Antivirusne nanočestice cinkovog oksida posredovane hesperidinom i u silikonu Uporedna studija između antivirusnih fenola kao anti-SARS-CoV-2

Za više informacija e-mailtina.xiang@wecistanche.com

Od januara 2020. Elsevier je kreirao COVID-19 resursni centar sa besplatnim informacijama na engleskom i mandarinskom o novom koronavirusu COVID-19. Resursni centar COVID-19 nalazi se na Elsevier Connect, javnoj web stranici za vijesti i informacije kompanije. Elsevier ovim daje dozvolu da sva svoja istraživanja vezana za COVID-19- koja su dostupna u resursnom centru COVID-19 - uključujući ovaj istraživački sadržaj - odmah stavi na raspolaganje u PubMed Centralu i drugim javno finansiranim repozitorijumima, kao što je SZO COVID baza podataka s pravima za neograničenu ponovnu upotrebu istraživanja i analize u bilo kojem obliku ili na bilo koji način uz navođenje originalnog izvora. Elsevier daje ova odobrenja besplatno sve dok je resursni centar COVID-19 aktivan.

SAŽETAKTeški akutni respiratorni sindrom korona virus 2 (SARS-CoV-2), koji je izazvao korona virus (COVID-19), je virus odgovoran za više od 69,613,607 miliona infekcija i preko 1,582,966 smrtnih slučajeva širom svijeta. Smatralo se da su sve mjere i protokoli liječenja samo potporni, a ne kurativni. Tokom ove trenutne pandemije koronavirusa, potraga za farmaceutskom ili tradicionalnom komplementarnom i integrativnom medicinom koja bi pomogla u prevenciji, liječenju i oporavku je bila korisna. Ovi fitofarmaceutici i nutraceutici mogu biti ekonomičniji, dostupniji, sigurniji i imaju manje nuspojave. Ovo je in silico uporedna studija deset fenolaantivirusnosredstva protiv SARS-CoV-2, kao i izolaciju najaktivnijeg metabolita iz prirodnih izvora. Nanočestice cinkovog oksida (ZnO NP) su takođe pripremljene koristeći ove metabolite kao redukciono sredstvo. Sva testirana jedinjenja pokazala su predviđenu anti-SARS-CoV-2 aktivnost.Hesperidinpokazao najvišu ocjenu pristajanja, to nas navodi da ga izolujemo od kore pomorandže, a njegovu strukturu smo potvrdili konvencionalnom spektroskopskom analizom. Osim toga, sintezu nanočestica hesperidin cink oksida karakteriziraju UV, IR, XRD i TEM. In vitro antivirusna aktivnost hesperidina i ZnO NP procijenjena je protiv virusa hepatitisa A kao primjera RNA virusa. Međutim, ZnO NP i hesperidin pokazali su antivirusnu aktivnost protiv HAV, ali ZnO NP su pokazali veću aktivnost odhesperidin. Dakle, hesperidin i njegove posredovane nanočestice ZnO su voljni antivirusni agensi, a dalja istraživanja protiv SARS-CoV-2 moraju se koristiti kao potencijalni tretman.

Ključne riječi: SARS-CoV-2 Nutraceuticals Molekularno spajanje Nanočestice cinkovog oksida Hesperidin

1. Uvod

Trenutna pandemija COVID-19 odgovorna je za preko 69 miliona infekcija i preko 1,5 miliona smrtnih slučajeva širom svijeta do danas, 2,3 miliona infekcija i više od 55,000 smrtnih slučajeva u Africi i preko 119,{{9} } infekcija i više od 6000 smrtnih slučajeva u Egiptu [1]. Kod većine osoba zaraženih SARS-CoV-2 simptomi uključuju blagu do umjerenu respiratornu bolest koja se može oporaviti bez konsultacije s ljekarom. Međutim, osobe s kroničnim bolestima kao što su kardiovaskularne bolesti, dijabetes, kronične respiratorne bolesti ili rak imaju veći rizik od razvoja akutnih respiratornih simptoma. Prenošenje COVID{14}} sprečava se održavanjem društvene distance, pranjem ruku ili upotrebom alkoholne sterilizacije i ne dodirivanjem lica. Gdje se prenosi kapljicama pljuvačke iz nosa osobe kada zaražena osoba kašlje ili kiše [1]. Smatralo se da su sve mjere i protokoli samo potporni, ali ne i kurativni. Međutim, postoje mnoga trenutna klinička ispitivanja koja procjenjuju potencijalne lijekove [1]. Otkako se navodi da je COVID-19 globalna pandemija, postojala je potreba da se traži farmaceutska ili tradicionalna, komplementarna i integrativna medicina koja bi pomogla u prevenciji, liječenju i oporavku [2].

Prirodni proizvodi su neiskorišteni izvori spojeva koji se mogu koristiti u prevenciji i liječenju različitih bolesti. Osim toga, prirodna jedinjenja su često služila kao jeftiniji i sigurniji kandidati za lijekove protiv nekoliko bolesti, a prijavljeno je da mnoga nutriceutska jedinjenja imajuantivirusne aktivnosti[3]. U posljednjoj deceniji, broj novihantivirusni lijekoviekstrahovano iz prirodnih izvora značajno je poraslo. Prirodni proizvodi pomažu u otkrivanju antivirusnih lijekova, bilo direktno ili indirektno [4].

