1. DIO Učinci ekstrakta Cistanche Tubulosa nalik na antidepresive na pacove od kroničnog nepredvidivog stresa kroz obnavljanje homeostaze crijevne mikrobiote

Sve veći dokazi pokazuju da su neuropsihijatrijski poremećaji, kao što je depresija, povezani s crijevnim mikrobiomom preko osovine crijeva i mozga.Cistanches Herbaje dobro poznat po liječenju "bubreg-yang" nedostatka u tradicionalnoj kineskoj medicini (TCM) i koristi se za liječenje neurodegenerativnih bolesti posljednjih godina. U ovoj studiji uspostavljen je model depresije izazvane kroničnim nepredvidivim stresom (CUS) kako bi se istražio utjecajCistanche tubulosaekstrakt (CTE) na testovima ponašanja, monoaminskim neurotransmiterima i neurotrofnim faktorima u hipokampusu i debelom crijevu, sastavu crijevne mikrobiote i proizvodnji kratkolančanih masnih kiselina (SCFA). Štaviše, korelaciona analiza je korištena za procjenu funkcionalnog odnosa između izmijenjene crijevne mikrobiote, promijenjenih neurotransmitera i neurotrofina u hipokampusu i debelom crijevu, te poremećene koncentracije SCFA. CTE je značajno poboljšao ponašanje nalik depresiji kod pacova pod CUS-om. Nivo 5-hidroksitriptamina (5-HT) u mozgu i ekspresija neurotrofnog faktora (BDNF) u mozgu kod CUS pacova je obnovljena pomoću CTE. Relativna brojnost crijevne mikrobiote i koncentracije acetata i heksanoične kiseline također se mogu modulirati CTE tretmanom. Nadalje smo pokazali da je primjena CTE kod CUS pacova dovela do jake korelacije između poremećenog sastava crijevne mikrobiote, nivoa neurotransmitera hipokampusa i proizvodnje neuroaktivnih metabolita SCFA. Sveukupno, ovi rezultati identificiraju CTE kao potencijalni tretman za simptome depresije obnavljanjem homeostaze crijevne mikrobiote za poremećaje osovine mikrobiota-crijeva-mozak, otvarajući nove puteve u području neuropsihofarmakologije.

Ključne riječi: Cistanche tubulosa, antidepresiv, kronični nepredvidivi stres, crijevna mikrobiota, osa mikrobiota-crijeva-mozak

Za više informacija kontaktirajte:Joanna.jia@wecistanche.com

Cistanche deserticola ima mnogo efekata, kliknite ovde da saznate više

UVOD

Cistanches Herba(Rou Cong-Rong na kineskom) službeno je zabilježeno kao osušene sočne stabljikeCistanche deserticola(YC Ma) iCistanche tubulosa(Schrenk) u komisiji Kineske farmakopeje (2015). To je poznata tradicionalna kineska medicina (TCM) za liječenje nedostatka bubrega, impotencije, ženske neplodnosti, morbidne leukoreje, obilne metroragije,

Echinacosideu cistanche mogu promoviratizarastanje rana

i senilni zatvor (Kineska farmakopejska komisija, 2015.). Prethodne studije su otkrile nekoliko glavnih hemijskih sastojakaCistanches Herba, uključujući feniletanoidne glikozide (PhG), iridoide i iridoidne glikozide, lignane, alditole, oligosaharide i polisaharide. Farmakološka analiza je pokazala da Cistanches Herba ispoljava širok spektar neuroprotektivnih, imunomodulatornih, protuupalnih i hepatoprotektivnih aktivnosti (Jiang i Tu, 2009; Fu et al., 2017). PhGs se smatraju glavnim aktivnim komponentama Cistanches Herba koje posjeduju različite farmakološke aktivnosti, kao što su neuroprotektivne, imunomodulatorne, antiinflamatorne, hepatoprotektivne, antioksidativne, itd. (Jiang i Tu, 2009; Fu et al., 2017). Cistanches Herba izvorno je zabilježena u Klasici biljne medicine ("Shennong Bencao Jing" na kineskom), dobro poznatoj knjizi o ljekovitim biljkama napisanoj između 200. i 250. godine nove ere, kao "visoka biljka" koja može regulirati "pet (utrobe). ) naprezanja i sedam (prejedanje, ljutnja, vlaga, hladnoća, briga, vjetar i kiša i strah) oštećenja” (Huang, 1982). Danas je Cistanches Herba široko prihvaćen kao biljni tonik za opštu slabost (Fu et al., 2017).C. tubulosaglikozidne kapsule (Memoregain®) se koriste za liječenje Alchajmerove bolesti (Guo et al., 2013). Disfunkcionalni dopaminergički sistem je jedna od ključnih patogeneza monoaminske hipoteze depresije (Duman et al., 1997; Krishnan i Nestler, 2008). Utvrđeno je da ehinakozid (jedan od PhG) i PhG iz Cistanche salsa štite dopaminergičke neurone od neurotoksičnosti dopamina (DA) izazvane 1-metil-4-fenil-1,2,3,{ {8}}tetrahidropiridin (MPTP) koji može povećati nivoe DA u striatumu C57 miševa (Tian i Pu, 2005; Geng et al., 2007). Dodatno, katalpol i genipozid su dva reprezentativna iridoida u Cistanches Herba, i za njih je utvrđeno da poboljšavaju ponašanje nalik na depresiju uzrokovano kroničnim nepredvidivim stresom (CUS) kroz obnavljanje disfunkcija hipotalamus-hipofizno-nadbubrežne (HPA) osi, a katalpol može poboljšati regulaciju mozga. ekspresija izvedenog neurotrofnog faktora (BDNF) (Cai et al., 2015; Wang et al., 2015). Štoviše, najnovija publikacija daje dio svježeg dokaza da je dekocija Cistanches Herba značajno smanjila period nepokretnosti u testu suspenzije repa miša, što snažno sugerira da Cistanches Herba posjeduje potencijalne kvalitete poput antidepresiva (WangD. et al., 2017).

