Antifungalni potencijal sekundarnih metabolita uključenih u interakciju između citrusnih patogena i Cistanchea

Kontakt: Audrey Hu Whatsapp/hp: 0086 13880143964 Email:audrey.hu@wecistanche.com

Agrumi imaju značajan uticaj na svjetsku ekonomiju jer imaju najveću proizvodnju u odnosu na ostalo voće; na primjer, predviđa se da će globalna proizvodnja narandže za 2018/19. dostići 54,3 miliona tona. Glavni faktor koji utiče na kvalitet citrusa je berba nakon berbegljivične bolesti,posebno, zelena plijesan uzrokovana Penicillium digitatum koja je odgovorna za 90 posto gubitaka citrusa tokom perioda nakon berbe1,3. Za kontrolu bolesti nakon žetve, sintetički fungicidi se široko koriste, uzrokujući zdravstvene i ekološke probleme. Nadalje, neki sojevi gljiva razvili su otpornost na uobičajene fungicide. Asantifungalniotpornost postaje značajna zabrinutost, potraga za novim bioaktivnim jedinjenjima ima važnu ulogu da se zaobiđe ekstenzivna upotreba fungicida7. Mikroorganizmi su jedan od glavnih izvora prirodnih proizvoda sa korisnim biološkim aktivnostima, odnosno potencijalomantifungici, antibiotici, agensi protiv raka, surfaktanti. Međutim, osim genetskog potencijala i raznolikosti mikroba, mnogi mikrobni biosintetski geni se ne aktiviraju u neprirodnim uvjetima uzgoja koji se koriste u laboratoriji i samo je nekoliko dijelova metabolita dostupno10. Primjenjuje se nekoliko strategija za prevazilaženje ograničenja u otkrivanju prirodnih proizvoda iz mikrobnih izvora, tj. OSMAC pristup10,11, korištenje epigenetskih modifikacija i ko-kultivacija14. Ko-kulture koje oponašaju prirodno okruženje, pokazujući mikrobnu konkurenciju za ograničen prostor i hranjive tvari, otkriveno je kao glavna ekološka sila koja može aktivirati tihe genske klastere i odbrambene mehanizme koji mogu dovesti do proizvodnje bioaktivnih sekundarnih metabolita. 1 Institut za hemiju, Univerzitet Campinas, CP 6154, 13083-970, Campinas, SP, Brazil. 2 Centar za prirodne i humane nauke, Federalni univerzitet ABC, 09210-580, Santo André, SP, Brazil. 3Odjel za biomolekularnu hemiju, Leibniz institut za istraživanje prirodnih proizvoda i biologiju infekcija – Institut Hans Knöll, Jena, Njemačka. 4Katedra za hemiju prirodnih proizvoda, Univerzitet Friedrich Schiller Jena, 07743, Jena, Njemačka. relevantno za omogućavanje ne samo identifikacije novih jedinjenja, već i za istraživanje hemijskih događaja koji upravljaju interakcijama između mikroorganizama u prirodi. Do danas nema podataka o tome kako gljive patogena citrusa komuniciraju s drugim mikroorganizmima u istom okruženju i koji su mehanizmi napada i odbrane od endofitnih mikroorganizama ili drugih fitopatogena. Ove informacije mogu dovesti do otkrića novih sekundarnih metabolita uključenih u mikrobne interakcije i pružiti bolje znanje o važnosti mikrobne ekologije tokom procesa infekcije. Ovdje prikazujemo interakciju između Penicillium digitatum i Penicillium citrinum, s ciljem traženja novihantifungalnijedinjenja koja bi se mogla koristiti za kontrolu bolesti nakon žetve. Uzimajući u obzir ovu svrhu, strategija ko-kulture i MSI su primijenjeni kako bi se inducirala proizvodnja sekundarnih metabolita i dali početni uvid u njihovu biološku ulogu na osnovu njihove prostorne distribucije u interakciji. Metaboliti od interesa su izolovani i sve strukture su razjašnjene na osnovu masene spektrometrije i NMR eksperimenata. ipak,antifungalnirađeni su testovi i konfokalna mikroskopska analiza kako bi se istražio potencijal metabolita gljivica kao novihantifungalniagenti.