Stoga, skrining biblioteka prirodnih spojeva pomoću kompjuterskih metoda skrininga kao što je molekularno spajanje može uštedjeti i vrijeme i novac u razvoju lijekova [3]

S druge strane, pokazala su se jedinjenja koja sadrže cink (Zn).antivirusna svojstvaprema brojnim virusima prema takvim fizičkim procesima kao što su vezivanje virusa, infekcija virusom i uklanjanje omotača. Pored inhibicije virusne proteaze i polimeraze [5]. Općenito, Zn je esencijalni element koji se nalazi u tkivima našeg tijela kao što su mišići, mozak, koža, kosti. Takođe je esencijalna komponenta različitih enzimskih sistema uključenih u metabolizam i biosintezu nukleinskih kiselina i proteina [5].

Treba napomenuti da se ZnO NP lakše apsorbuju u tijelu nego sam cink. ZnO NP se trenutno koriste u prehrambenoj industriji kao aditivi i u ambalaži. Nadalje, ZnO je kategorizirana kao sigurna supstanca od strane američke Uprave za hranu i lijekove. Stoga su ZnO NP atraktivni za upotrebu u biomedicinskim aplikacijama. ZnO NP se odlikuju niskom ekonomskom cijenom i niskom toksičnošću, stoga se ZnO NP mogu široko koristiti za biomedicinske primjene kao antibakterijska, antikancerogena, antidijabetička, protuupalna, isporuka lijekova i zacjeljivanje rana [6].

Nedavno je prijavljeno da jedinjenja koja sadrže Zn pokazuju aktivnost protiv SARS-CoV-2 [7] Stoga se lijekovi koji sadrže Zn obično propisuju u protokolima zaštite od COVID-19. Shodno tome, zelena sinteza ZnO NP zaslužuje posebnu pažnju.

U ovom radu, određeni broj fitofarmaceutskih fenolnih jedinjenja iz najčešće korištenih ljekovitih biljaka i hrane (nutraceutika) podvrgnut je in silico molekularnom istraživanju kako bi se istražila antivirusna aktivnost protiv SARS CoV-2 glavne proteaze (Mpro), i eksperimentalno jedinjenja s najvišim rezultatom će biti testiran pored svojih posredovanih ZnO nanočestica protiv virusa hepatitisa A (HAV), RNA virusa sličnog SARS-COV- 2.

2. Materijali i metode

2.1. Molekularno spajanje

Glavna proteaza (Mpro) je važan enzim kodiran genomom koronavirusa, sa ključnom ulogom u replikaciji virusa i procesu transkripcije, što ga čini pogodnom metom lijeka za SARS-CoV-2. Otkriti mehanizam inhibicije odabranih polifenolnih jedinjenja kao što su rutin, korilagin, diosmin, miricetin-3-O-ksilozil-(1→2)-ramnozid, epigalokatehin-3-O-galat,hesperidin, lionirezinol, miricetin, naringenin i kvercetin 3-O-glukuronid u odnosu na kristalnu strukturu SARS-CoV-2 Mpro (6lu7) [8] koji su korišteni s rezolucijom od 2,1 Aᵒ. Korišćen je za in silico molekularno spajanje. Ovaj protein se sastoji od dva polipeptida poznata kao protomeri A i B. Ovaj dimer ima kristalografsku simetriju duž dvostruke ose. Sadrži tri domena; domen I (ostaci 8–101), domen II (ostaci 102–184) sa antiparalelnom strukturom listova i domen III (ostaci 201–303) ima pet -heliksa raspoređenih kao antiparalelne sferne klastere. Gde je domen III povezan sa domenom II preko regiona duge petlje (ostaci 185–200). SARS-CoV-2, Mpro, ima katalitičku aktivnost vezanu za Cys-His, gdje se mjesto vezivanja supstrata nalazi u rascjepu između domene I i domene II [8] kao na slici 1. U trenutnoj studiji. , procedure molekularnog pristajanja izvršene su od strane Swiss Dock službe [9]. Koristeći EADock DSS, koji izvodi slijepo pristajanje i njegove CHARMM energije su procijenjene na mreži gdje su najpovoljnije energije procijenjene sa FACTS i grupisane. Ovi klasteri se mogu vizualizirati i interpretirati pomoću Chimera kao što je objavljeno u literaturi [10].

2.2. Biljni materijali, ekstrakcija i izolacija

Kore narandže (500 g) kupljene su od lokalne fabrike sokova. Kore pomorandže (200 g) ekstrahovane su sa 2 L vruće destilovane vode do iscrpljivanja. Ekstrakt je filtriran i uparen da bi postao više koncentrisan pod vakuumom. Vodeni ekstrakt je podijeljen sa CH2Cl2, a zatim s butanolom. Subfrakcija butanola primijenjena je na Whatman filter papir od 3 MM koristeći BAW kao eluens [12,11] da bi se dobila glavna tamnoljubičasta traka pod ultraljubičastim (UV) svjetlom. Tamnoljubičasta traka je izolirana i macerirana u metanolu, zatim uparena pod vakuumom pomoću rotacionog isparivača. Osušeni materijal je nanesen na kolonu Sephadex LH -20 koristeći EtOH/H2O (1:1) kao eluent da bi se dobilo 120 mghesperidin.