Tradicionalna kineska medicina privlači sve veću pažnju kao tretman depresije zbog svojih relativno umjerenih nuspojava (Sarris et al., 2011; Feng et al., 2016). Različite vrste TCM, kao što su pojedinačna jedinjenja iz sirovih droga (ginsenoside Rb1, ginsenoside Rg3 i Yuanzhi-1) (Jin et al., 2015.; Kang et al., 2017.; Wang GL et al., 2017. ), pojedinačni kineski medicinski materijal (korijen ginsenga Panax, rizom Acorus tatarinowii i Morinda Officinalis) (Dang et al., 2009; Han et al., 2013; Xu et al., 2016) i TCM dekocije (Kai-Xin- San, Chaihu-Shu-Gan-San, Xiaoyaosan i Xiaochaihutang) (Dai et al., 2010; Su et al., 2011; Su et al., 2014; Yan et al., 2016) su duboko proučavani i prikazani za poništavanje ili ublažavanje simptoma sličnih depresiji. Na primjer, utvrđeno je da Kai-Xin-San značajno ublažava simptome depresivnih pacova izazvanih CUS povećanjem broja neurotransmitera, neurotrofnih faktora i njihovih odgovarajućih receptora, te promicanjem ekspresije sinaptotagmina i dendritske gustine kralježnice (Yan et al. , 2016).

Ipak, prethodne studije TCM oslanjaju se na rezultate testova ponašanja sličnih depresivima i fokusiraju se na konvencionalni farmakološki mehanizam djelovanja. Veza između antidepresivne efikasnosti oralno primijenjenog TCM-a i crijevne mikrobiote nije dobro shvaćena. Sve veći dokazi potvrđuju da mikrobiota crijeva igra ključnu ulogu u regulaciji moždanih funkcija, posebno depresije i drugih poremećaja povezanih sa stresom (Foster i Neufeld, 2013; Sherwin et al., 2017). Na primjer, kronični stres dovodi do disregulacije mikrobne strukture crijeva štakora, sa smanjenjem omjera Firmicutes/Bacteroidetes, i preciznije, smanjenjem relativne zastupljenosti Lactobacillus i povećanjem Oscillibacter (Meng et al., 2017). Nadalje, fekalna transplantacija neregulirane mikrobiote s depresivnih pacijenata na miševe bez klica donijela je fenotip sličan depresiji kod ovih životinja, što ukazuje da neregulirana crijevna mikrobiota uzrokuje bihevioralne i fiziološke simptome depresije i anksioznosti (Kelly et al., 2016; Zheng et al. ., 2016.). U eksperimentima na životinjama, utvrđeno je da neki modulatori mikrobiote kao što su probiotici i prebiotici poboljšavaju ponašanje slično depresiji kod miševa pod kroničnom stresom poboljšavajući mikrobiotu crijeva (Bravo et al., 2011.; Bharwani et al., 2017.; Burokas et al., 2017. ).

S obzirom na povezanost između crijevne mikrobiote i razvoja bolesti, kao i plastičnosti strukture crijevne mikrobiote, odlučili smo istražiti učinke crijevne mikrobiote na posredovanje depresije koji su privukli našu pažnju i bili istraženi (Chang et al., 2017; Xu et al. ., 2017.). Da bi se to postiglo, 16S rRNA gen sekvencioniranjem je izvršena kombinovana analiza Meta stats (White et al., 2009) kako bi se analizirao sastav crijevne mikrobiote. U ovoj studiji,C. tubulosaje odabran za procjenu njegovih efekata sličnih antidepresivima jer ima viši nivo PhG u poređenju saC. deserticola. Ustanovljen je model depresije izazvane CUS-om kod pacova kako bi se istražio utjecajEkstrakt C. tubulosa(CTE, koji se sastoji od 48,6 posto PhGs, 6,9 posto iridoidnih glikozida i 20,0 posto ukupnih saharida) na testovima ponašanja, monoaminskim neurotransmiterima i neurotrofnim faktorima u hipokampusu i debelom crijevu, sastavu crijevne mikrobiote i kratkom lancu proizvodnja masnih kiselina (SCFA). Štoviše, proučavan je funkcionalni odnos između izmijenjene crijevne mikrobiote promijenjenih neurotransmitera i neurotrofina u hipokampusu i debelom crijevu, te je proučavana poremećena koncentracija SCFA. Korelaciona analiza je korištena da potkrijepi dokaze da CTE cilja na crijevnu mikrobiotu za liječenje depresije modulacijom osi mikrobiota-crijeva-mozak.

MATERIJALI I METODE

Materijali

Fluoksetin (FLX) je kupljen od Aladdin Industrial Inc. (Šangaj, Kina). 5-hidroksitriptamin (5-HT), norepinefrin (NE) i BDNF ELISA kompleti su kupljeni od Nanjing Jiancheng Bioinženjering Instituta (Nanjing, Kina). HPLC acetonitril je nabavljen od Mercka (Darmstadt, Njemačka). Dejonizovana voda je pripremljena od destilovane vode korišćenjem Milli-Q sistema za prečišćavanje vode (Millipore, Bedford, MA, Sjedinjene Američke Države). Svi ostali korišćeni reagensi i hemikalije su bile analitičke čistoće.

Osušene stabljikeC. tubulosaprikupljeni su iz okruga Hetian (Xinjiang, Kina). Uzorke vaučera je potvrdio prof. Xiaobo Li i deponovao ih je u herbarijum Farmaceutskog fakulteta Univerziteta Jiao Tong u Šangaju (Šangaj, Kina). Homogeni prahC. tubulosastabljike su suspendovane deset puta u 70-postotnom etanolu i refluksovane tri puta, svaki po 1 h na 100 stepeni. Ekstrakti su filtrirani pomoću gaze, upareni pod vakuumom na 65 stepeni i liofilizovani. Uzorak je ponovo otopljen i zatim odvojen makroporoznom smolom D101. Nakon adsorpcije, frakcija eluirana vodom je odbačena. CTE je dobijen nakon eluiranja sa 40 posto etanola, zatim uparen pod vakuumom na 65 stepeni i liofiliziran.

