Antioksidativno i antimelanogeno djelovanje termički obrađenog ekstrakta sladića (Wongam, Glycyrrhiza Glabra × G. Uralensis)

Kontakt: Audrey Hu Whatsapp/hp: 0086 13880143964 Email:audrey.hu@wecistanche.com

Min Hye Kang 1,2, Gwi Yeong Jang 1, Yun-Jeong Ji 1, Jeong Hoon Lee 1, Su Ji Choi 1, Tae Kyung Hyun 2,* i Hyung Don Kim 1,*

sažetak:Melanin je smeđi ili crni pigment koji štiti kožu od ultraljubičastog zračenja i reaktivnih kisikovih vrsta (ROS). Međutim, prekomjerna proizvodnja melanina povezana je s lentiginima, melazmom, pjegama i rakom kože.Sladićje pokazaoantioksidans, antitumorsko, antitrombocitno, protuupalno i imunomodulatorno djelovanje i koristi se kao prirodni tretman za kožuizbjeljivanjeCilj nam je bio da potvrdimo potencijal Wongam, nove sorte sladića koju je razvila Uprava za ruralni razvoj (RDA), kaoizbjeljivanjeagent u kozmetici. Osim toga, poređenjem smo provjerili učinak toplinske obrade na bioaktivnost sladićaantioksidansiantimelanogenaktivnosti ekstrakta sladića prije i poslije zagrijavanja (130 ◦C). Termički obrađen ekstrakt sladića (WH-130) pokazao je veće aktivnosti uklanjanja radikala u ABTS plus (2,20-azino-bis-(3-etil benzotiazolin-6-sulfonska kiselina) kiselina) dijamonijum soli) i DPPH (2,2-difenil-1-pikrilhidrazil) testovi. Osim toga, WH-130 je djelotvornije inhibirao melanogenezu zbog smanjene regulacije tirozinaze u ćelijama melanoma B16F10 nego nezagrijanesladićekstrakt. Osim toga, toplinska obrada povećala je ukupni sadržaj fenola. Konkretno, isoliquiritigenin, anantioksidansiantimelanogenjedinjenje od sladića, proizvedeno termičkom obradom. Zaključno, WH-130, sa povećanim nivoima bioaktivnih fenola, kao što je izolikviritgenin, ima potencijal za razvoj u novu kožuizbjeljivanjematerijal sa primjenom u kozmetici.

Ključne riječi: antimelanogenaktivnost; termičku obradu;sladić; ćelije mišjeg melanoma (B16F10)

Cistanche je antioksidans

1. Uvod

Sladić(Glycyrrhiza vrsta), višegodišnja biljka sa lekovitom upotrebom u porodici Leguminosae, široko je rasprostranjena u Centralnoj Aziji, Kini, Rusiji, Mandžuriji, Mongoliji i Evropi [1]. Dugo se koristio kao aroma i zaslađivač. Suvi korijen i stolon od sladića korišteni su za liječenje prehlade, kašlja, astme, umora i infekcija respiratornog trakta zbog bioloških aktivnosti sladića, uključujućiantioksidans,antimikrobno, antitumorsko, antitrombocitno, protuupalno i imunomodulatorno djelovanje [2,3]. Rod Glycyrrhiza sastoji se od oko 22 vrste sladića, uključujući G. uralensisFisch, G. glabra L. i G. inflata Batal.

Wongam, novu interspecifičnu hibridnu sortu sladića, razvila je Uprava za ruralni razvoj kao hibrid Glycyrrhiza glabra x G. uralensis (G. korshinskiGrig). Wongam ima veće prinose i bolju otpornost na bolesti od G. uralensis. Provedene su brojne studije o biološkim aktivnostima G. uralensis, dok su postojeća istraživanja na novoj sorti Wongam ograničena na njeno antialergijsko, imunomodulatorno i antiulkusno djelovanje [1,2]. Stoga je neophodno istražiti široku bioaktivnost Wongama.

Glavne bioaktivne komponente usladićkorijen su flavonoidi i triterpenski saponini, uključujući liquiritin, liquiritigenin, izoliquiritigenin (ISL) i glicirizin (ili glicirizikasid) [4,5]. ISL je flavonoid koji se nalazi u sladićima koji je pokazao različite farmaceutske aktivnosti, uključujući antitrombocitne, antialergijske, antitumorske, protuupalne iantioksidansaktivnosti [6–8]. ISL je proizvod hidrolize izolikviritina u korijenu sladića. Može inhibirati melanogenezu kroz razgradnju faktora transkripcije povezanog s mikroftalmijom (MITF) aktivacijom signalnog puta protein kinaze regulirane ekstracelularnim signalom (ERK). Posljedično, MITF degradacija potisnula je ekspresiju tirozinaze (TYR) i proteina povezanih s tirozinazom (TRP-1 i TRP-2) gena u SK-MEL-2 ćelijama [9,10].ISL može inhibirati mono- i difenolaznu aktivnost TYR gljiva, kao i temelanogenezu u melanocitima [11].