2.3. Nuklearna magnetna rezonanca (NMR)

Spektri 1H-nuklearne magnetne rezonance (NMR) su snimljeni na Bruker Avance III, 400 MHz NMR spektrometru i 100 MHz za 13C NMR. 1H hemijski pomaci (δ) izmjereni su u ppm, u odnosu na TMS i 13C-NMR hemijski pomaci u dimetil sulfoksid-d6 i pretvoreni u TMS skalu dodavanjem 39,5.

2.4. Sinteza nanočestica cink oksida (ZnO NP)

sa 500 mg cink acetata rastvorenog u 50 mL bidestilovane vode i zagrejanog u ključaloj vodenoj kupelji 20 min. Zatim je u reakciju dodano pet kapi amonijum hidroksida da se pH podigne na 12, gde se formira talog ZnO NPs. Smjesa je ostavljena pola sata za potpunu redukciju cink acetata u ZnO NP. Formirani talog je centrifugiran na 8000 rpm, nakon čega je dva puta ispran bidestilovanom vodom i dva puta etanolom da bi se dobile bijele pelete ZnO NP nakon sušenja zamrzavanjem.

2.5. Karakterizacija metalnih nanočestica

2.5.1. UV-vis spektralna analiza

Preparati ZnO NP su ispitivani UV spektrofotometrom, Shimadzu, UV-1601 (Shimadzu Corporation, Japan). UV spektri su snimljeni između 200−400 nm.

2.5.2. FT-IR analiza

Funkcionalne grupe sintetizovanih nanočestica cink oksida i hesperidin jedinjenja karakterisane su pomoću FTIR 6100 spektrometra (Jasco, Japan) u opsegu od 4000 – 400 cm−1.

2.5.3. Transmisiona elektronska mikroskopija (TEM)

Morfologija i veličina čestica ZnO NP posredovanih hesperidinom određena je TEM (JEOL-JEM-1011, Japan). Kapi suspenzije nanočestica stavljene su na bakrenu rešetku obloženu ugljenikom, a rastvarač je uparen na sobnoj temperaturi pre snimanja TEM slike.

2.5.4. rendgenska difrakcija (XRD)

ZnO NPs rendgenski difrakcijski uzorak snimljen PANLYTICAL X-ray difraktometrom koristeći Cu K zračenje talasne dužine 1d706; =0.1541 nm u opsegu skeniranja 21d703;=20− 70∘.

2.6. Procjena antivirusne aktivnosti

Antivirusni skrining je obavljen pomoću testa inhibicije plaka u Regionalnom centru za mikologiju i biotehnologiju (RCMB, Univerzitet Al Azhar, Kairo, Egipat).

2.6.1. Ćelijska linija sisara

Vero ćelije izvedene iz bubrega afričkih zelenih majmuna dobijene su iz Američke kolekcije tipskih kultura (ATCC, Manassas, VA, SAD).

Vero ćelije su razmnožene u Dulbecco-ovom modificiranom Eagleovom mediju (DMEM) sa dodatkom 10 posto toplinom inaktiviranog fetalnog goveđeg seruma (FBS), HEPES pufera, 1 posto L-glutamina i 50 ug/mL gentamicina. Sve ćelije su kultivisane na 37 ◦C u vlažnoj atmosferi sa 5% CO2 i subkultivisane su dva puta po 7 dana [14].

2.6.2. Procjena citotoksičnosti

hesperidina i ZnO NP su dodani nakon 24 h implantacije. Serijska dvostruka razrjeđenja testiranih uzoraka (počevši od 3000 ug/mL do 2 ug/mL) dodana su u konfluentne monoslojeve ćelija raspoređene u 96-jažice, mikrotitarske ploče s ravnim dnom (Falcon, Jersey, NJ, SAD ) pomoću višekanalne pipete. Mikrotitarske ploče su inkubirane na 37 ◦C u vlažnom inkubatoru sa 5% CO2 tokom perioda od 2 dana. Za svaku koncentraciju ispitivanih uzoraka korištene su tri jažice. Kontrolne ćelije su inkubirane bez testnih uzoraka i sa ili bez DMSO.

Nakon perioda inkubacije, prinos živih ćelija određen je MTT kolorimetrijskim testom [15]. Odnos između preživjelih ćelija i koncentracije testiranih uzoraka je iscrtan kako bi se dobile krive preživljavanja Vero ćelijske linije nakon tretmana navedenim spojevima. 50 postotna citotoksična koncentracija (CC50), koncentracija potrebna da izazove toksične efekte u 50 posto intaktnih stanica, procijenjena je iz grafičkih grafikona krivulje doza-odgovor za svaku koncentraciju korištenjem softvera GraphPad Prism (San Diego, Kalifornija, SAD). Određena je maksimalna netoksična koncentracija [MNTC] svakog hesperidina i ZnO NP-a i korištena za daljnje biološke studije.

2.6.3. Propagacija virusa

Citopatogeni HAV HM175 soj (ATCC VR-1402) HAV je razmnožen i analiziran u konfluentnim Vero ćelijama [16]. Infektivni virusi su pobrojani određivanjem infektivne doze kulture tkiva od 50 posto sa osam jažica po razrjeđenju i 20 μL inokuluma po jažici korištenjem Spearman-Karber metode [17].