HERB CISTANCHE

Materijali i metode

Kultura gljiva.Soj P. digitatum (PD) korišten u studijama deponovan je u Španjolskoj kolekciji tipskih kultura (CECT) pod pristupnom šifrom CECT20796. P. citrinum (PC) soj je obezbijedio Sylvio Moreira Citrus Center (Cordeirópolis, SP, Brazil). P. digitatum i P. citrinum uzgajani su na komercijalnom krompir dekstroznom agaru (PDA) (Acumedia). PDA je autoklavirana na 103 KPa (121 stepen) 15 min. PDA ploče su čuvane na 25 stepeni 7 dana u mraku. Spore su sakupljene ispiranjem površine agara sterilnom destilovanom vodom i razrjeđivanjem do konačne koncentracije od 106 ili 105 spora mL-1.

Kokultura za rast uslovljava gljivične rastvor spora (106 spora mL-1) je inokulisan, na suprotnim stranama. Ploče su inkubirane u mraku na 25 stepeni 7 dana.

Za MSI analize i konfokalnu mikroskopiju, in vitro kokultura je pripremljena stavljanjem sterilnog mikroskopskog stakalca u Petrijevu posudu, nakon čega je uliveno 11 ml PDA22, a inokulum je napravljen iznad mikroskopskog stakalca. Ploče su inkubirane u mraku na 25 stepeni 72h. Za in vivo ko-kulturu, zrele narandže (Citrus sinensis) su površinski sterilizirane i ranjene23. Mali komadić PDA koji sadrži P. citrinum inokuliran je na mjesto rane. Inficirane i kontrolne narandže čuvane su u sterilnim čašama od 500 ml, u tami na 25 stepeni. Nakon 10 dana, plodovi su ranjeni na suprotnom ekvatorijalnom području inokuluma P. citrinum i inficirani rastvorom spora P. digitatum 106 mL-1. Plodovi su čuvani više od 5 dana u mraku na 25 stepeni.

Analiza spektrometrije mase (MSI) i generisanje MS slike.

Nakon perioda inkubacije, mikroskopska stakla su uklonjena iz Petrijevih posuda i stavljena u vakuum eksikator, na 1 sat, radi potpune dehidracije agara (Angolini et al., 2015). MSI analize su izvedene direktno na mikroskopu koji je sadržavao ko-kulturu, u pozitivnom modu, koristeći izvor desorpcione elektrosprej jonizacije (DESI) Prosolia Model Omni Spray 2D®-3201) spojenog na Thermo Scientific QExactive® Hybrid Quadrupole-Orbitrap Maseni spektrometar. MSI podaci su dobijeni sa snagom razlučivanja mase 70.000 na m/z 200. Korištena DESI konfiguracija bila je ista postavljena u prethodnom radu22. Slike su generisane sa širinom bine od Δm/z=± 0,07 korišćenjem softvera za konverziju podataka Firefly (verzija 2.1.05) i obrađene korišćenjem BioMap softvera (verzija 3.8.0.4) koji je razvio Novartis institut za biomedicinska istraživanja. U BioMapu, skaliranje boja je podešeno na fiksnu vrijednost tokom obrade svake slike. MS spektri su obrađeni softverom Xcalibur (verzija 3.0.63) koji je razvio Thermo Fisher Scientific.

Ekstrakcija metabolita iz eksperimenata ko-kulture.

Cijeli sadržaj ko-kulture in vitro izrezan je na male komade i prebačen u Erlenmajerovu tikvicu. Ekstrakcija je izvedena metanolom. Boce su sonikirane 1 h u ultrazvučnom kupatilu i filtrirane pod vakuumom. Rastvarač je uklonjen pod sniženim pritiskom, a konačni ekstrakt je čuvan na -20 stepeni.

Za in vivo ko-kulturu, kore narandže su izrezane (2 cm×2 cm) u zoni interfejsa između mikroorganizama, a ekstrakcija je izvedena sa 5 mL metanola tokom 1 h u ultrazvučnoj kupelji. Ekstrakti su filtrirani, sušeni pod N2 i čuvani na -20 stepeni.

Masena spektrometrijska analiza (MS).