Melanin, glavni pigment koji daje boju koži, sintetizira se u epidermalnim melanocitima i pohranjuje u intracelularnim organelama zvanim melanosomi [12]. Melaninski pigmenti se sastoje od dva tipa: smeđi ili crni eumelanin i crveni ili žuti feomelanin [12]. Melanogeneza se može inducirati vanjskim podražajima, uključujući ultraljubičasto (UV) zračenje, vrste reaktivnog kisika (ROS) i kemikalije kao što su hormon koji stimulira melanocite (-MSH) i izobutilmetilksantin (IBMX), koji podiže nivoe cikličkog adenozin monofosfata (cAMP). Melanin štiti kožu od ovih podražaja, dok njegova prekomjerna proizvodnja uzrokuje hiperpigmentaciju kože, što može dovesti do bolesti kao što je rak kože [13–17]. Skinizbjeljivanjeagensi kao što su kojična kiselina, hidrokinon, arbutin i askorbinska kiselina, koji su inhibitori TYR-a, korišteni su za liječenje hiperpigmentacije u nekoliko kozmetičkih proizvoda [13,18]. Melanogeneza se reguliše kroz različite signalne puteve, a ti signali su povezani sa povećanjem MITF-a. Aktivacija MITF-a promovira ekspresiju TYR-a i TRP-a (TRP-1, TRP-2). Zatim, TYR katalizira oksidaciju L-tirozina u3,4-dihidroksi-L-fenilalanin (L-DOPA), koji se zatim oksidira u DOPAhinon. TRP-2 pretvara dopahrom u 5,6-dihidroksiindol-2-karboksilnu kiselinu (DHICA) ili 5,6-dihidroksiindol (DHI). Konačno, DHICA i DHI se oksidiraju pomoću TRP-1, što rezultira melanogenezom [19].

Toplotni procesi utiču na fizičko-hemijska i biološka svojstva biljnih ekstrakata. Oni uništavaju ćelijske zidove i cijepaju kovalentne veze, što rezultira oslobađanjem bioaktivnih spojeva [20,21]. Termičkom obradom pivara istrošenih ekstrakata žitarica iznad 130 ◦Povećava nivo ukupnog sadržaja fenola (TPC) i ukupnog sadržaja flavonoida (TFC), sa odgovarajućim povećanjem antioksidativnih aktivnosti [16,20,21]. Zagrijavanje kore citrusa može dovesti do pojačanog oslobađanja fenolnih spojevaantioksidansaktivnost [17].

Naš glavni cilj je potvrditi potencijal Wongama kao prirodne kožeizbjeljivanjematerijal u kozmetici. Osim toga, ova studija također ima za cilj dokazati može li termička obrada poboljšati antioksidativno i antimelanogeno djelovanjesladić. Istražili smoantioksidansaktivnosti, zajedno sa TPC ekstrakta Wongam.Anti-melanogenEfekti ekstrakta Wongam potvrđeni su aktivnošću inhibicije TYR i sadržajem melanina u ćelijama melanoma.

Cistanche je prirodankožeizbjeljivanje biljka

2. Materijali i metode

2.1. Priprema uzorka

Uzorci su pripremljeni prema prethodno objavljenoj metodi [22].Sladić(Wongam, Glycyrrhiza glabra x G. uralensis, identifikovan od Yun Ji Lee iz NIHHS, RDA i registrovan u herbarijumu medicinskih resursa Koreje sa brojem vaučera MPS006326) uzgajan je i ubran u Odeljenju za istraživanje biljnih kultura (Eumsung, Chungche, Korea ) 2018. godine i sušeno na 60 ◦C 20 h. 10 kgsladićpožnjeven i 1 kg samljeven. Nakon njihovog miješanja, dobijena su 3 uzorka WC odnosno WH. Mleveni sladić (5 g) stavljen je u staklenu posudu sa 1 mL destilovane vode i tretiran u autoklavu (Jisico, Seul, Koreja) 1 h na 130 ◦C (WH-130). Netretirani kontrolni sladić (WC) , 5 g) i WH-130 su odvojeno ekstrahovani upotrebom 70 posto etanola (uzorak: rastvarač, 1:50, v:v) tokom 24 h na sobnoj temperaturi (RT). Nakon filtracije, ekstrakti su upareni pod vakuumom, osušeni zamrzavanjem i pohranjeni na -80 ◦C. Svi ekstrakti su rastvoreni u dimetil sulfoksidu (DMSO) (Sigma, St. Louis, MO, SAD) i metanolu (Sigma, St. Louis, MO, SAD).

2.2. Određivanje Browninga

Indeks smeđivanjasladićekstrakti (WC i WH-130) snimljeni su na osnovu njihove vrijednosti apsorpcije na 420 nm (A420) mjerene pomoću čitača mikroploča (BioTek,Winooski, VT, USA). Veće vrijednosti apsorpcije na 420 nm odgovaraju većem indeksu smeđivanja [23,24].

2.3. Ukupni sadržaj fenola (TPC)

Prema prethodno objavljenoj metodi [25], TPC je mjeren na osnovu principa da se Folin-Ciocalteuov reagens reducira u plavi kromofor koji se sastoji od kompleksa afosfovolfram-fosfomolibdena ovisno o alkalnim uvjetima i koncentraciji fenolnih spojeva. Svaki uzorak (10 µL) pomiješan je sa 2 posto natrijum karbonata (200 µL), a zatim Folin-Ciocalteuovim reagensom (10 µL). Smjesa je aktivirana 30 min na sobnoj temperaturi. Zatim je mjerena apsorpcija na 750 nm pomoću čitača mikroploča (BioTek, Winooski, VT, USA). TPC je izračunat iz standardne krive galne kiseline, a rezultati su izraženi kao vrijednosti ekvivalenta galne kiseline, mg GAE g-1 ekstrakta.