3. Rezultati i diskusija

Deset nutraceutskih fenolnih spojeva odabrano je prema njihovoj dostupnosti i rasprostranjenosti kao farmaceutski oblici doziranja dobiveni iz prirodnih nutritivnih izvora hrane.

Ovi nutraceutici su diosmin, rutin, naringenin, kvercetin 3-oglukuronid, miricetin 3-O-ksilozil-(1→2)-ramnozid, miricetin, epigalokatehin-3-O-galat, korilagin i lyoniresinol. Hesperidin, diosmin i rutin su široko dostupni u farmaceutskim prodavnicama pod različitim trgovačkim nazivima i mogu se dobiti od različitih prirodnih nutritivnih namirnica za koje se navodi da imaju antivirusna svojstva, na primjer, hesperidin iz kore citrusa imaantivirusna aktivnost[18]. Na osnovu in silico skrininga je također predviđeno da hesperidin cilja na mjesto interakcije između SARS-CoV-2 Spike i ACE2 receptora, čime blokira ulazak virusa u ćelije pluća čovjeka. Stoga bi hesperidin mogao biti obećavajući profilaktički lijek protiv COVID-19 [19].

Osim toga, naringenin iz kore citrusa je prijavljen kao antivirusni agens protiv Zika virusa [20], rutin [21] je pokazao značajne rezultate kao antivirusni [19]. Epigalokatehin-3-O-galat zelenog čaja imaantivirusni efektiprotiv niza DNK i RNK virusa [22]. Corilagin sprečava oštećenje jetre inhibiranjem replikacije HCV-a i modulacijom oksidativnog stresa [23]. Prijavljena je anti-HIV aktivnost za miricetin i njegove glikozilovane derivate [24]. Osim toga, prijavljeno je da ih ima nekoliko lignanaantivirusnosvojstva [25].

3.1. Molekularno spajanje

U trenutnom istraživanju pokušano je protumačiti i podržati eksperimentalne nalaze u vezi s mehanizmom inhibicije glavne proteaze COVID-19. Deset polifenolnih jedinjenja je usidreno pomoću Swiss Dock Servera, gdje su pristupi bazirani na receptorima primijenjeni na ove polifenole. Kristalna struktura Covid-19 proteaze 6lu7, koja poprima oblik srca, sa dva dimera identičnih podjedinica i dva aktivna mjesta. inhibitor širokog spektra bi trebao ciljati aktivno mjesto His 41 i Cys 148 progenitornog koronavirusa šišmiša, kao u PDB unosu 4yoi. Ova studija je razjasnila način vezivanja fenolnih jedinjenja za kristalnu strukturu 6lu7 pomoću molekularnog spajanja (slika 2). Docking studija je potvrdila da hesperidin može formirati elektrostatičke interakcije sa ostacima THR 25, LEU 27, His 41 i Gly143 dok formira pi-stacking interakciju sa TYR 118 kao što je navedeno u Tabeli 1.

Većina polifenolnih jedinjenja pokazala je aktivnost inhibicije u području rascjepa između domena II, III (ostaci 185-200) i In domena I kao što se vidi na slici 2, dok su u Tabeli 1. polifenolna jedinjenja navedena prema njihovim energijama vezivanja. Odnos RMSD prema izvornom načinu vezivanja (puna kondicija (plava, lijeva X-osa)) i energije (jednostavna kondicija (crvena, desna y-osa)) prikazan je na Slici A, (dobavni fajl) . Način spajanja za hesperidin je prikazan na (slike B za SARS-CoV-2 Mpro i slika C za HAV 3C proteinazu [26], 2HAL kristalna struktura), miricetin (sl. D,1,2), diosmin (Slika E 1,2), epigalokatehin-3-O-galat (slike F1,2), rutin (slike G1,2), kvercetin 3-O-glukuronid (slike H 1,2), korilagin (slike I1,2), miricetin (slike J1,2), naringenin (slike L1,2) i lionirezinol (slike M1,2), u dodatnom fajlu.

3.2. Izolacija i identifikacija hesperidina

Kako je hesperidin pokazao najveći docking rezultat, ovdje smo ga izolirali iz otpada od hrane (narandžine kore), te je procijenjena njegova antivirusna aktivnost protiv HAV (jedan od RNA virusa).

Frakcija butanola iz vodenog ekstrakta kore pomorandže nanesena je na listove filter papira Whatman koristeći BAW kao eluens, pri čemu je uočena velika tamnoljubičasta traka flavonoidne prirode na preparativnoj papirnoj hromatografiji. Eluiranje glavne tamnoljubičaste trake sa metanolom dovelo je do izolacije čistog jedinjenja za koji je 1H, 13C potvrdio da je hesperidin [27] kako slijedi: 1H NMR (400 MHz, DMSO-d6 δ 5,50 (dd, J=12.2, 3,4 Hz, 1H, H-2), 2,78 (dd, J =3,24 Hz i 17,16, 1H, H{{22} }ax), 3,26 (dd, J=17.16, 8,22 Hz, 1H, H-3eq), 6,14 (brs, 1H, H-6), 6,12 (brs, 1H , H-8), 4.97 (d, J =7.2 Hz, 1H, H-1′′), 4.53 (s, 1H, H-1′′' ), 1,09 (d, J=6.2, 3H, CH3 ramnoze).13C NMR (101 MHz, DMSO-d6) δ 78,89 (C-2), 42,74(C{{64} }),197.48 (C-4), 163.50 (C-5), 96.85 (C-6), 165.60 (C-7), 96.00 (C{{79} }), 162,96 (C-9), 103,79 (C-10), 131,35 (C-1′), 118,42 (C-2′), 146,92 (C{{ 94}}′ ), 148.43 (C-4′), 112.50 (C-5′), 114.60 (C-6′), 56.15 (O-Me), 99.91 (C{ {109}}′′), 73,45 (C-2′′), 76,73 (C-3′′), 70,06 (C-4′′), 75,98 (C{{121 }}′′), 66,50 (C-6′′), 101,06 (C-1′′'), 70,73 (C-2′′), 71,17 (C{{133 }}′′'), 72,53 (C-4′′'), 68,78 (C-5′′'), 18,29 (CH3 ramnoze; C-6′′').