Ekstrakti su razrijeđeni u metanolu i analizirani na Thermo Scientific QExactive® Hybrid Quadrupole-Orbitrap masenom spektrometru. Analize su obavljene u pozitivnom modu sa m/z opsegom 115–1500, naponom kapilare od 3,4 kV, temperaturom ulazne kapilare 280 stepeni, S sočivom 100V. Ubrizgano je 5 µL uzorka. Stacionarna faza: Termo Scientific kolona Accucore C18 2.6 µm (2.1mm×100mm). Mobilna faza: 0,1 posto mravlje kiseline (A) i acetonitrila (B). Profil eluenta (A/B): 95/5 do 2/98 u roku od 15 min, držite 5 min, do 95/5 unutar 1,2 min i držite 7,8 min. Ukupno vrijeme rada je 29 minuta za svaki ciklus, a brzina protoka je bila 0,2 mLmin-1. Zapremina ubrizgavanja: 5 µL.MS/MS izvedena je disocijacijom izazvanom sudarom (CID) sa m/z opsegom od 100–800 i energijom sudara u rasponu od 10 do 50V. Uzorci su direktno infundirani elektrosprejom sa protokom od 5,0 µL min-1. MS i MS/MS podaci su obrađeni softverom Xcalibur (verzija 3.0.63) koji je razvio Thermo Fisher Scientific.

BENEFIT CISTANCHE DODATAK: POBOLJŠAJTE IMUNITET

Odvajanje metabolita (HPLC analiza).

Separacije sekundarnih metabolita postignute su upotrebom Phenomenex kolone Luna 5µm fenil-heksil (25{{10}}×4,6 mm) i SHIMADZU prominentnog HPLC LC-20AT, opremljenog CBM{{6} }Modul komunikacione magistrale, detektor niza fotodioda SPD-M20A i SIL-20autosampler. Mobilna faza: voda (0,1 posto mravlje kiseline) (A) i acetonitril (B). Profil eluenta (A/B): 65/35 do 50/50 u roku od 50 min, do 40/60 u roku od 20 min. Ukupno vreme rada je 70 min, a protok od 1,0 ml min-1. Zapremina injekcije bila je 5µL. Preparativno HPLC prečišćavanje je izvedeno na Phenomenex koloni Luna 5µm fenil-heksil (250×10 mm) korišćenjem Waters 1525 binarne HPLC pumpe opremljene Waters 2998 fotodiodnim detektorom i Waters Fraction Collector III koristeći iste optimizovane uslove gradijenta. Brzina protoka je postavljena na 4,7 mLmin-1, a volumen ubrizgavanja je bio 200 µL.

NMR spektroskopija.

1H NMR, 13C NMR i 2D eksperimenti su izvedeni na Bruker Avance III 500 (1H 500.13MHz i 13C 125.7MHz) i Bruker Avance III 600 (1H 600.17MHz). Deuterirani hloroform (CDCl3; 7,23 ppm), dimetil sulfoksid (DMSO; 2,50 ppm i 39,51 ppm) i tetrametilsilan (TMS; 0,0 ppm) korišćeni su kao rastvarač i interna referenca. Hemijski pomaci (δ) izraženi su u (ppm), a konstante spajanja (J) u hercima (Hz).

Analiza molekularne mreže.

Molekularna mreža za metabolite P. citrinum stvorena je korištenjem online toka rada na Global Natural Products Social Molecular Networking (GNPS) (http://gnps.ucsd.edu). Podaci su filtrirani uklanjanjem svih MS/MS pikova unutar plus /−17 Da prekursora m/z. MS/MS spektri su filtrirani kroz prozor odabirom samo 6 gornjih pikova u plus /−50Da prozoru kroz cijeli spektar. Podaci su zatim grupirani sa MS-Clusterom sa tolerancijom roditeljske mase od 0.2 Da i tolerancijom jona MS/MS fragmenta od 0.2Da da bi se stvorili konsenzus spektri. Nadalje, konsenzusni spektri koji su sadržavali manje od 2 spektra su odbačeni. Zatim je kreirana mreža gdje su rubovi filtrirani kako bi imali kosinusni rezultat iznad 0.65 i više od 2 usklađena vrha. Daljnje ivice između dva čvora su zadržane u mreži samo ako se svaki od čvorova pojavio u 10 najsličnijih čvorova jedan drugog. Spektri u mreži su zatim pretraživani prema GNPS-ovim spektralnim bibliotekama. Spektri biblioteke su filtrirani na isti način kao i ulazni podaci. Sva podudaranja koja se čuvaju između spektra mreže i spektra biblioteke su morala imati rezultat iznad 0,5 i najmanje 5 usklađenih pikova.