Analiza hemijskog sastava CTE

Relativni sadržaj PhGs u CTE određen je UV spektrofotometrijom na 330 nm koristeći ehinakozid kao standard. Relativni sadržaj iridoida i iridoidnih glikozida mjeren je UV spektrofotometrijom metodom dvostruke valne dužine kako bi se izbjegla spektralna interferencija od PhGs (237 nm je korišteno za spektroskopsku kvantifikaciju, izosbestična tačka 280 nm korištena je za referentnu valnu dužinu), genipo kao standard. Ukupni sadržaj ugljikohidrata u CTE određen je kolorimetrijskom metodom fenol-sumporne kiseline sa glukozom kao standardom (Chow i Landhausser, 2004).

Glavne hemijske sastojke CTE karakteriše UPLC-Q-TOF-MS. UPLC-Q-TOF-MS analiza je izvedena na Waters ACQUITY UPLC sistemu (Waters Corp., Milford, MA, Sjedinjene Države) sa ACQUITY UPLC BEH C18 kolonom (100 mm x 2,1 mm id, 1,7 段m, Waters Corp., Sjedinjene Američke Države) gradijentom eluiranja koristeći 0.1 posto acetonitrila mravlje kiseline (A) i 0.1 posto mravlje kiseline u vodi (B) na protok od 0,4 ml/min. Profil gradijenta je bio: 0-5 min (A: 5-20 procenat ), 5-7.5 min (A: 20-30 procenat ), 7.5-10 min ( A: 30-70 posto ), 10-11 min (A: 70-100 posto ), i držano 1,5 min. Gradijent je vraćen na 5 posto za 0,5 min i zadržan 2,5 min za sljedeću vožnju. Zapremina injekcije bila je 3 [il. Temperatura peći je postavljena na 35 stepeni.

Masena spektrometrija je izvedena korištenjem Waters Vion IMS masenog spektrometra (Waters Corp., Milford, MA, Sjedinjene Države). Ionizacija je izvedena u načinu negativnog elektrosprej (ESI). MS parametri su bili sljedeći: kapilarni napon 2.0 kV; napon konusa, 20 V; temperatura izvora, 120 stepeni ; temperatura desolvatacije, 500 stepeni ; protoci gasa konusa i desolvatacije, 50 i 1,000 L/h, respektivno. Za precizno merenje mase, leucin-enkefalin je korišćen kao ključna masa za generisanje [MH]-jona (m/z 554.2615). Eksperiment MSE (Mass SpectrometryElevatedEnergy) u dvije funkcije skeniranja izveden je kako slijedi: funkcija 1 (niska energija): m/z 50-1,000, vrijeme skeniranja 0,25 s, kašnjenje između skeniranja 0,02 s , 6 eV energija sudara; funkcija 2 (visoka energija): m/z 50-1,000, vrijeme skeniranja 0,25 s, kašnjenje između skeniranja 0,02 s, rampa energije sudara od 20-45 eV. Podaci su obrađeni pomoću softvera UNIFI 1.8.1 (Waters Corp., Milford, MA, Sjedinjene Američke Države).

cistanchemogupoboljšati funkciju bubrega

Eksperimenti na životinjama

Mužjaci Sprague-Dawley pacova (200 土 20 g) nabavljeni su od Beijing Vital River Laboratory Animal Technology Company (Peking, Kina) i smješteni u Centru za laboratorijske životinje Šangajskog univerziteta Jiao Tong (Šangaj, Kina). Životinje su bile smještene u grupama pod kontroliranom sobnom temperaturom (25°C 2 stepena, 55°C 10% relativne vlažnosti) sa ciklusom od 12:12 h svjetlo-mrak. Pacovima je omogućen slobodan pristup redovnoj hrani i vodi za laboratorijske pacove u trajanju od 1 sedmice. Objekti i protokoli za životinje odobreni su od strane Komiteta za etiku životinja Šangajskog univerziteta Jiao Tong (Šangaj, Kina).

Nakon 1 sedmice aklimatizacije, 40 naivnih pacova podvrgnuto je periodu od 72 sata treninga za saharozu i osnovnog testiranja saharoze. Štakori su podijeljeni u pet grupa (n=8) na osnovu njihove preferencije za saharozu u osnovnom testu saharoze (dodatna slika S1). Kontrolnoj grupi i CUS grupi davan je fiziološki rastvor (10 ml/kg). Za ostale tri grupe, CTE u visokoj dozi (CTEH) (400 mg/kg), niskoj dozi (CTEL) (200 mg/kg) i FLX (10 mg/kg) su davani intragastrično 1 h pre CUS procedure (8:00 do 9:00) tokom 4 nedelje.

Hronični nepredvidivi stres je razvijen kako je prethodno opisano (Willner, 1997; Xue et al., 2013), osim za kontrolnu grupu bez stresa, na štakore je primijenjen niz stresora: stroboskopsko osvjetljenje niskog intenziteta preko noći (120 bljeskova/ min), bijeli šum (100 dB) 1 h, uskraćivanje vode 24 h, prazne boce vode 1 h (nakon lišenja vode), uskraćivanje hrane 24 h, prisilno plivanje (5 min), fizičko sputavanje ({{11 }} h), zaprljani kavez 24 h (200 ml vode u 100 g podloge piljevine), štipanje repa (1 min), nagib kaveza od 45 stepeni 24 h, šok 30 min i osvjetljenje preko noći (12 h). Stresori su primjenjivani kontinuirano i nasumično tokom 4 sedmice, detalji o tome su opisani u Dodatnoj tabeli S1. Kontrolnim pacovima koji nisu bili pod stresom, hrana i voda su bili slobodno dostupni, koji su ostali neometani u drugoj prostoriji, izuzev perioda od 14 sati prije svakog testa na saharozu. Jedan pacov je uginuo tokom CUS procedure. Nakon toga je izvršen test prisilnog plivanja (FST).