3.3. Formiranje nanočestica ZnO

Dodavanje rastvora cink acetata rastvoru hesperidina u vodenom kupatilu zagrijanom do 80 ◦C, praćeno dodavanjem nekoliko kapi amonijaka, dovelo je do taloženja ZnO NP [13].

3.3.1. UV analiza

Maksimalni apsorpcijski pik za ZnO NP sintetizirane putem hesperidina pokazao je vrh na 335 nm (slika 3a) koji potvrđuje formiranje ZnO NP [28]. ZnO na nanoskali ima kraće talasne dužine u poređenju sa standardnim uzorkom apsorpcije ZnO, u skladu sa izveštajima da materijalni oksidi imaju tendenciju da imaju kraće talasne dužine i da materijali na nanorazmeri imaju tendenciju da imaju kraće talasne dužine [29].

3.3.2. FT-IR analiza ZnO NP i hesperidina

FT-IR spektri (slika 3b) pripremljenih ZnO NP i hesperidina su prikupljeni u rasponu širine spektra od 400 do 4000 cm−1. Gdje su prikazani pikovi za O–H grupe koje se protežu vode oko 3546,04, 3478,29 i 3421 cm. − 1 predstavlja O–H grupe hesperidina i oko 3382,99 cm− 1 za ZnO NP. Aromatični delovi su potvrđeni rastezanjem dvostruke veze ugljenika na 2918,50 cm−1. Vibracija savijanja alkoholnog –CO–H potvrđena prisustvom pika na 1096,12 cm− 1. Karakteristične vrpce modova istezanja ZnO NP su dodijeljene na 542,9 i 891,2 cm−1 [13,30].

3.3.3.TEM analiza

TEM analiza je obavljena na transmisionim elektronskim mikroskopima niske rezolucije i visoke rezolucije i pokazala je formiranje heksagonalnih ZnO NP sa veličinom čestica u rasponu od 20 do 30 nm, slika 4.

3.3.4. XRD analiza

Pojava ZnO NP i ispitivanje njihovih strukturnih karakteristika potvrđeni su difrakcijom rendgenskih zraka (XRD), slika 5. ZnO NP posredovani flavonoidnim hesperidinom pokazali su pikove sa vrijednostima 2θ identificirane na 31.618◦, 34.334◦, 34.334◦, 37.46. ◦, 56.440◦, 62.727◦, 66.245◦, 67.864◦ i 68.925◦ koji odgovaraju (100), (002), (101), (102), (110), (103), (200), (112) i (201). Ovi vrhovi su upareni sa onima na kartici podataka (00− 003-0888).

Veličina kristala ZnO NP je izračunata na 27,73 nm. Ovi podaci su vrlo slični TEM mjerenjima. Za izračunavanje veličine kristala primjenjujemo Scherrerovu jednačinu

Veličina kristala {{0}} (0,9 x λ)/ (dcosθ)

Θ=2θ/2, d=puna širina pri pola maksimalnog intenziteta vrha (u Rad), λ =0.154060 nm

3.4. Antivirusna aktivnost

3.4.1. Procjena citotoksičnosti na Vero ćelije

Dva uzorka hesperidina i ZnO NP-a su pokazala 50 posto ćelijske citotoksične koncentracije (CC50)=620.8 ± 34,6 i 243,7 ± 12,7 ug/mL, respektivno. Kao što je prikazano na sl. K. & L., suppl. datoteke i vrijednosti su navedene u tabelama C i D. respektivno. Zatim su ova jedinjenja testiranaantivirusni efektiprotiv HAV-a u maksimalnoj netoksičnoj koncentraciji (MNTC) koristeći metodu analize plaka ilustrovanu na slici M. (dodatni fajl).

3.4.2. Anti-HAV aktivnost

Prijavljeno je da flavonoidi imaju antivirusno djelovanje i in vivo i in vitro [31]. Prijavljeno je da je mehanizam djelovanja nekih flavonoida protiv HIV-a (također RNA virusa) posljedica inhibicije fosforilacije proteina posredovane citokinima. Također treba napomenuti da je signalizacija fosforilacije posredovana citokinima povećana u infekciji COVID-19, što dovodi do fosforilacije brojnih proteina citoskeleta. Stoga, flavonoidi, koji uključuju hesperidin, mogu inhibirati fosforilaciju proteina, što zauzvrat dovodi do snažnog antivirusnog djelovanja i prevencije infekcija drugih stanica [32]. Takođe je prijavljeno da ZnO NP imaju antivirusnu aktivnost [32,33].