Antifungalni testovi.

Osnovni rastvor ekstrakta ko-kulture je pripremljen u metanolu i dalje razblažen u PDA do koncentracije od 0.5mgmL-1. 15 mL dobijenog rastvora je sipano u Petrijevu posudu, nakon čega je usledila inokulacija 15 ul rastvora P. digitatum od 105 spora mL-1 na sredinu agar ploče. Urađen je i kontrolni test. Ploče su inkubirane u mraku na 25 stepeni 96h. Zaantifungalnitestovima, 2,5 mL PDA je dopunjeno sa 6, 9 i 10 (400 µgmL-1 ), i svaki rastvor je izliven u mikroploču 6-. 5ul 105 spora mL-1 rastvora P. digitatum je inokulisano na sredinu svake agar ploče. Negativne kontrole su izvedene u tri primjerka. Mikroploča je inkubirana u mraku na 25 stepeni 96h. Za određivanje minimalne inhibitorne koncentracije (MIC) jedinjenja 1 i 4, izveden je test razblaženja mikro bujona prema preporukama Instituta za kliničke i laboratorijske standarde (2008)24 uz nekoliko modifikacija. Osnovni rastvori 1 i 4, pripremljeni su u vodi (5 procenata metanola) i dalje razblaženi u YES medijumu u opsegu koncentracija od 600 µg mL-1 do 1 µg mL-1. 195 ul svakog rastvora je prebačeno u mikroploču 96-, nakon čega je usledila inokulacija od 5 ul 105 spora mL-1 rastvora P. digitatum. Testovi su napravljeni u duplikatu, a kontrole u tri primjerka. Itrakonazol (100 µgmL-1) je korišten kao pozitivna kontrola. Negativne kontrole su izvedene sa metanolom u DA. Mikroploče su inkubirane u mraku na 25 stepeni tokom 96 sati.

Konfokalna laserska skenirajuća mikroskopija.

Nakon perioda inkubacije, stakalca mikroskopa su uklonjena iz Petrijeve posude. Uzorci in vitro ko-kulture su obojeni Kongo crvenom (0.25% w/v u vodi) tokom 20 minuta i kratko isprani u destilovanoj vodi. Uzorci su analizirani Leica TCS SP5 mikroskopom. Ekscitacija je bila emisionom linijom od 543 nm He-Ne lasera, a sakupljena je svjetlost emitirana između 570 i 680 nm.

BENEFITCISTANCHE: POBOLJŠATI IMUNITET

Rezultati i diskusija

MSI otkriva potencijalne antimikotike u interakciji između P. digitatum i P. citrinum.

Za pregled novihantifungalnispojeva s potencijalom zaštite agruma i kontrole bolesti nakon berbe, primijenili smo strategiju ko-kulture koja uključuje P. digitatum i još jedan patogen citrusa, P. citrinum. Kokultura je strategija inspirirana prirodom u kojoj nadmetanje između mikroorganizama može izazvati proizvodnju novih metabolita. U prethodnom radu, kokultivacija između Trichophyton rubrum i Bionectria ochroleuca izazvala je proizvodnju novog sulfatiranog analoga PS-990, što sugerira da se ovo jedinjenje dalje sulfatira tokom gljivične interakcije26. Također, još jedan primjer jedinjenja izvedenog iz interakcije gljiva je izolovani tetrapeptid ciklo-(L-leucil-trans-4-hidroksi-L-prolil-D-leucil-trans-4-hidroksi-L-prolin) iz bujona kokulture Phomopsis sp. K38 i Alternaria sp. E33; ciklički tetrapeptid pokazao je umjerenu do visoku inhibitornu aktivnost protiv fitopatogenih gljiva u poređenju sa komercijalnim fungicidom triadimefonom27. Stoga su eksperimenti kokultivacije održiv pristup za pronalaženje spojeva koji mogu inhibirati glavne fitopatogene citrusa, posebno zelenu plijesan uzrokovanu P. digitatum.