4 dana akutne primjene i nakon 28 dana stresa, urađeni su test preferencije saharoze (SPT) (29. dan), test na otvorenom polju (OFT) (31. dan) i test hranjenja potisnutim novostima (NSFT) (33. dan). Nacrt dizajna za CUS i testove ponašanja prikazan je na dodatnoj slici S2.

Test prisilnog plivanja je izveden kao što je prethodno opisano (Porsolt et al., 1978). Procedura se sastojala od predtestiranja i testa, uz korištenje istih aparata i uslova (prečnik 20 cm, visina 45 cm, sadržavanje 25 cm vode održavane na 26 stepeni). Tokom predtestiranja, pacovi su bili prisiljeni da plivaju 15 minuta; 24 h kasnije, pacovi su stavljeni u isti aparat na 5 min test plivanja. Ponašanje plivanja iznutra

Video kamerom je promatrano 5 min, a izmjereno je i analizirano trajanje nepokretnosti.

Za SPT, pacovi su prvo obučeni da konzumiraju 1 posto (v/v) rastvor saharoze 72 sata prije SPT. Osnovni test saharoze prije CUS procedure i SPT na kraju CUS-a izvedeni su kako je prethodno opisano (Xue et al., 2013).

Test na otvorenom polju obavljen je na kraju CUS procedure, aparatura i metoda su isti kao i prethodno detaljno (Xue et al., 2013). Sistem za video praćenje (Shanghai Mobile Datum Information Technology Co., Ltd.) korišten je za snimanje ukupne pređene udaljenosti.

Test hranjenja s potisnutim novostima je procijenjen kao što je prethodno opisano (Xue et al., 2013.) i latencija za početak jela u roku od 5 minuta je zabilježena i analizirana.

Mjerenje neurotransmitera i neurotrofnih faktora

Nakon testova ponašanja, najmanje četiri fekalne pelete su dobijene od svakog štakora, stavljene u sterilne konične epruvete i odmah zamrznute na -80°C za analizu mikrobne zajednice i SCFA. Nakon toga, pacovi su žrtvovani; hipokampus i debelo crevo su izolovani i odmah izmereni. Uzorci tkiva su isprani fiziološkim rastvorom, brzo zamrznuti u tečnom azotu i čuvani na -80°C za skladištenje. Nakon sekvencijalnog odmrzavanja na -20°C i 4°C, uzorci tkiva su homogenizovani u fiziološkom rastvoru i centrifugirani 25 minuta na 2500 o/min/4°C. Dobijeni supernatant je sakupljen i pohranjen na 4°C do upotrebe. Nivoi 5-HT u hipokampusu i debelom crijevu, NE u hipokampusu i BDNF u hipokampusu određeni su komercijalnim ELISA setovima prema protokolima proizvođača (Hou et al., 2017).

Analiza kompozicionog profila crijevne mikrobiote

Ukupna DNK crijevne mikrobiote iz fekalnih uzoraka je ekstrahirana kako je prethodno opisano (Wei et al., 20{{20}}4). Svaki fekalni uzorak (0.2 g) pomiješan je u 1 ml PBS-a i dva puta potpuno homogeniziran, a zatim centrifugiran na 200 g tokom 6 minuta. Supernatantu je dodan 20 ± 20 posto PVP-a i centrifugiran na 300 g 6 min. Dobijeni supernatant je zatim centrifugiran na 12,000 g tokom 6 minuta i ćelijske pelete su sakupljene. Ćelijske pelete su isprane PBS-om, a zatim resuspendirane u 300 lizata I (150 mM NaCl, 100 mM EDTA・Na2・2H2., pH 8,0). Suspenzija je pomešana sa 100 μl rastvora lizozima (100 mg/ml) i 20 μl 1% RNaze, 37°C u toplom kupatilu tokom 30 minuta, zatim je dodato 300 μl lizata II (100 mM NaCl, 500 mM tris0 baze). . Suspenzija ćelija je nježno pomiješana sa 50 ± 20 posto SDS, kupana u ledu 5 minuta. DNK je zatim pročišćena sekvencijalnom ekstrakcijom sa 1 posto PVP-a, tris-ekvilibriranim fenolom i hloroform-izoamil alkoholom (vol/vol/vol/vol, 3.125:25:24:1) i hloroform-izoamil alkoholom (vol/vol, 24 :1) praćeno taloženjem na -20°C tokom 2 h sa dve zapremine etanola i 50 [il 3 M NaAc. DNK je sakupljena centrifugiranjem, osušena na vazduhu i rastvorena u 100 l sterilne dejonizovane vode. Čistoća nukleinske kiseline je testirana pomoću NanoDrop 2000c spektrofotometra (Thermo Fisher Scientific, Waltham, MA, Sjedinjene Države). Ukupna genomska DNK je zatim podvrgnuta PCR amplifikaciji korištenjem prajmera specifičnih za V3-V4 regije gena 16S rRNA: naprijed prajmer 338F (5'-ACTCCTACGGGAGGCAGCA-3') i reverzni prajmer 806R (5 '-GGACTACHVGGGTWTCTAAT- 3'). PCR amplikoni su pročišćeni Agencourt AMPure kuglicama (Beckman Coulter, Indianapolis, IN, Sjedinjene Države) i kvantificirani pomoću PicoGreen dsDNA Assay Kit (Invitrogen, Carlsbad, CA, Sjedinjene Države). Nakon koraka individualne kvantifikacije, amplikoni su objedinjeni u jednakim količinama, a sekvenciranje na kraju para 2 x 300 bp je izvedeno pomoću Illumina MiSeq platforme sa MiSeq Reagent Kit v3 u Shanghai Personal Biotechnology Co., Ltd (Šangaj, Kina). Čitanja uparenih krajeva sastavljena su korištenjem FLASH softvera (verzija 1.2.7), očitanja sirovih sekvenci su kvalitetno skraćena korištenjem QIIME softvera (verzija 1.8.0) kako bi se uklonili neusklađeni barkodovi i sekvence ispod praga dužine. Nakon toga, filtrirane sekvence su grupirane u operativne taksonomske jedinice (OTU) s pragom od 97 posto sličnosti sekvence korištenjem QIIME sa UCLUST-om. Beta raznovrsnost je izvedena na QIIME za ponderisanu UniFrac analizu glavnih koordinata (PCoA). Konačno, softver Meta stats korišten je za upoređivanje razlika u taksonomskom sastavu crijevnih mikroba među različitim grupama.