2.4. Određivanje antioksidativnog kapaciteta

Aktivnost uklanjanja radikala mjerena je korištenjem 2,20-azino-bis-(3-etilbenzotiazolin 6-sulfonske kiseline) diamonijum soli (ABTS) prema prethodno opisanoj metodi uz neznatne modifikacije [19, 26]. Rastvor kationa radikala ABTS je proizveden miješanjem 2,6 mM kalijum persulfata i 7,4 mM ABTS i ostavljenim da reaguju 24 h na sobnoj temperaturi. ABTS otopina je zatim razrijeđena destilovanom vodom kako bi se podesila apsorpcija na raspon od 1.000–1.500. Zatim je 20 µL uzorka reagovalo sa 180 µL rastvora ABTS plus, zaštićenog od svetlosti, i mešavina uzorka i rastvora je inkubirana 30 minuta na sobnoj temperaturi. Apsorpcija je mjerena pomoću čitača mikroploča (BioTek, Winooski, VT, USA) na 735 nm. Iz Trolox standardne krive, Trolox ekvivalentantioksidanskapacitet (TEAC) je izračunat i izražen u mg trolox ekvivalenta (TE) po g suhog uzorka.

2,2-difenil-1-pikrilhidrazil (DPPH) rastvor je pripremljen otapanjem 0.2 mM DPPH u 99 posto etanola. DPPH rastvor je razrijeđen destilovanom vodom do anabsorbancije na 520 nm od 1000–1500. Zatim je 50 µL uzorka pomešano sa 200 µL rastvora DPPH i reagovano 30 minuta na sobnoj temperaturi. Nakon reakcije, apsorbancija smjese je određena na 520 nm. Iz Trolox standardne krive, TEAC je izračunat i izražen u mg TE po g suhog uzorka.

2.5. Analiza tečnom hromatografijom visokih performansi (HPLC).

Primijenjena je modificirana HPLC metoda [22]. ISL sadržajsladićekstrakti su analizirani HPLC sa UV-vidljivim detektorom (HPLC: 1200 serija, Agilent Technologies, Santa Clara, Kalifornija, SAD; kolona: SynergiTM, 250 × 4,6 mm, 4 µm, Fusion-RP 8{{40}} Å, Phenomenex, Torrance, Kalifornija, SAD). Mobilna faza se sastojala od rastvarača A (0.1 posto mravlje kiseline vode) i rastvarača B (0.1 posto mravlje kiseline u acetonitrilu). Program gradijenta za mobilnu fazu radio je pod sljedećim gradijentom: 0–8 min (20–20 posto B), 8–30 min (20–38 posto B), 30–42 min (38–50 posto B), 42–47 min (50–90 posto B), 47–53 min (90–90 posto B), 53–54 min (90–20 posto B) i 54–60 min (20–20 posto B) . Brzina protoka, talasna dužina detekcije i zapremina ubrizgavanja postavljeni su na 1,0 mL/min, 360 nm i 10 µL, respektivno. Standardni rastvori ISL-a su analizirani sa četiri različite koncentracije (0,05, 0,1, 0,2, 0,4 mg/mL). Kalibraciona kriva (y=ax plus b) je korištena za određivanje sadržaja ISL-a. U regresijskoj jednačini, x se odnosi na koncentraciju ISL-a (mg mL−1), a y označava površinu pika.

2.6. Test aktivnosti inhibicije tirozinaze gljiva

Test inhibitorne aktivnosti TYR sproveden je korišćenjem kompleta za skrining TYR inhibitora (BioVision, Milpitas, Kalifornija, SAD). Svaki ekstrakt (WC i WH-130) je otopljen u DMSO do konačne koncentracije od 250 µg/mL. Kojična kiselina, korištena kao pozitivna kontrola, također je razrijeđena na 250 µg/mL u DMSO. Ukratko, 20 µL ekstrakta ili kojične kiseline je kombinovano sa 50 µL rastvora TYR enzima. Nakon inkubacije na sobnoj temperaturi od 10 minuta, u svaku jažicu je dodano 30 µL otopine TYR supstrata. Konačna koncentracija ekstrakata i kojične kiseline bila je 50 µg/mL. Optička gustina jažica je zatim merena na 510 nm u kinetičkom režimu tokom 1 h sa čitačem mikroploča (BioTek, Winooski, VT, USA).

cistanche prah: antioksidativno

2.7. Cell Culture

Ćelije mišjeg melanoma B16F10 su dobijene iz Američke kolekcije tipskih kultura (ATCC, Manassas, VA, SAD). B16F10 ćelije su uzgajane u Dulbeccovom modificiranom Eagleovom mediju (DMEM) sa dodatkom 10 posto fetalnog goveđeg seruma (FBS), 100 jedinica/mL penicilina i 100 µg/mL streptomicina (Gibco, Grand Island, NY, SAD) koji sadrži vlažnu55 procenat CO2 na 37 ◦C.

2.8. Ispitivanje vitalnosti ćelija

Citotoksičnost odsladićekstrakti (WC i WH-130) u B16F10 ćelije određen je pomoću MTT [3-(4,5-dimetiltiazol-2-il)-2,{{8 }}difeniltetrazolijum bromid] test. B16F10 ćelije su kultivisane na 4 × 103 ćelije/jamici u 96- pločici sa bunarima tokom 24 h. Nakon toga, ekstrakti su dodani ćelijama u koncentracijama od 50, 100 i 200 µg/mL i inkubirani na 37 ◦C tokom 48 h. Zatim je u svaku jažicu dodat MTT rastvor (500 µg/mL) i ploča je inkubirana 1 h na 37 ◦C. Medij u svakoj jažici je odbačen i dodano je 100 µL DMSO. Nakon mućkanja od 30 minuta, mjerena je apsorbancija na 540 nm čitačem mikroploče. Svi testovi su obavljeni u tri primjerka.