U kokultivaciji obavljenoj u narandžastim (in vivo) i sintetičkim podlogama (in vitro) vizualno smo uočili inhibiciju rasta na velikim udaljenostima između P. citrinum i P. digitatum. U interakciji gljivica, tihi geni se mogu aktivirati i štetni metaboliti mogu biti defuzionirani od jednog partnera do drugog16,28. Tese-inducirani metaboliti obično su lokalizirani u zoni konfrontacije u čvrstim medijima ko-kultura16. Međutim, redovni pristupi koji se koriste za otkrivanje i razjašnjavanje metabolita kao što je masena spektrometrija spojena sa tečnom (LC-MS) ili gasnom (GC-MS) hromatografijom ne daju informacije o prostornoj distribuciji molekula.

Informacije o molekularnoj prostornoj distribuciji mogu se dobiti snimanjem masenom spektrometrijom (MSI), moćnim alatom koji generiše slike za svaki ion detektovan u masenom spektru16. Upotreba MSI-ja za razumijevanje mikrobnih sistema i njihovih sekundarnih metabolita nije nova i studije u kojima je ova tehnika uspješno primijenjena mogu se naći u literaturi30. Na primjer, MSI je primijenjen za istraživanje interakcije između Bacillus subtilis 3610 i Streptomyces coelicolor A3. DESI snimanje bakterijske kokulture otkrilo je 57 signala prostorno lokaliziranih na kolonijama bakterija, što je dovelo do identifikacije nekih sekundarnih metabolita kao što su surfaktin i plipastatin31. Nadalje, MSI analiza je također pokazala da S. coelicolor proizvodi određene sekundarne metabolite inhibirane u prisustvu B. subtilisa, otkrivajući interakciju između bakterija31.

Stoga, da bismo otkrili sekundarne metabolite uključene u interakciju između patogena citrusa, nanijeli smo DESI-MSI direktno na površinu agara za kokulturu, da bismo vizualizirali difuziju spojeva u zonu konfrontacije. MSI signali su dobijeni za jone [M plus H] plus pri m/z 519.1857, m/z 503.1908, m/z 475.1590, m/z 460.1960, m/z 459.1645, m/z 625.39, m/z 625.39 m/8. z 527.2862, m/z 511.2894 i m/z 448.2938 (slike S1–S10). Uočili smo da su svi pomenuti joni detektovani i koncentrisani u zoni konfrontacije između gljiva (slika 1). Ova jedinjenja mogu biti povezana sa interakcijom gljiva-gljivica i mogu biti potencijalno novi antimikrobni agensi. Jone na m/z 625, 609, 527, 511 i 448 proizvodi P. citrinum, dok se ioni na m/z 519, 503, 475, 460 i 459, činilo kao kontranapad P. digitatum , otkrivajući hemijski rat između ova dva patogena citrusa. Te joni detektovani in vitro kroz MSI analize su takođe detektovani u ekstraktima ko-kultura in vivo (slike S11-S20) koristeći pomorandže kao supstrat (slika 2).

Da bi se okarakterizirali metaboliti uključeni u interakciju, ekstrakt ko-kulture je dobijen iz eksperimenata kultivacije s povećanjem veličine i jedinjenja od interesa, otkrivena u početku MSI analizama, izolovana su preparativnom HPLC i okarakterizirana tandem masenom spektrometrijom i NMR analizom.