Analiza koncentracije SCFA

Koncentracija SCFA (uključujući acetat, propionat, butirat, izobutirat, valerinsku kiselinu, izovalerinsku kiselinu i heksanoičnu kiselinu) u uzorcima fekalija pacova određena je plinskim hromatografom GC{{0}} (Shimadzu, Japan), ugrađenim sa DB-FFAP kolonom (30 mx 0.25 mm x {{10}}.25 cm, Agilent, Sjedinjene Države). Standardne otopine acetata, propionata, butirata, izobutirata, valerinske kiseline, izovalerinske kiseline i heksanske kiseline pripremljene su na 1, 0.4, 0.2, 0.1, {{ 21}}.05, 0.01 i 0,005 mg/ml sa etrom (uključujući 2- metil valerinsku kiselinu 0,1 mg/ml kao interni standard), respektivno. Svaki fekalni uzorak (0,2 g) pomiješan je u 0,8 ml dejonizirane vode vorteksiranjem i centrifugiranjem na 5,{28}} o/min 20 minuta na 4°C, dodano je 450 l supernatanta sa 50 il 50 posto H2SO4 i 500 il internog standarda rastvora, vorteksiranje 1 min i centrifugiranje na 12,000 o/min 10 min, zatim je smjesa stavljena na 4OC 30 min. Supernatant je uzet za GC analizu. Analiza SCFA je provedena kako je prethodno opisano (Wang et al., 2016).

Statistička analiza

Svi podaci su predstavljeni kao sredstva 土 SEM. Statistička analiza je izvršena korištenjem softvera SPSS 21.0 (SPSS Inc., Chicago, IL, Sjedinjene Američke Države) sa jednosmjernom ANOVA-om praćenom Dunnettovim testom ili Studentovim t-testom. Podaci su isključeni iz analize ako su veći od dvije standardne devijacije od srednje vrijednosti. Vrijednosti p < 0.05="" smatraju="" se="" statistički="" značajnim.="" pearsonova="" korelaciona="" analiza="" je="" korištena="" za="" procjenu="" povezanosti="" između="" relativne="" količine="" crijevne="" mikrobiote,="" scfa,="" hipokampusa="" 5-ht,="" ne="" i="" bdnf="" nivoa="" i="" 5-ht="">

REZULTATI

Analiza hemijskog sastava CTE

Prvo je sveobuhvatno analiziran hemijski sastav CTE. Kao što je prikazano u Tabeli 1, PhG su bili glavna komponenta CTE, sa relativnim sadržajem od 48,6 posto, iridoidi i iridoidni glikozidi su bili 6,9 posto, a ukupni saharidi su bili 20,0 posto. Ove

komponente CTE su zatim karakterizirane korištenjem UPLC-Q-TOF-MS. Ukupno je otkriveno i identificirano 27 sastojaka, uključujući 20 sastojaka PhG, pet iridoida i iridoidnih glikozida, te dva oligosaharida. Detaljne informacije, uključujući vrijeme zadržavanja, tačan MS i MS/MS fragmentne jone navedene su u pratećim informacijama (dodatna tabela S2). UPLC-Q-TOF-MS ukupni ionski hromatogram (TIC) CTE prikazan je na dodatnoj slici S3.

CTE je poboljšao depresivno ponašanje kod CUS pacova

Kod CUS pacova, ukupno vrijeme nepokretnosti u FST-u i latencija za jelo u NSFT-u su značajno smanjeni CTE tretmanom, a preferencija saharoze u SPT-u i ukupna pređena udaljenost u OFT-u su povećani.

Slika 1A ilustruje akutne efekte CTE na vreme nepokretnosti u FST kod CUS pacova. U poređenju sa grupom modela CUS, akutna oralna primjena CTE od 3- dana značajno je smanjila ukupno vrijeme nepokretnosti u FST [jednosmjerna ANOVA, F(3,26)=4.983, p {{7} }.007]. Dalja posthoc analiza je otkrila da je administracija

TABELA 1|hemijski sastavC. tubulosaekstrakt CTE sa grupom visoke doze (Dunnettov test, p < {{0}}}.05) i grupom sa niskim dozama (Dunnettov test, p < 0,05) pokazao je značajno smanjenje ukupnog vremena nepokretnosti u FST-u .