2.9. Mjerenje sadržaja ćelijskog melanina

Sadržaj intracelularnog melanina mjeren je pomoću malo modificirane verzije metode koja je prethodno opisana [27]. Ćelije melanoma B16F10 su posađene u 6- ploče sa gustinom od 8 × 104 ćelija/jažici i inkubirane 24 h. Ćelije su bile izložene ekstraktima (WC i WH-130, 100 µg/mL), kojičnoj kiselini (100 µg/mL) ili ISL-u (10 µM, Millipore Sigma, Burlington, MA, Sjedinjene Američke Države) tokom 48 h u prisustvo 100 µM 3-izobutil-1-metilksantina (IBMX). Nakon tretmana, ćelije su isprane Dulbeccovim fiziološkim rastvorom puferovanim fosfatom (DPBS) i rastvorene u 200 µL 1 N NaOH tokom 2 h na 90 ◦C. Apsorbancija na 405 nm je izmjerena pomoću čitača mikroploče.

2.10. Test aktivnosti stanične tirozinaze

Intracelularna aktivnost TYR-a je mjerena primjenom malo modificirane verzije prethodno opisane metode [27]. Ćelije melanoma B16F10 (8 × 104 ćelije/jažici) tretirane su ekstraktima (100 µg/mL) ili kojičnom kiselinom (100 µg/mL) u prisustvu 100 µM IBMX tokom 48 h, sakupljene i isprane sa DPBS. Uzorci proteina su lizirani u 1% TrionX-100 (MilliporeSigma, Burlington, MA, SAD) sa natrijum fosfatnim puferom (pH 6,8), a zatim centrifugirani na 15,000 rpm 10 min. Supernatantna frakcija je sakupljena i koncentracija proteina je određena upotrebom kompleta za ispitivanje bicinhoninske kiseline (BCA) (Waltham, MA, SAD). Reakciona smjesa koja se sastoji od 30 µg proteina (podešenih na 100 µL sa 1 posto Trion X-100) i 100 µL 10 mM L-DOPA dodana je u svaku jažicu 96-ploče. Nakon inkubacije na 37 ◦C tokom 1 h, dopahrom je praćen mjerenjem apsorpcije na 490 nm pomoću čitača mikroploče. TYR aktivnost je izračunata sa sljedećom formulom:

Aktivnost tirozinaze ( posto )=(OD405 uzorka/OD405 kontrole) × 100

2.11. Lančana reakcija polimeraze u realnom vremenu (RT-PCR)

Nivoi ekspresije mRNA gena povezanih s melanogenezom, uključujući MITF, TYR, TRP-1 i TRP-2, određeni su korištenjem modificiranog RT-PCR testa [28]. Ukratko, B16F10 ćelije su posađene u 6- ploče sa bunarima pri gustini od 8 × 104 ćelija po jažici i kultivisane 24 h. Zatim su ćelije tretirane ekstraktima (100 µg/mL), kojičnom kiselinom (100 µg/mL) ili ISL-om (10 µM) tokom 48 sati. Ukupna RNK je izolirana iz ćelija korištenjem TRIzol reagensa (Ambion, Austin, TX, SAD), a zatim je koncentracija RNK kvantificirana pomoću čitača za mikroploče. Nakon pripreme cDNK (2 µg) korištenjem Reverse Transcriptase Premix Kit (ElpisBiotech, Daejeon, Koreja) prema protokolima proizvođača, PCR u realnom vremenu je izveden korištenjem MITF, TYR, TRP-1, TRP-2 i -aktinski prajmeri (Tabela 1, Bioneer, Daejeon, Koreja) sa SYBR Green kitom (ProGEN, Heidelberg, Njemačka) u CFX96 PCR instrumentu u realnom vremenu (Bio-Rad, Hercules, Kalifornija, SAD). Svi podaci su normalizovani na nivoe -actinmRNA kao referentnog gena za održavanje domaćinstva.

2.12. Priprema ćelijskih lizata i Western blot analiza

B16F10 ćelije su zasijane u 6-ploče sa gustinom od 8 × 104 ćelije po jažici, inkubirane 24 h, a zatim izložene ekstraktima (100 µg/mL), kojičnoj kiselini (100 µg/mL ) ili ISL(10 µM) tokom 48 h. Nakon ispiranja sa DPBS, ćelije su sakupljene i lizirane u Triton X{10}}puferu (MilliporeSigma, Burlington, MA, SAD) koji je sadržavao 1 posto koktela proteaze i inhibitora fosfataze. Koncentracije proteina lizata cijelih stanica mjerene su korištenjem aBCA testnog kompleta (Waltham, MA, SAD). Jednake količine proteina (20 µg) su stavljene na 10% natrijum dodecil sulfat-poliakrilamid gelove, koji su stavljeni 4 h na 70 V. Zatim su proteini prebačeni na membranu od poliviniliden fluorida (PVDF). Membrana je tri puta isprana Tris puferiranim fiziološkim rastvorom [50 mM Tris-HCl (pH 7,5), 150 mM NaCl] koji sadrži 0,1 posto Tween 20 (TBST) i blokirana sa 2 procenta goveđeg serumskog albumina (GenDEPOT) na 1 h. Zatim su membrane inkubirane preko noći na 4 ◦C sa primarnim antitelima (razblaživanje 1:1000) tokom 4 h na sobnoj temperaturi. MITF, TYR, TRP-1, TPR-2 i -actin su detektovani sa zečjim poliklonskim anti-MITF antitelom (Abcam, Cambridge, UK); kozje poliklonsko anti-TYR antitijelo (Santa Cruz, Dallas, TX, SAD); i mišja monoklonska antiTRP-1, anti-TRP-2 i anti- -aktin antitijela (Santa Cruz, Dallas, TX, USA), respektivno. Nakon toga, membrane su isprane nekoliko puta sa TBST i inkubirano sa sekundarnim antitijelima (razrjeđenje 1:2000) 1 h, naime zečjim anti-mišjim IgG, mišjim antikozjim IgG i kozjim antimišjim IgG (Santa Cruz, Dallas, TX, SAD), nakon čega slijedi nekoliko ispiranja sa TBST. Ciljni proteini su detektovani korišćenjem reagensa poboljšane hemiluminiscencije (ECL) (Bio-Rad, Hercules, Kalifornija, SAD) sa ChemiDoc Imaging sistemom (Bio-Rad,Hercules, Kalifornija, SAD). Kvantifikacija proteinskih traka je provedena korištenjem softvera ImageJ (verzija 1.52a za Windows; NIH, Rockville, MD, USA) [28].