Kroz tačne mase dobijene DESI-MSI analizama (tabela 1), bilo je moguće potvrditi prisustvo indol alkaloida koje proizvodi P. digitatum. Joni [M plus H] plus na m/z 519.1857, m/z 503.1908, m/z 475.1590, m/z 460.1960 i m/z 459.1645 koji odgovaraju triptokvialaninu A (1), triptokvialaninu A (1), triptokvilaninu (1) 3), 15-dimetil-2-epi-fumikinazolin A (4) i deoksitriptokilanon (5) (hemijske strukture predstavljene na slici 3). Ovi spojevi su dio biosintetskog puta triptokilanina32 i prethodno su otkriveni tokom DESI-MSI analize narandži zaraženih bolešću zelene plijesni23. Spoj 1 je prijavljen kao glavni sekundarni metabolit koji proizvodi P. digitatum33. Ipak, brisanje tog gena, odgovornog za regulaciju biosinteze 1, pokazalo je da 1 nije uključen u patogenost P. digitatum protiv citrusa jer sposobnost infekcije mutanata nije promijenjena34. Tačna biološka uloga triptokilanina je još uvijek nepoznata34 i ova studija pruža novu biološku aktivnost triptokvijalanina uz učešće ovih alkaloida u gljivičnoj interakciji. MS/MS jona [M plus H] plus na m/z 625,3951 dao je fragmente na m/z 594,3533, 576,3427, 449,2430 i 431,2325 (slika S21), isti uzorak fragmentacije trinina A dobijen za 6ci u studiji koja je uključivala ko-kulturu između P. citrinum i Pseudoalteromonas sp. OT5919. Također, GNPS baza podataka sugerira da bi jon na m/z 625 mogao biti citrinin A. Te tandem maseni spektar dobijen za ovo jedinjenje dijeli pet zajedničkih fragmenata sa tandem masenim spektrom od 6 deponovanih u bazi podataka (Sl. S22). Osim toga, dijeli sličan MS/MS obrazac fragmentacije sa citrininom A o kojem su objavili Moree et al. (2014). Prijavljeno je da se citrinadini više proizvode u situacijama kokulture i koncentriraju u međukulturama, što sugerira odbrambeni odgovor P. citrinum protiv drugih mikroorganizama Analiza molekularnog umrežavanja izolovanih jedinjenja otkrila je da je još jedan citrinin uključen u kokulturu interakcija. Primetili smo da je jon na m/z 609, koji je inicijalno detektovan MSI analizom, grupisan u isti klaster jedinjenja 6 (m/z 625) (slika S23), što sugeriše da je ovo jedinjenje metabolit sličan citrininu. U analizi molekularnog umrežavanja, srodni metaboliti su grupirani u iste klastere jer imaju sličan MS/MS spektar.

Tačna masa dobijena za jon [M plus H] plus na m/z 609,4010 odgovara jedinjenju sa molekulskom formulom C35H53N4O5. Obrazac fragmentacije dao je fragmente na m/z 578,3583, 464,2905, 451,2586 i 433,2482 (dodatna slika S24). 1 H NMR i 1 H-1 H COZY spektri dobijeni za pročišćeni metabolit (slike S25–S26 i tabela S1) pokazuju slične signale sintetizovanog deoksicitrinadina A koje su objavili Bian et al. (2013)37. Te epoksidni karakterističan signal na δH 4.0 je odsutan u ovom derivatu, a signal za vinilni vodonik se mogao uočiti na δH 6.9, što ukazuje na nedostatak epoksidne grupe i prisustvo dvostruke veze u poređenju sa citrininom A37. Ovo je prvi put da se deoksicitrinadin A (7) navodi u literaturi kao sekundarni metabolit koji proizvodi mikroorganizam.