Efekti CTE na preferenciju saharoze u SPT kod CUS pacova prikazani su na slici 1B. Dvadesetosmodnevna stresna procedura izazvala je značajno smanjenje preferencije saharoze u grupi CUS modela u poređenju sa kontrolnim štakorima bez stresa [jednosmjerna ANOVA, F(4,34)=3.993, p {{8 }}.{{10}09; Dunnettov test, p < 0,05],="" što="" ukazuje="" da="" je="" cus="" model="" uspješno="" razvijen.="" kao="" pozitivna="" kontrola,="" flx="" grupa="" je="" značajno="" povećala="" preferenciju="" saharoze="" kod="" pacova="" cus="" [jednosmjerna="" anova,="" f(4,34)="3.993," p="0.009;" dunnettov="" test,="" p="">< 0,05],="" koji="" pokazuje="" prediktivnu="" valjanost="" cus="" modela.="" hronična="" oralna="" primjena="" cte="" u="" grupi="" sa="" visokim="" dozama="" pokazala="" je="" ključne="" efekte="" na="" preferenciju="" saharoze="" [jednosmjerna="" anova,="" f(4,34)="3.993,p=0.009;" dunnettov="" test,="" p="">< 0,01],="" koji="" ga="" je="" vratio="" na="" normalne="" nivoe="" kod="" cus="" pacova.="" cte="" sa="" grupom="" sa="" niskim="" dozama="" pokazao="" je="" trend="" rasta,="" ali="" efekat="" nije="" bio="" statistički="" značajan="" (dunnettov="" test,="" p="">

Kao što je prikazano na slici 1C, ukupna udaljenost pređena u OFT-u je također korištena za procjenu efekata CTE na CUS pacove. U poređenju sa pacovima bez stresa, CUS grupa modela je pokazala mnogo kraću ukupnu udaljenost [jednosmjerna ANOVA, F(4,34)=7.845, p=0.0{{ 19}01; Dunnettov test, p < 0.001]="" nakon="" 4-sedmičnog="" izlaganja="" cus-u,="" i="" pozitivna="" kontrola="" flx="" tretmana="" povećala="" je="" ukupnu="" udaljenost="" kod="" cus="" štakora="" [jednosmjerna="" anova,="" f(4,34)="7.845," p="0.0001;" dunnettov="" test,="" p="">< 0,05].="" dnevna="" oralna="" primjena="" cte="" sa="" visokim="" dozama="" i="" niskom="" dozom="" pokazala="" je="" evidentan="" efekat="" na="" ukupnu="" udaljenost="" kod="" cus="" štakora="" [jednosmjerna="" anova,="" f(4,34)="7.845," p="0.0001" ;="" dunnettov="" test,="" p="">< 0,01="" za="" grupu="" sa="" visokim="" dozama,="" p="">< 0,001="" za="" grupu="" sa="" niskim="" dozama,="" respektivno].="" dodatna="" slika="" s4="" prikazuje="" mapu="" traga="" aktivnosti="" u="">

Slika 1D prikazuje efekte CTE na latenciju za jelo u NSFT kod CUS pacova. Procedura stresa od dvadeset osam dana izazvala je značajno povećanje latencije za početak jela u grupi CUS modela u poređenju sa kontrolnim štakorima bez stresa [jednosmjerna ANOVA, F(4,33)=3.434, p { {8}}.{{10}}19; Dunnettov test, p < 0,05],="" što="" ukazuje="" da="" je="" cus="" model="" uspješno="" razvijen.="" dugotrajna="" oralna="" primjena="" cte="" sa="" visokom="" dozom="" pokazala="" je="" evidentne="" efekte="" na="" latenciju="" za="" početak="" jela="" u="" poređenju="" sa="" cus="" grupom="" (studentov="" t-test,="" t="2.759," p="">< 0,05),="" dok="" je="" niska="" doza="" cte="" pokazala="" nema="">

CTE je vratio nivo neurotransmitera i neurotrofnih faktora kod CUS štakora

Efekti CTE na {{{{10}}}HT i NE nivoe u hipokampusu CUS pacova prikazani su na slikama 2A,B. Četiri sedmice stresne procedure izazvale su značajno smanjenje 5-HT [jednosmjerna ANOVA, F(4,34)=17.13, p=0.0{{39 }}01; Dunnettov test, p < 0.001]="" i="" ne="" [jednosmjerna="" anova,="" f(4,34)="6.376,p=0.0006;" dunnettov="" test,="" p="">< 0,001]="" koncentracija="" u="" hipokampusu="" cus="" štakora="" u="" poređenju="" sa="" onom="" u="" kontrolnoj="" grupi,="" i="" antidepresiv="" flx="" značajno="" je="" obnovio="" 5-ht="" nivoe="" u="" hipokampusu="" [jednosmjerna="" anova,="" f(4,34)="" {="" {25}}.13,="" p="0.0001;" dunnettov="" test,="" p="">< 0,001].="" nakon="" oralne="" primjene="" cte="" u="" grupi="" sa="" visokim="" dozama,="" uočeno="" je="" značajno="" povećanje="" 5-ht="" nivoa="" [jednosmjerna="" anova,="" f(4,34)="17.13," p="0.0001" ;="" dunnettov="" test,="" p="">< 0,001]="" dok="" koncentracije="" ne="" nisu="" promijenjene.="" slično,="" ekspresija="" bdnf="" je="" značajno="" smanjena="" u="" grupi="" cus="" modela="" u="" poređenju="" sa="" pacovima="" bez="" stresa="" (studentov="" t-test,="" t="4.171," p="">< 0.01)="" (slika="" 2c).="" i="" dugotrajna="" oralna="" primjena="" cte="" sa="" visokom="" dozom="" (studentov="" t-test,="" t="2.548," p="">< 0.05)="" i="" flx="" (studentov="" t-test,="" t="2.263," p="">< 0.05="" )="" povećana="" ekspresija="" bdnf="" u="" poređenju="" sa="" grupom="" modela="" cus.="" cte="" sa="" niskom="" dozom="" nije="" pokazao="" značajan="" uticaj="" na="" ekspresiju="">

{{0}}Nivo HT u debelom crijevu CUS štakora bio je drugačiji od onog u hipokampusu, a 4-sedmična procedura stresa nije imala utjecaja na 5-HT debelog crijeva (Slika 2D ). Suprotno tome, oralna primjena CTE sa visokom dozom stimulira nivoe 5-HT u debelom crijevu u poređenju sa grupom modela CUS (Studentov t-test, t=2.173, p < 0,05).="" cte="" sa="" niskom="" dozom="" nije="" pokazao="" nikakav="" uticaj="" na="" 5-ht="" nivo="" debelog="">

CTE je regulirao mikrobni sastav crijeva CUS pacova

Učinak CTE na mikrobiološki sastav crijeva CUS pacova procijenjen je metodom sekvenciranja gena 16S rRNA. Utvrđeno je da je 28 dana oralne primjene CTE promijenilo mikrobiološki sastav crijeva CUS štakora i utjecalo na različite

taksonomski nivoi mikroba među grupama pacova (nivo klase 1, nivo reda 1, nivo porodice 1, nivo roda 8 i nivo vrste 2). Ovo sugerira da bi mikrobna zajednica crijeva mogla igrati ulogu u antidepresivnim efektima CTE. Detaljne informacije o značajno izmijenjenim taksonima crijevnih mikroba na različitim taksonomskim razinama prikazane su u Tabeli 2.