2.13. Statistička analiza Podaci su analizirani pomoću programa Microsoft Excel 2016 i svi eksperimentalni rezultati su predstavljeni kao srednja vrijednost ± standardna devijacija (SD) tri nezavisna mjerenja. Studentov t-test sa dva uzorka korišten je za procjenu razlika između kontrole i uzoraka. Jednosmjerna analiza varijanse (ANOVA) i Duncan test su izvedeni korištenjem Rsoftware-a (verzija 3.6.3) kako bi se odredila značajnost svakog poređenja na nivoi p < 0.05="" (*),="" p="">< 0,01="" (**)="" i="" p="">< 0,001="" (***).="" korelaciona="" analiza="" je="" izvršena="" pomoću="" prism5.02="" (graphpad="" software,="" san="" diego,="" ca,="">

3. Rezultati

3.1. Browning indeks ekstrakta sladića

Stepen tamnjenjasladićekstrakti prikazani su na slici 1a. Ovi rezultati su potvrdili da je termički obrađen ekstrakt (WH-130, 0.965 ± 0.025 AU [jedinice apsorpcije]) imao mnogo veće vrijednosti indeksa posmeđivanja od negrijanog ekstrakt (WC, 0.758 ± 0,005 AJ). Očekujemo da termička obrada povećava formiranje melanoidina u WH-130 i da ova promjena može biti povezana s različitim biološkim aktivnostima.

3.2. Ukupni fenolni sadržaj (TPC) ekstrakta sladića

Slika 1b prikazuje TPC zasladićekstrakti. Pronašli smo razliku u TPC između WC-a i WH{{0}}, jer je WC imao TPC od 12.093 ± 0,061 mg GAE/g ekstrakta, dok je WH-130imao TPC od 14,098 ± 0,781 mg GAE/g ekstrakta. Toplinska obrada povećala je TPC ekstrakta sladića.

3.3. Aktivnost uklanjanja radikala ekstrakta sladića

Theantioksidansaktivnost odsladićekstrakti su prikazani na slici 1c,d. ABTS plus kapacitet uklanjanja radikala bio je veći za WH-130 ekstrakt (6.086 ± 0.304 mg TEAC/gextract) od WC ekstrakta (3.542 ± 0.093 mg TEAC/g ekstrakta). U DPPH testu uočena je slična tendencija. Ekstrakt WH-130 (7,442 ± 0,292 mg TEAC/g ekstrakta) pokazao je veću aktivnost uklanjanja radikala DPPH od WC ekstrakta (4,033 ± 0,160 mg TEAC/geekstrakt). Ovi rezultati pokazuju da zagrijavanje može povećati antioksidativnu aktivnost ekstrakata.

3.4. Sadržaj izoliquiritigenina u ekstraktima sladića

Rezultati su pokazali da se sadržaj ISL u WC-u značajno povećao nakon termičke obrade (Tabela 2, Slika 2), što ukazuje da termička obrada može uticati na sadržaj ovogantioksidansiantimelanogenspoj.

cistanche tubolosa

3.5. Cell Viability

Kao što je prikazano na slici 3,sladićekstrakti nisu uticali na vitalnost ćelija pri 50 ili 100 µg/mL u odnosu na kontrolu tretiranu IBMX-om. U tretmanima od 50 i 100 µg/mL svih ekstrakata, vitalnost ćelija je ostala veća od 100 posto. Stoga su daljnji eksperimenti provedeni korištenjem koncentracija ekstrakta sladića do 100 µg/mL.

3.6. Učinci ekstrakta sladića na proizvodnju melanina u stanicama melanoma B16F10

Pigmentacija i sadržaj melanina u B16F10 ćelijama prikazani su na slici 4a,b. Sadržaj melanina u B16F10 ćelijama povećan je do 3.4-puta sa IBMX tretmanom u odnosu na netretiranu kontrolu. WC i WH-130 su pokazali značajno smanjenu pigmentaciju i sadržaj melanina u poređenju sa grupom koja je tretirana IBMX-om (Slika 4a,b). I WC i WH{{10}} su pokazali niži sadržaj melanina od ćelija tretiranih KA. Inhibicijski efekat sinteze melanina u B16F10 ćelijama tretiranim sa WH-130 bio je veći nego WC. Količine melanina prisutne nakon tretmana sa 100 µg/mL WC i WH-130 smanjene su na približno 0.59-puta i 0.51- puta, respektivno, od nivoa u IBMX-u tretiranom group.ISL (10 µM) i KA (100 µg/mL) potisnuli su proizvodnju melanina na 0.59-puta i 0.67- puta, u zavisnosti od nivoa u ćelijama tretiranim IBMX-om.