Spojevi koji sadrže cink su prijavili da utiču na različite faze virusnih replikacionih ciklusa, kao što su inaktivacija virusa, inhibicija razotkrivanja virusnog omotača, transkripcija virusnog genoma, translacija virusnih proteina i obrada poliproteina. Također treba napomenuti da aktivnost ovisi o vrsti virusa i koncentraciji spojeva koji sadrže cink [34].

U našoj studiji, konfluentni monoslojevi Vero ćelija bili su inficirani fiksnim razblaženjima virusa HAV. Nakon inkubacije, inokulum je uklonjen i zamijenjen MEM-om bez seruma koji sadrži 1,5 posto karboksimetil celuloze. Ćelije su zatim inkubirane, omogućavajući virusu da formira plakove. Ćelije su fiksirane 2 h na 25 ◦C sa formaldehidom koji je dodat direktno u medijum do koncentracije od 5 procenata. Fiksirane ćelije su opsežno isprane vodom prije nego što su obojene otopinom koja sadrži 1 posto kristalno ljubičastog i 10 posto etanola tokom 30 minuta. Nakon ispiranja vodom izbrojan je broj plakova i izračunati titri virusa (broj). Antivirusni efekti dva testirana uzorka, hesperidina i ZnO NP protiv HAV pri maksimalnoj necitotoksičnoj koncentraciji (MNCC) prikazani su u Tabeli B (dodatni fajl). Nanočestice cink oksida pokazale su veću aktivnost od hesperidina pri relativno niskim koncentracijama zbog velike površine i male veličine čestica, što je povećalo aktivnost nanočestica cink oksida. Iz tabele B, sl. T, (dodatni fajl). I hesperidin i ZnO NP pokazali su antivirusnu aktivnost protiv virusa hepatitisa A (HAV) sa procentima od 44,75 i 58,83 posto pri maksimalnoj necitotoksičnoj koncentraciji i EC50 jednakim 72,4 odnosno 176,3 ug/mL, kao što je prikazano u tabelama A i B (dodatni fajl).

4. Zaključak

Trenutna pandemijska bolest COVID-19 je odgovorna za veliki broj morbiditeta i smrtnosti širom svijeta. Fenolna jedinjenja nutraceutika i fitofarmaceutika u našoj studiji pokazuju dobre rezultate pristajanja i mogu biti idealna meta za liječenje SARS-CoV-2. Hesperidin koji je izolovan iz kore pomorandže iz otpada od hrane pokazuje najveći rezultat (-8.84 Kcal/mol) protiv SARS-CoV-2 glavne proteaze među ostalim testiranim jedinjenjima. Hesperidin je sposoban da reducira jone cinka za pripremu ZnO NP sa heksagonalnim oblikom i veličinom čestica oko 25 nm. ZnO NP posredovani hesperidinom pokazuju više antivirusne aktivnosti od samog hesperidina sa procentima od 44,75 i 58,83 posto pri maksimalnoj necitotoksičnoj koncentraciji. Trebalo bi uraditi više studija za hesperidin, druge nutraceutike, fitofarmaceutska jedinjenja i njihove ZnO NP za pronalaženje sigurnih, jeftinih i potencijalnih tretmana za SARS-CoV-2 pandemijsku bolest.

Doprinos autora Gouda H. Attia, Yasmin S. Moemen, Mahmoud Youns, Ammar M. Ibrahim, Randa Abdou, Mohamed A. El Raey Gouda H. Attia i Mohamed A. El Raey dizajniraju rukopis. Gouda H. Attia, Ammar M. Ibrahim i Mohamed A. El Raey izvršili su hromatografsko razdvajanje i izvršili razjašnjavanje strukture čistog izolovanog Hesperidina Gouda H. Attia, Randa Abdou i Mohamed A. El Raey su izvršili zelenu sintezu ZnO NP i opisati njegove karakteristike. Yasmin S. Moemen je izvršila sve studije molekularnog spajanja, a Mohamed A. El-Raey predlaže protein.

Mahmoud Youns i Randa Abdou izveli su testove antivirusne i citotoksičnosti i njihovu analizu podataka. Svi autori su bili odgovorni za izradu i pisanje konačne verzije rukopisa i odobravanje konačnog rukopisa.

Finansiranje

Za ovaj posao nisu dobijena finansijska sredstva.

Etika istraživanja

Dalje potvrđujemo da je svaki aspekt rada obuhvaćenog ovim rukopisom koji je uključivao ljudske pacijente obavljen uz etičko odobrenje svih relevantnih tijela i da su takva odobrenja priznata u rukopisu.

Pribavljeno je odobrenje IRB-a (potrebno za studije i serije od 3 ili više slučajeva)

Pisani pristanak za objavljivanje potencijalno identifikujućih informacija, kao što su detalji slučaja i fotografije, dobijen je od pacijenta(a) ili njihovog zakonskog(ih) staratelja(a).

Izjava o konkurentskim interesima

Autori navode da nema izjava o interesu.

Priznanja

Zahvaljujemo se Dekanu za naučna istraživanja Univerziteta Najran, KSA, na obezbjeđenju sredstava za izvođenje ovog projekta (NU/MID/18/024).

Dodatak A. Dodatni podaci

Dodatni materijal koji se odnosi na ovaj članak može se naći, u online verziji, na DOI: https://doi.org/10.1016/j.colsurfb.2021.111724.