MiSeq sekvenciranje je dalo ukupno 2.132.980 sirovih čitanja, nakon kontrole kvaliteta, uklanjanja šuma i procesa uklanjanja himere. Zatim, očitanja su grupirana u OTU, koji su dodijeljeni taksonima od tipa do nivoa vrste. Studija analize beta raznolikosti je provedena kako bi se istražila sličnost obrazaca bakterijske zajednice među pet grupa pacova. PCoA baziran na ponderisanim UniFrac udaljenostima crijevne mikrobiote iz pet studijskih grupa pacova prikazan je na slici 3A. Analiza beta diverziteta pomoću PCoA pokazala je jasno odvajanje mikrobne zajednice od kontrolne grupe i grupe CUS modela, dok je grupa CTE sa visokom dozom imala tendenciju da bude bliža kontrolnoj grupi u poređenju sa grupom CUS.

Metastatic analysis was used to investigate the differences in gut microbial taxonomic composition among different groups. At the phylum level, the most dominant microbial taxa in the five rat groups were Firmicutes and Bacteroidetes (Figure 3B). Lactobacillus, Ruminococcus, Blautia, Bacteroides, and Prevotella were the most highly abundant microbial taxa at the genus level (Figure 3C). The two dominant phyla, Firmicutes and Bacteroidetes, accounted for a combined relative abundance of >90 posto. Kao što je prikazano na dodatnim slikama S5A, B, 4-nedeljna stresna procedura izazvala je neznatan trend prema povećanom nivou Firmicutes i neznačajnom smanjenju Bacteroidetes u grupi CUS modela u poređenju sa kontrolnom grupom. Nakon svakodnevne primjene CTE s visokim dozama i malim dozama, relativna zastupljenost Firmicutes i Bacteroidetes vratila se na slične nivoe u kontrolnoj grupi, ali bez statističke značajnosti. I iako su slične promjene uočene za omjer Firmicutes/Bacteroidetes među grupama pacova, nisu prikazane statističke razlike (dodatna slika S5C). Neznačajan trend prema smanjenom nivou phyla Cyanobacteria pronađen je u grupi CUS modela u poređenju sa kontrolnim pacovima bez stresa; dok je primjena CTE s visokom dozom rezultirala značajnim povećanjem relativne zastupljenosti cijanobakterija u usporedbi s CUS grupom (dodatna slika S5D).

Na nivou roda, Bacteroides i Ruminococcus su bile dvije od najzastupljenijih mikrobnih taksona koje su činile približno 30 posto relativnog obilja u svih pet grupa pacova. Četiri sedmice stresne procedure uzrokovale su značajno smanjenje relativne zastupljenosti Bacteroides i značajno povećanje Ruminokoka u grupi CUS modela u poređenju sa kontrolnim pacovima bez stresa (Slike 4A, B). Dugotrajna primjena CTE-a rezultirala je značajnim povećanjem brojnosti Bacteroides, kao i značajnim smanjenjem Ruminokoka u poređenju sa CUS štakorima. Dodatno, šest rodova Parabacteroides, Butyricimonas, Deinococcus, Weissella, Trichococcus i Brachybacterium pokazalo je statistički značajne razlike između grupe CUS modela i kontrolne grupe (Slike 4C-H). Nakon 28 dana liječenja CTE, relativna brojnost gore navedenih šest rodova je promijenjena na nivoe slične kontrolnoj grupi.

Niska brojnost Deinococcusa u različitim taksonomskim nivoima uključujući nivo klase (Deinococci), nivo reda (Deinococcales), nivo porodice (Deinococcaceae) i nivo roda (Deinococcus) otkrivena je u CUS grupi štakora, dok nije bila otkrivena u kontrolnoj grupi. grupe i grupe administracije (Slike 5A-D).

Na nivou vrste, Weissella beninensis je bila mnogo niža u CUS grupi nego u kontrolnoj grupi, a uočeno je značajno povećanje relativne zastupljenosti nakon primjene CTE visoke doze (Slika 5E). Suprotno tome, primjena CTE-a je preokrenula značajno povećanje relativne zastupljenosti konglomerata Brachybacterium uočeno kod CUS pacova (Slika 5F).