Ovaj rezultat pokazuje da je termički obrađensladićekstrakt (WH-130) može inhibirati proizvodnju melanina efikasnije od negrijanog ekstrakta (WC). Štaviše, primijetili smo da je tretman sa WH-130 ekstraktom od 25, 50 i 100 µg/mL (Slika 4c) rezultirao smanjenjem sadržaja melanina u B16F10 ćelijama melanoma ovisno o koncentraciji. Zajedno, ovi rezultati pokazuju da je grijanje poboljšaloantimelanogenaktivnost ekstrakta sladića.

3.7. Efekti ekstrakta sladića na aktivnost tirozinaze

3.7.1. Aktivnost tirozinaze gljiva

Efekat odsladićekstrakti o TYR aktivnosti gljiva prikazani su na slici 5a. Potvrdili smo da se efekat ekstrakata (WC i WH-130) na oksidaciju supstrata pomoću TYR pečuraka dogodio u uslovima bez ćelija. Pri 50 µg/mL, WC ekstrakt inhibira aktivnost denzima na 81,33 posto, dok je WH-130 potisnuo TYR aktivnost na 65,95 posto EC nivoa. U međuvremenu, kojična kiselina (KA), inhibitor TYR, izazvala je inhibiciju aktivnosti enzima na 47,09 posto EC nivoa. Inhibicija TYR aktivnosti bila je veća kod termički obrađenog sladića (WH-130) nego kod negrijanog sladića (WC).

3.7.2. Aktivnost stanične tirozinaze

Kao što je prikazano na slici 5b, TYR aktivnost ćelija tretiranih IBMX-om porasla je na 233 posto u odnosu na netretiranu kontrolu (100 posto). WC je smanjio TYR aktivnost na 82,17 posto u poređenju sa grupom koja je tretirana IBMX-om. Ekstrakt WH-130 inhibirao je ćelijsku aktivnost TYR na 59,88 posto u poređenju sa ćelijama tretiranim IBMX-om. KA je smanjio ćelijsku aktivnost TYR na 74,07 posto nivoa u ćelijama tretiranim IBMX-om. Zajedno, ovi rezultati pokazuju da ekstrakti sladića (WC i WH-130) potiskuju aktivnost TYR i da WH-130 ima snažniju inhibitornu aktivnost TYR od WC i KA.

Zatim smo istražili korelacije između TPC, ISL sadržaja,antioksidansaktivnost i antimelanogena aktivnost (tabela 3). TPC je bio u pozitivnoj korelaciji sa ISL sadržajem (0.827), kao i sa ABTS plus i DPPH aktivnostima uklanjanja radikala (0.886 i 0.896, respektivno), dok TPC je bio u obrnutoj korelaciji sa sadržajem melanina (–0.859). Sadržaj ISL-a je bio u pozitivnoj korelaciji sa ABTS plus i DPPH aktivnostima uklanjanja radikala (0.977 i 0.985, respektivno), dok je ISL sadržaj bio u obrnutoj korelaciji sa TYRactivity (–0). 834) i sadržaj melanina (–0.995). Antioksidativne aktivnosti (ABTS plus i DPPH) bile su u obrnutoj korelaciji sa aktivnošću TYR (–{{20}}.879 i –0.856, respektivno) i sadržajem melanina (–0. 974 i –0,984, respektivno). Ovi rezultati pokazuju da su fenolna jedinjenja kao što je ISL u sladićima usko povezana sa antioksidansom iantimelanogenaktivnosti ekstrakta sladića.

3.8. Efekti ekstrakta sladića na ekspresiju mRNA gena povezanih s melanogenezom

Ispitivali smo ekspresiju gena povezanih s melanogenezom u B16F10 ćelijama kako bismo razjasnili efekte ekstrakta sladića na melanogenezu. I WC i WH-130 potisnuli su ekspresiju mRNA MITF, TYR, TRP-1 i TRP-2 (Slika 6). WC je inhibirao ekspresiju mRNA MITF, TYR, TRP-1 i TRP-2 do nivoa 0.{{10}} puta, 0.{101} {12}}fold, 0.71-fold i 0.65-fold, respektivno, onih u ćelijama tretiranim IBMX-om. WH-130 je inhibirao ekspresiju mRNA MITF, TYR, TRP-1 i TRP{{20} do 0.43-prestruko, {{33 }}.60-fold, 0.62-fold i 0.49-fold, redom, IBMX-tretiranih nivoa grupe. Ekstrakt WH{{30}} imao je jači inhibitorni efekat na ekspresiju mRNA nego ekstrakt WC. ISL je također potisnuo izražavanje MITF, TYR, TRP-1 i TRP-2 (0.42-fold, 0.59-fold, 0.68-fold i 0.44-puta, respektivno, u odnosu na ćelije tretirane IBMX-om). U grupi liječenoj WH-130-, stepen smanjenja ekspresije mRNA gena povezanih s melanogenezom bio je veći nego u grupi liječenoj WC-om, što ukazuje dasladićekstrakti inhibiraju melanogenezu supresijom transkripcije gena povezanih s melanogenezom i da toplinska obrada poboljšavaantimelanogenaktivnost ekstrakta sladića.