Gouda H. Attiaa,b , Yasmine S. Moemenc , Mahmoud Younsd , Ammar M. Ibrahime ,  Randa Abdouf,g , Mohamed A. El Raeyh, *  

a Odsjek za farmakognoziju, Farmaceutski fakultet, Univerzitet Najran, Najran, Saudijska Arabija
b Odsjek za farmakognoziju, Farmaceutski fakultet, Univerzitet Kafr El-Shiekh, Kafr El-Shiekh, Egipat
c Odjel za kliničku patologiju, Nacionalni institut za jetru, Univerzitet Menoufia, Menoufia, Egipat
d Odsjek za biohemiju i molekularnu biologiju, Farmaceutski fakultet Univerziteta Helwan, Kairo, Egipat
e Fakultet primijenjenih medicinskih nauka, Univerzitet Najran, Najran, Saudijska Arabija
f Odsjek za farmakognoziju, Farmaceutski fakultet Univerziteta Umm Al-Qura, Meka, Saudijska Arabija
g Odsjek za farmakognoziju, Farmaceutski fakultet Univerziteta Helwan, Kairo, Egipat
h Odjel za fitohemiju i biljnu sistematiku, Farmaceutski odjel, Nacionalni istraživački centar, Dokki, Kairo, Egipat

Reference

[1] Svjetska zdravstvena organizacija, WHO Coronavirus Disease (COVID-19), 2020. (pristupljeno 22. oktobra 2020.), https://www.worldometers. info/coronavirus/#countries.

[2] J. Hunter, S. Arentz, J. Goldenberg, G. Yang, J. Beardsley, D. Mertz, S. Leeder, Protokol brzog pregleda: cink za prevenciju ili liječenje COVID-19 i dr. infekcije respiratornog trakta povezane s koronavirusom, Integr. Med. Res. 9 (2020), 100457. [3] GJ Kotwal, Antivirusni nutraceutici iz soka nara (Punica granatum), u Handb. Nutraceuticals, Vol. I, CRC Press, 2009, str. 338–346.

[4] L.-T. Lin, W.-C. Hsu, C.-C. Lin, Antivirusni prirodni proizvodi i biljni lijekovi, J. Tradit. Dopuna. Med. 4 (2014) 24–35.

[5] A. Kumar, Y. Kubota, M. Chernov, H. Kasuya, Potencijalna uloga suplementacije cinka u profilaksi i liječenju COVID-19, Med. Hipoteze (2020), 109848.

[6] J. Jiang, J. Pi, J. Cai, Unapređenje nanočestica cink oksida za biomedicinske primjene, Bioinorg. Chem. Appl. (2018), https://doi.org/10.1155/2018/ 1062562.

[7] AJW Te Velthuis, SHE van den Worm, AC Sims, RS Baric, EJ Snijder, MJ van Hemert, Zn2 plus inhibira aktivnost RNA polimeraze koronavirusa i arterivirusa in vitro, a jonofori cinka blokiraju replikaciju ovih virusa u ćelijskoj kulturi, PLoS Patog. 6 (2010), e1001176.

[8] Z. Jin, X. Du, Y. Xu, Y. Deng, M. Liu, Y. Zhao, B. Zhang, X. Li, L. Zhang, C. Peng, Struktura M pro iz SARS-a CoV-2 i otkriće njegovih inhibitora, Nature (2020) 1–5.

[9] A. Grosdidier, V. Zoete, O. Michielin, SwissDock, web servis za spajanje malih molekula za proteine ​​zasnovan na EADock DSS, Nucleic Acids Res. (2011), https://doi.org/ 10.1093/nar/gkr366.

[10] A. Kucukelbir, FJ Sigworth, HD Tagare, Kvantifikacija lokalne rezolucije cryo-EM mapa gustoće, Nat. Metode 11 (2014) 63–65.

[11] HH Barakat, M. El-Raey, SA Nada, I. Zeid, M. Nawwar, Konstitutivni fenoli i hepatoprotektivna aktivnost listova Eugenia supra-axillaris, EJ Chem. 54 (2011) 313–323.

[12] SM Osman, WA El Kashak, M. Wink, MA El Raey, Novi derivati ​​izorhamnetina iz Salsola imbricata Forssk. Listovi s izraženim protuupalnim djelovanjem, Pharmacogn. Mag. 12 (2016) S47.

[13] GH Attia, HS Alyami, MAA Orabi, AH Gaara, MA El Raey, Antimikrobna aktivnost nanočestica srebra i cinka posredovana zelenim patlidžanom Calyx, Int. J. Pharmacol. 16 (2020) 236–243.

[14] P. Vijayan, C. Raghu, G. Ashok, SA Dhanaraj, B. Suresh, Antivirusno djelovanje ljekovitih biljaka Nilgirisa, Indijski J. Med. Res. 120 (2004) 24–29.

[15] T. Mosmann, Brzi kolorimetrijski test za ćelijski rast i preživljavanje: primjena na testove proliferacije i citotoksičnosti, J. Immunol. Metode 65 (1983) 55–63.

[16] W. Randazzo, J. Piqueras, J. Rodríguez-Díaz, R. Aznar, G. S´ anchez, Poboljšanje efikasnosti viabilnosti-qPCR za selektivno otkrivanje infektivnog HAV u uzorcima hrane i vode, J. Appl. Microbiol. 124 (2018) 958–964.