CTE modulirani SCFA u CUS pacovima

Koncentracije SCFA (uključujući acetat, propionat, butirat, izobutirat, valerinsku kiselinu, izovalerinsku kiselinu i heksanoičnu kiselinu) u uzorcima fekalija pacova analizirane su GC i prikazane su na slici 6. Nivoi acetata [jednosmjerna ANOVA, F( 4,32)=2.721, p=0.0467; Dunnettov test, p < 0.05]="" i="" heksanska="" kiselina="" [jednosmjerna="" anova,="" f(4,30)="3.028," p="" {{15="" }}.0328;="" dunnettov="" test,="" p="">< 0,05]="" su="" značajno="" povećani="" kod="" pacova="" grupe="" cus="" modela="" u="" poređenju="" sa="" kontrolnom="" grupom.="" nakon="" dugotrajne="" primjene="" cte="" visoke="" doze,="" acetata="" (studentov="" t-test,="" t="2.182," p="">< 0,05)="" i="" heksanske="" kiseline="" [jednosmjerna="" anova,="" f(4,30)="3" .028,="" p="0.0328;" dunnettov="" test,="" p="">< 0,05]="" koncentracije="" su="" bile="" pretežno="" smanjene="" u="" poređenju="" sa="" cus="" grupom,="" što="" ukazuje="" na="" to="" da="" bi="" cte="" mogao="" ispoljiti="" svoju="" antidepresivnu="" aktivnost="" kroz="" modulaciju="" poremećenog="" neuroaktivnog="" metabolita="" scfa.="" primjena="" cte="" sa="" grupom="" sa="" niskim="" dozama="" pokazala="" je="" opadajući="" trend,="" ali="" bez="" značajnog="" efekta="" na="" koncentracije="" acetata="" i="" heksanske="">

Analiza korelacije crijevne mikrobiote, neurotransmitera i neurotrofina u hipokampusu, 5-HT u debelom crijevu i SCFAs

Da bi se istražio funkcionalni odnos izmijenjene crijevne mikrobiote na nivou roda, promijenjenih neurotransmitera i neurotrofina u hipokampusu i debelom crijevu, te uznemirujuće koncentracije SCFA, razvijeni su Pearsonovi koeficijenti korelacije (Meng et al., 2017). Korelacije između njih (r > 0.4 ili r < -0.4,="" p="">< 0,05)="" su="" prikazane="" na="" slici="" 7.="" koeficijenti="" su="" ukazivali="" na="" jaku="" korelaciju="" između="" izmijenjenog="" sastava="" crijevne="" mikrobiote="" na="" nivou="" roda,="" koncentracije="" od="" sedam="" tipova="" scfa="" i="" monoaminskih="" neurotransmitera="" povezanih="" s="" depresijom="" (5-ht="" i="" ne).="" brojnost="" ruminokoka="" je="" pokazala="" značajnu="" negativnu="" korelaciju="" sa="" 5-koncentracijom="" ht="" u="" hipokampusu,="" što="" znači="" da="" cus="" procedura="" dovodi="" do="" povećanja="" relativne="" brojnosti="" ruminokoka="" i="" smanjenja="" koncentracije="" 5-ht.="" nakon="" tretmana="" s="" cte,="" relativna="" brojnost="" ruminokoka="" smanjena="" je="" na="" nivo="" kontrolne="" grupe,="" a="" utvrđeno="" je="" da="" su="" se="" nivoi="" 5-ht="" poboljšali.="" nadalje,="" relativna="" brojnost="" bacteroides="" je="" u="" pozitivnoj="" korelaciji="" sa="" 5-ht="" nivoom="">

hipokampus, i negativno povezan s koncentracijom butirata, izobutirata, valerinske kiseline, izovalerinske kiseline i heksanoične kiseline; obilje Parabacteroides pokazalo je značajnu pozitivnu korelaciju sa 5-HT nivoom u hipokampusu i koncentracijom propionata, dok je pokazalo negativnu korelaciju sa koncentracijama izobutirata i izovalerinske kiseline; također je uočena značajno pozitivna povezanost između relativne zastupljenosti Butyricimonasa i nivoa NE u hipokampusu, a relativna brojnost Deinococcus-a je u pozitivnoj korelaciji sa koncentracijom acetata. Ovo je pokazalo da CTE može ispoljiti svoju antidepresivnu aktivnost promjenom sastava crijevne mikrobiote, remećenjem nivoa neurotransmitera hipokampusa i obnavljanjem neuroaktivnih metabolita SCFA. Detaljni podaci korelacione analize prikazani su u Dodatnoj tabeli S3.

cistanchemože liječitidijabetesa

DISKUSIJA

Identifikacija antidepresivne aktivnosti CTE i njenih kliničkih prednosti

Ova studija procijenila je antidepresivnu aktivnost CTE kod CUS štakora, potvrdila efikasnost in vivo modela kao što su FST, SPT, OFT i NSFT, i potvrdila antidepresivnu aktivnostC. tubulosakod CUS štakora koji se često koristi za liječenje nedostatka bubrega, impotencije i ženske neplodnosti u TKM. Trenutno, najčešće propisivani antidepresivi su inhibitor ponovne pohrane serotonina i norepinefrina (SNRI) venlafaksin, a zatim slijedi selektivni inhibitor ponovnog preuzimanja serotonina (SSRI) FLX (Thase et al., 2001; Mcintyre, 2017). Međutim, pokazalo se da ovi antidepresivi posjeduju ozbiljne nuspojave, uključujući srčanu toksičnost, krvni tlak, seksualnu disfunkciju i poremećaje spavanja (Ferguson, 2001; Jin et al., 2015). Među svim klasama antidepresiva, SSRI i SNRI su u korelaciji sa najvećom incidencom seksualne disfunkcije (Montejogonzalez et al., 1997; Clayton et al., 2014). Od posebne je važnosti ukupna incidencija seksualne disfunkcije, koja iznosi 59,1 posto (604/1,022) kada se svi antidepresivi posmatraju kao cjelina; a oko 40 posto pacijenata pokazuje nisku toleranciju na seksualnu disfunkciju, tako da je pridržavanje lijekova ozbiljno pogođeno (Clayton, 2001). S obzirom na nedostatke trenutnog liječenja depresije, Cistanches Herba pokazuje veliki potencijal za kliničku primjenu, ne samo zbog svog snažnog djelovanja poput antidepresiva, već i zbogCistanches Herbatradicionalno se koristi za liječenje impotencije, što bi barem trebalo eliminirati jednu zabrinutost zbog najčešćih nuspojava uzrokovanih drugim antidepresivima (Fu et al., 2017.). Osim toga, Cistanches Herba ne pokazuje znakove toksičnosti i promjene povezane s liječenjem