3.9. Efekti ekstrakta sladića na ekspresiju proteina gena povezanih s melanogenezom

Kao što je prikazano na slici 7b, tretman sa WC i WH-130 značajno je smanjio nivoe ekspresije proteina MITF, TYR, TRP-1 i TRP-2. Nivoi ekspresije MITF, TYR,TRP-1 i TRP-2 su potisnuti u ćelijama tretiranim WC-om (0.79-fold, 0.{{9 }}fold, {{10}.89-fold and 0.67-fold, respektivno, u odnosu na ćelije tretirane IBMX-om). WH-130 je pokazao smanjene nivoe ekspresije proteina MITF, TYR, TRP-1 i TRP-2 ({{20}}.74- puta, {{24 }}.73-savijte, 0.80-preklopite i {{30}}.48-preklopite, respektivno, u odnosu na ćelije tretirane IBMX-om) . ISL je smanjio nivoe ekspresije proteina MITF, TYR i TRP-2 (0.76-puta, 0.83-puta i 0.41- puta, respektivno, u odnosu na IBMX tretirane ćelije). WH-130 je jače potiskivao ekspresiju proteina gena povezanih s melanogenezom nego WC, pokazujući dasladićekstrakti inhibiraju melanogenezu supresijom translacije gena povezanih s melanogenezom i da toplinska obrada poboljšavaantimelanogenaktivnost ekstrakta sladića.

Cistanche puder za izbjeljivanje kože

4. Diskusija

Rezultati ovog istraživanja pokazuju da je termička obrada odsladićutiče na TPC, antioksidativnu aktivnost iantimelanogenaktivnost. WH-130 je imao veći indeks zatamnjenja i TPC vrijednosti od WC-a. Uslovi obrade, uključujući temperaturu i pritisak, utiču na sastojke uzoraka. [29]. Zagrijavanje može potaknuti Maillardove reakcije, koje su povezane s proizvodnjom melanoidina [23]. Melanoidini imaju neke biološke efekte, uključujućiantioksidans, antitumorske i antihipertenzivne aktivnosti, kao i modulaciju šećera u krvi [30]. Ovi spojevi su polimerne smeđe obojene makromolekule nastale Maillardovom reakcijom interakcijom između šećera i aminokiselina na visokim temperaturama [21]. Dakle, što je više melanoidina u zagrijanom ekstraktu, to je veći indeks posmeđivanja. Boja negrijanog ekstrakta sladića (WC) pokazivala je svijetlosmeđu boju, ali je s visokom temperaturom (130 stepeni) postepeno postajala tamnija. Proces zagrijavanja također može izazvati neke promjene u kemijskoj strukturi fenolnih spojeva i uzrokovati razgradnju ćelijskih zidova biljaka, oslobađajući fenole, što dovodi do antioksidativnih aktivnosti [31]. Stoga se sadržaj fenola u ekstraktima sladića može povećati toplinskom obradom [21]. Prethodni izvještaji su pokazali da je termička obrada meda povećala stvaranje melanoidina, a stupanj tamnoćenja koincidira s povećanjem antioksidativne aktivnosti [24]. Stoga je WH-130 pokazao veći antioksidativni kapacitet od WC u ABTS plus i DPPH testovima uklanjanja radikala, koji su se široko koristili za određivanje antiradikalne aktivnosti uzoraka na osnovu kapaciteta za prijenos elektrona ili atoma vodonika [32].

Najčešći prirodniantioksidansa antimelanogena jedinjenja su fenoli. Tricin i 9-hidroksioktadekadienska kiselina su identificirani kao glavni fenolni u Sorghum bicolor. Osim toga, ove komponente su pokazale antioksidativne i antimelanogene efekte inhibicijom aktivnosti tirozinaze [19]. Pored toga, dokazano je da je p-kumarinska kiselina, aktivno jedinjenje Sasa quelpaertensis Nakai, da ovo jedinjenje snažno inhibira aktivnost tirozinaze i smanjuje proizvodnju melanina u ćelijama melanoma [27]. Prema prethodnim istraživanjima, ISL, dobro poznato jedinjenje flavonoida u produktu hidrolize korijena sladića [6–8], pokazuje antioksidativno i antimelanogeno djelovanje inhibicijom aktivnosti TYR, transportom melanosoma i indukcijom degradacije melanina [10,31] Dakle, fokusirali smo se na sadržaj ISL-a u ekstraktima i djelovanje ISL-a u mehanizmima vezanim za melanogenezu. ISL se primjenjuje kao terapeutsko sredstvo za mnoge bolesti zbog brojnih bioloških aktivnosti, uključujući protuupalno, antimikrobno, antioksidativno, antikancerogeno, imunoregulatorno, hepatoprotektivno i kardioprotektivno djelovanje [33]. U ovoj studiji, veći je sadržaj ISL-a izmjeren u WH-130 nego u WC-u. Hiperpigmentacija kože povezana je s oksidativnim stresom. Prijavljeno je da hvatači slobodnih radikala igraju važnu ulogu u suzbijanju hiperpigmentacije [17,34]. Zajedno, ovi rezultati pokazuju da toplinska obrada sladića može poboljšati njegove aktivnosti uklanjanja radikala iantimelanogenaktivnosti kroz povećanje nivoa antioksidativnih fenolnih jedinjenja kao što je ISL. Prema dosadašnjoj literaturi, u sladića (Glycyrrhiza uralensis, G. glabra) postoje glabren, glabridin, glabrol, liquiritigenin, koji inhibira tirozinazu. Dakle, ova jedinjenja takođe mogu imati uticaj na antimelanogene aktivnosti [10,11,15,35]. Dalja istraživanja o njima su važna da bi se razjasnili antimelanogeni efekti sladića.