[17] RM Pinto, JM Diez, A. Bosch, Upotreba ćelijske linije karcinoma debelog crijeva CaCo{1}} za in vivo amplifikaciju i detekciju enteričkih virusa, J. Med. Virol. 44 (1994) 310–315.

[18] Z. Ding, G. Sun, Z. Zhu, Kratka komunikacija Hesperidin ublažava ozljedu pluća uzrokovanu virusom influence A (H1N1) kod pacova kroz svoj protuupalni učinak, Antivir. Ther. 23 (2018) 611–615.

[19] C. Wu, Y. Liu, Y. Yang, P. Zhang, W. Zhong, Y. Wang, Q. Wang, Y. Xu, M. Li, X. Li, Analiza terapijskih ciljeva za SARS- CoV-2 i otkrivanje potencijalnih lijekova kompjuterskim metodama, Acta Pharm. Sin. B (2020).

[20] AHD Cataneo, D. Kuczera, AC Koishi, C. Zanluca, GF Silveira, TB de Arruda, AA Suzukawa, LO Bortot, M. Dias-Baruffi, WA Verri, Citrusni flavonoid naringenin ometa in vitro infekciju ljudi ćelije virusom Zika, Sci. Rep. 9 (2019) 1–15.

[21] Y.-J. Lin, Y.-C. Chang, N.-W. Hsiao, J.-L. Hsieh, C.-Y. Wang, S.-H. Kung, F.-J. Tsai, Y.-C. Lan, C.-W. Lin, Fisetin i rutin kao inhibitori 3C proteaze enterovirusa A71, J. Virol. Metode 182 (2012) 93–98.

[22] K. Kaihatsu, M. Yamabe, Y. Ebara, Antivirusni mehanizam djelovanja epigalokatehin{1}}O-galata i njegovih estera masnih kiselina, Molecules 23 (2018) 2475.

[23] BU Reddy, R. Mullick, A. Kumar, G. Sharma, P. Bag, CL Roy, G. Sudha, H. Tandon, P. Dave, A. Shukla, Prirodni inhibitor malih molekula korilagin blokira replikaciju HCV-a i modulira oksidativni stres za smanjenje oštećenja jetre, Antivirusna Res. 150 (2018) 47–59.

[24] JT Ortega, AI Su´ arez, ML Serrano, J. Baptista, FH Pujol, HR Rangel, Uloga glikozilnog dijela derivata miricetina u anti-HIV-1 aktivnosti in vitro, AIDS Res. Ther. 14 (2017) 1–6.

[25] RB Teponno, S. Kusari, M. Spiteller, Nedavni napredak u istraživanju lignana i neolignana, Nat. Prod. Rep. 33 (2016) 1044–1092.

[26] J. Yin, MM Cherney, EM Bergmann, J. Zhang, C. Huitema, H. Pettersson, LD Eltis, JC Vederas, MNG James, Episulfidni kation (tiiranijev prsten) zarobljen u aktivnom mjestu HAV 3C proteinaze inaktiviran inhibitorima ketona na bazi peptida, J. Mol. Biol. 361 (2006) 673–686.

[27] VM Chari, M. Jordan, H. Wagner, PW Thies, 13C-NMR studija strukture acil-linarina iz Valeriana wallichii, Phytochemistry 16 (1977) 1110–1112.

[28] N. Srinivasan, C. Rangasami, JC Kannan, Struktura sinteze i optička svojstva nanočestica cink oksida, Int J Appl Eng Res. 10 (2015) 343–345.

[29] S. Fakhari, M. Jamzad, H. Kabiri Fard, Zelena sinteza nanočestica cink oksida: poređenje, Green Chem. Lett. Rev. 12 (2019) 19–24.

[30] N. Bala, S. Saha, M. Chakraborty, M. Maiti, S. Das, R. Basu, P. Nandy, Zelena sinteza nanočestica cink oksida upotrebom ekstrakta lista Hibiscus subdariffa: uticaj temperature na sintezu, anti -bakterijska aktivnost i antidijabetička aktivnost, RSC Adv. 5 (2015) 4993–5003.

[31] H. Zakaryan, E. Arabyan, A. Oo, K. Zandi, Flavonoidi: obećavajuća prirodna jedinjenja protiv virusnih infekcija, Arch. Virol. 162 (2017) 2539–2551.

[32] M. Bouhaddou, D. Memon, B. Meyer, KM White, VV Rezelj, MC Marrero, BJ Polacco, JE Melnyk, S. Ulferts, RM Kaake, Globalni pejzaž fosforilacije SARS-CoV-2 infekcija, Cell 182 (2020) 685–712.

[33] H. Ghaffari, A. Tavakoli, A. Moradi, A. Tabarraei, F. Bokharaei-Salim, M. Zahmatkeshan, M. Farahmand, D. Javanmard, SJ Kiani, M. Esghaei, Inhibicija infekcije virusom gripe H1N1 nanočesticama cink oksida: još jedna nova primena nanomedicine, J. Biomed. Sci. 26 (2019) 1–10.

[34] SA Read, S. Obeid, C. Ahlenstiel, G. Ahlenstiel, Uloga cinka u antivirusnom imunitetu, Adv. Nutr. 10 (2019) 696–710.