Tačne mase dobijene DESI-MSI za jone [M plus H] plus na m/z 527,2862 i 511,2894 ukazuju na spojeve sa elementarnim sastavom C28H38N4O6 i C28H38N4O5, respektivno. MS/MS je otkrio da ion na m/z 511 ima sličnu strukturu u poređenju sa m/z 527, osim zbog odsustva atoma kisika. Fragmentacija jona na m/z 527 dala je fragmente m/z 281, 247, 219, 182 i 120 (slika S27), dok je ion na m/z 511 dala do m/z 265, 247, 219, , i 120 (Sl. S30). Isti obrazac fragmentacije prijavljen je za sekvencu tetrapeptida Phe-Val-Val-Tyr (8) Penicillium canescens. Ipak, tetrapeptidi 8 i Phe-Val-Val-Phe (9) su nedavno prijavljeni kao sekundarni metaboliti koje proizvodi Penicillium roqueforti. 1 H i 13C NMR analize izolovanih jedinjenja (slike S28–S32 i tabele S2-S3) potvrdile su rezultate dobijene MS/MS, zaključujući da joni na m/z 527 i m/z 511 odgovaraju 8 i 9, respektivno. Proizvodnja ovih tetrapeptida u hemijskom ratu protiv gljivica nije iznenađujuća jer su mali peptidi poznati po svojoj antimikrobnoj aktivnosti40. Ovo je prvi izvještaj o 8 i 9 kao sekundarnim metabolitima P. citrinum. Za jon [M plus H] plus na m/z 448,2938, tačna masa je sugerirala jedinjenje s molekularnom formulom C28H38N3O2, istog sastava sekundarnog metabolita hrizogenamida A (10) (greška=-4,6 ppm). Jedinjenje 10 je izolovano i 1H i 13C NMR analize (slike S33–S34 i tabela S4) potvrdile su njegovu strukturu; to je prvi izvještaj da je krizogenamid A uključen u gljivičnu interakciju. Spoj 10 je prvi put prijavljen kao sekundarni metabolit Penicillium chrysogenum br. 005, endofitske gljive povezane s biljkomCistanche deserticola. Također, 10 je prijavljeno kao sekundarni metabolit soja P. citrinum42. Strukture metabolita koje proizvodi P. citrinum prikazane su na slici 4.

Antifungalni testovi.

Istražili smoantifungalniaktivnost metabolita proizvedenih u ko-kulturi i P. digitatum je inokuliran u agar podlozi koji sadrže ekstrakt kokulture. U poređenju sa kontrolom, uočili smo smanjenje od 67 procenata u radijalnom rastu P. digitatum (slika S35), što ukazuje da metaboliti uključeni u gljivičnu borbu imaju potencijal kao antifungalni agensi. Da bismo potvrdili ovu hipotezu, testirali smo izolovana jedinjenja i primetili da jedinjenja 6, 9 i 10 (400 µg mL-1) smanjuju 48 procenata, 41 procenat i 61 procenat radijalnog rasta P. digitatum, respektivno, u poređenju sa kontrolom (Sl. 5), potvrđujući antifungalnu aktivnost. Utvrđeno je da su citrinadini uključeni u odgovor P. citrinum na druge mikroorganizme u kokulturama, ali njihova biološka uloga u biološkom okruženju je do danas nepoznata19. Jedinjenje 6 je testirano na aktivnost anti-Buruli ulkusa na Mycobacterium ulcerans MN209, ali nije uočen interesantan MIC43; takođe, prijavljena je citotoksična aktivnost 6 protiv ćelija leukemije i karcinoma44. Naši rezultati su prvi izvještaj o antimikrobnoj aktivnosti citrinadina u literaturi i mogu pružiti prvi uvid u biološku ulogu ovih spojeva u gljivično-gljivičnim interakcijama. Osim toga, hrizogenamid A do sada nikada nije prijavljen kao antimikrobni agens. Spoj 10 je pokazao zaštitni efekat na neurocite protiv smrti ćelija izazvane oksidativnim stresom41, međutim, u literaturi nije prijavljena nikakva druga biološka aktivnost za 10. Antifungalni testovi primjenom D-Phe-L-Val-D-Val-L-Tyr otkrili su da ovaj tetrapeptid ima inhibitornu aktivnost protiv B. subtitles i fitopatogena soje Fusarium virguliforme38. Nasuprot tome, nema inhibicije E. coli, B. subtilis i S. cerevisiae u prisustvu D-Phe-L-Val-D-Val-L-Tyr ili D-Phe-L-Val-D-Val-L -Phe je primećen39. Antifungalna aktivnost triptokilanina je takođe procenjena jer se činilo da su ova jedinjenja hemijski odgovor P. digitatum protiv P. citrinum u hemijskom ratu. Testirani su triptokilanini 1 i 4 i otkrili su antifungalnu aktivnost protiv P. citrinum. Jedinjenja 1 i 4 su imala MIC od 300 µgmL-1, inhibirajući proizvodnju spora P. citrinum (slika S36). Koliko nam je poznato, ovo je prvi izvještaj o antimikrobnoj aktivnosti triptokilanina. Nedavno je demonstrirano 1 kao insekticidno jedinjenje protiv Ae. aegypti larvae23; antifungalna aktivnost može pružiti više razumijevanja o ulozi triptokilanina u okruženju patogena citrusa kada ova jedinjenja nisu potrebna za virulenciju P. digitatum.