Sintezu melanina regulišu TYR, TRP-1, TRP-2 (dopahrom tautomeraza) i MITF (slika 8). TYR, glikoprotein koji sadrži bakar, djeluje kao enzim koji ograničava brzinu i igra ključnu ulogu u proizvodnji melanina. TYR katalizira hidroksilaciju tirozina u 3,4-dihidroksifenilalanin (DOPA). TYR također katalizira oksidaciju DOPA u dopakinon i konverziju dopakinona u dopahrom. Zatim se dopahrom pretvara u dihidro-indolizin (DHI) ili indol 5,6-kinon-2-karboksilnu kiselinu (DHICA) [36–38]. Na ovom putu, TRP-2 katalizira konverziju dopahroma u DHICA, koji se oksidira od strane TRP-1 da nastane eumelanin. MITF je specifični transkripcijski faktor koji igra ključnu ulogu u melanogenezi kao glavni regulator ekspresije TYR, TRP-1 i TRP-2 (Slika 8) [28,37]. Hemijski induktor melanogeneze je 3-izobutil-1-metilksantin (IBMX), koji povećava aktivnost TYR putem cAMP signalnog puta [13]. IBMX povećava intracelularnu koncentraciju cAMP inhibirajući cAMP fosfodiesterazu. Povećanje nivoa cAMP aktivira protein kinazu A (PKA), a aktivirana PKA poboljšava aktivnost i ekspresiju cAMP vezanog proteina (CREB) [39]. CREB se vezuje za MITF promotor, što dovodi do povećanja ekspresije MITF gena. Aktivacija MITF-a pospješuje ekspresiju TYR i TRP [13,19]. Stoga, smanjenje MITF-a dovodi do hipopigmentacije.

Zagrijani ekstrakt sladića (WH-130) inhibirao je TYR gljiva i ćelijsku aktivnost TYR efikasnije od nezagrijanog ekstrakta sladića (WC). Inhibicija ćelijske TYR aktivnosti u ekstraktima sladića može biti uzrokovana smanjenjem TYR-a. Ovi rezultati su povezani sa sadržajem melanina u ćelijama melanoma B16F10. U ćelijama B16F10, tretmani WH-130 suprimirali su IBMX-indukovanu proizvodnju melanina bolje od tretmana WC-om. Štaviše, WH 130 je smanjio transkripciju i translaciju markera povezanih s melanogenezom (MITF, TYR, TRP-1, TRP-2) u B16F10 ćelijama u većoj mjeri nego WC. Ovi markeri mogu zajedno doprinijeti ukupnomantimelanogenaktivnost [40].

Grijanje odsladićekstrakt povećao je obilje antioksidativnih fenolnih jedinjenja kao što je ISL, a ovo povećanje je povezano sa povećanimantioksidansaktivnosti (ABTS plus i DPPH). Zagrijani ekstrakt sladića (WH-130) također je pokazao povećanu inhibitornu aktivnost TYR i smanjenu sintezu melanina. Postoji novi trend u razvoju prirodnih materijala zbog potencijala za sigurnost. Sladić se koristio u kozmetičkim kremama za hiperpigmentaciju [41]. Pokazali smo potencijal Wongama kao novogizbjeljivanje kožesredstvo za upotrebu u kozmetici i potvrđeno da toplinska obrada može poboljšati njegov potencijal.

Glycyrrhiza uralensis Fischer (sladić) ima antioksidativno i UV fotoprotektivno djelovanje u ljudskim dermalnim fibroblastima [22]. Međutim, studije poređenja između Wongama (sladić) i drugih autohtonih vrsta moraju se provesti naknadno. Osim toga, treba provesti daljnje studije o neidentifikovanim komponentama, kao što su glabren, glabridin, Wongama koje su povezane sa njegovim antimelanogenim učinkom koristeći odgovarajuće metode. Neophodno je istražiti sinergističke ili antagonističke efekte među fenolnim spojevima nakon analize sastojaka u ekstraktu sladića [40]. Da ispitamo kako te supstance djeluju naantioksidansi anti-melanogene mehanizme, transfer atoma vodonika ili sisteme prenosa jednog elektrona i signalne puteve protein kinaze aktivirane mitogenom treba procijeniti [32,37].

5. Zaključci

U ovoj studiji smo istraživali potencijal ekstrakta Wongam, nove sortesladić, kaoizbjeljivanjesredstvo za primjenu u kozmetici i utjecaj toplinske obrade na njihovu bioaktivnost. Ekstrakti Wongam (WC i WH-130) pokazali su visoke aktivnosti uklanjanja radikala i inhibirali sintezu melanina u melanocitima induciranim IBMX supresijom aktivnosti TYR. Toplinska obrada je povećalaantioksidansi antimelanogene aktivnosti Wongama. Kao rezultat toga, WH-130 je pokazao superiorni antioksidativni iantimelanogenaktivnosti od WC-a. Naši rezultati sugeriraju da je termički obrađen ekstrakt Wongam (WH-130) snažno sredstvo za smanjenje pigmenta s mogućom primjenom kod različitih dermatoloških hiperpigmentacijskih poremećaja, uključujući smeđe mrlje, pjege i melazmu, te pokazuju da se termička obrada može koristiti za poboljšanje antimelanogena aktivnost sladića.

cistanche tubolosa prednosti: izbjeljivanje kože