sa -syn oligomerima, a ne sa -syn monomerima, ali su vezali A 1–40 oligomere.

Istraživači su također istražili specifičnost aptamera za -syn oligomere u odnosu na druge proteine ​​sa strukturama koje su pretežno -pločaste, kao što je struktura propelera pirolohinolin kinin glukoza dehidrogenaze (PQQH) i pokazali da aptamer nije vezao PQAQH [99]. Prijavljeno je da su aptasenzori sposobni za kvantificiranje -sinoligomera.

Kolorimetrijski aptasenzor, koji koristi DNK aptamer protiv -sinoligomera, adsorbiran je na nanočestice zlata (AuNP), što je spriječilo agregaciju nanočestica izazvanu solima. Njegovo vezivanje za -syn oligomer sprječava apsorpciju aptamera na površinu AuNP-a, što omogućava da se agregacija AuNP-a pokrene u visokim koncentracijama soli i rezultira promjenom boje.

Ovaj sistem je prikazan sa LoD od 10 nM. Međutim, serum (čak i sa 2%) je doprineo apsorpciji jedinjenja u opsegu promene boje u testu i ometao agregaciju aptamer-Au-NP-ova zavisno od soli.

Aptasenzori koji koriste EIS i SPR bili su osjetljiviji, sa LoDs od 1 pM i 8 pM, respektivno [104]. Utvrđeno je da je EIS aptasenzor vrlo specifičan za oligomere u odnosu na monomere i na njega ne utiče prisustvo seruma [104]. Razrađeni dizajn elektrohemijskog aptasenzora za detekciju -syn oligomera uključivao je hibrid formiran komplementarnom sekvencom -syn oligomernog aptamera povezanog sa zlatnom površinom preko tiolne veze i uključivao terminalnu deoksinukleotidil transferazu (TdT) i dTTP za proširenje 30-aktamera i njegovih krajeva. dopuniti dodatnim polipom.

Proširena ssDNK vezala je metilensko plavo i promovirala njegovu povezanost sa površinom zlata, stvarajući tako anelektrohemijski signal. Osim toga, sistem je sadržavao egzonukleazu I (Exo I), koja je specifična za ssDNK. Kada je aptamer uklonjen iz binarnog kompleksa sa svojim komplementom vezivanjem za -syn oligomer, komplementarni lanci su digestirani od strane Exo I, sprečavajući akumulaciju metilenskog plavog na površini zlata i na taj način smanjujući elektrohemijski signal.

Granica detekcije je bila 22 sata (S/N=3) i oporavak signala u prisustvu 10% i nižih koncentracija seruma bio je vrlo prihvatljivih 95,3–107% [105]. Međutim, njegova složenost i inkorporacija enzima čine ovaj sistem manje stabilnim za skladištenje i reproducibilnim na terenu. Kombinacija kapilarne elektroforeze-masene spektrometrije (CE-MS) sa ekstrakcijom čvrste faze (SPE) za pre-koncentraciju cilja sa aptamer-modificiranim mikro kartridžom u velikoj količini ubrizganih uzoraka smanjio je granicu detekcije 100-putu u poređenju sa CE-MS sistemima.

U ovom novom sistemu, uzorak se čisti, a volumen je minimiziran za poboljšanu analizu upotrebom mikro uloška koji selektivno zadržava metu. Utvrđeno je da je aptamer afinitetni (AA) sorbent u kertridžu superiorna alternativa antitelu - sorbent na bazi imunoafiniteta (IA) kao pozadinski elektroliti potrebni za ispiranje sistema takođe denaturiraju antitela.

Razvoj AA-SPE-CE-MS postignut je modifikacijom mikro kertridža sa M5-15 DNK aptamerom. Sistem je pokazao LoD od 2,8 nM i imao je linearni raspon detekcije između 7 i 140 nM -syn u uzorku krvi.

Također, identifikacija slobodnih i N-acetiliranih -syn proteoforma bila je moguća kao rezultat visoko precizne detekcije mase i moći razlučivanja MS-a. Konačno, utvrđeno je da je mikro uložak stabilan čak i sa kiselim BGE i mogao se koristiti za oko 20 analiza sa malom šansom za pogrešnu kvantifikaciju mete [106].

For more information:1950477648nn@gmail.com