BENEFITCISTANCHE: Antibakterijski

Hemijski rat mijenja ćelijski zid P. digitatum u zajedničkoj kulturi.

Istražiti djelovanje sekundarnih metabolita tokomgljivičneinterakcije, uzorci kokulture su obojeni Kongo crvenom bojom i posmatrani konfokalnom laserskom skenirajućom mikroskopom. Kongo crvena se obično koristi za bojenje polisaharida koji sadrže 1,4 veze kao, na primjer,gljivičnekomponenta ćelijskog zida hitin45,46. Hife P. digitatum su uočene u zoni sukoba (uzorak) i upoređene sa hifama udaljenim od područja interfejsa (kontrola) (Sl. S37). Kontrolne hife su bile homogeno obojene Kongo crvenom bojom, dok su hife u oblasti interfejsa pokazale izmenjeni obrazac bojenja (slika 6), sa nepravilnim mrljama. Slični obrasci bojenja su dobijeni za nokaut mutantne gljive kod kojih su izbrisani geni imali ulogu u organizaciji ćelijskog zida; kao rezultat toga, mutanti su pokazali defektne ćelijske zidove i nepravilno bojenje25,46,47. Ipak, uočeno je abnormalno bojenje sa Calcofluor White za P. ostreatus P89 tretiran sa 36 stepeni; visokom temperaturom izmijenjena distribucija hitina i integritet ćelijskog zida48. Ovi podaci pokazuju da P. digitatum hyphae, u kontaktu sa metabolitima difuznim tokom ko-kulture, imaju defektan ćelijski zid jer se Congo Red vezuje za strukture ćelijskog zida gljivica. Ćelijski zid gljivice je atraktivna meta antimikrobnih sredstava jer nisu prisutni u stanicama sisara49,50. U zaključku, mikroskopska analiza i antifungalni testovi potvrđuju da metaboliti uključeni u gljivičnu interakciju imaju potencijal kaoantifungalniagensi i može biti mehanizam u prirodi koji su ovi fitopatogeni razvili da se takmiče protiv drugih mikroorganizama za domaćina (slika 7).

Zaključci

Potraga za novim prirodnim antimikrobima je obećavajuće polje u istraživanju prirodnih proizvoda u vezi sa ekonomskim uticajem bolesti posle žetve na poljoprivredu širom sveta. Nadalje, pojava sojeva gljivica otpornih na fungicide čini otkriće novihantifungalniagensi koji zamjenjuju sintetička jedinjenja od izuzetnog značaja. Koristeći kokultivaciju između fitopatogena koji se takmiče za istog domaćina, P. digitatum i P. citrinum, uočili smo gljivičnu interakciju. Kroz MSI tehniku, detektovali smo sekundarne metabolite defuzionisane u zonu interfejsa između mikroorganizama. Triptokvijalanini, citrinadini, hirzogenamid A i tetrapeptidi su pokazali veliku antifungalnu aktivnost, potvrđujući da su kokulture i MSI tehnika dobra kombinacija u potrazi za novim prirodnim antimikrobima.

Do ovog datuma nije bilo informacija o interakciji između patogenih gljiva citrusa. Naši podaci su otkrili spojeve koji igraju ulogu u mikrobnoj ekologiji citrusa. Osim toga, pokazali smo da proučavani metaboliti imaju veliki potencijal kaoantifungalniagensi jer su ćelijski zidovi gljivica jedna od glavnih metaantifungalnispojeva. Treba dalje istražiti upotrebu identificiranih spojeva kao prirodnih antimikotika umjesto sintetičkih fungicida. Ovaj rad otvara nove istraživačke mogućnosti i doprinosi očuvanju životne sredine i zdravlja ljudi, pomažući u potrazi za sigurnijim strategijama za poljoprivredu upotrebom jedinjenja dobijenih iz prirodnih izvora.

BENEFITCISTANCHE DODATAK: POBOLJŠATI IMUNITET