Antialergijski i protuupalni efekti neferina na RBL-2H3 ćelije plus

Molimo kontaktirajteoscar.xiao@wecistanche.comza više informacija

3. Diskusija

Patogeneza atopijskog dermatitisa (AD) nije u potpunosti shvaćena, ali bolest je posredovana abnormalnim imunološkim odgovorom imunoglobulina E (IgE) u disfunkciji kožne barijere. Među njima, mastociti (MC) mogu uzrokovati IgE posredovane alergijske bolesti, uključujući AD. Kada se mastociti aktiviraju, oslobađaju svoje membranski vezane citoplazmatske čestice, što dovodi do oslobađanja raznih molekula. Ovi molekuli igraju važnu ulogu u patogenezi AD i odbrani domaćina [27]. Budući da inhibicija aktivacije ili degranulacije mastocita pomaže u regulaciji različitih reakcija preosjetljivosti posredovanih IgE, mastociti su jedna od idealnih meta za istraživanje antialergijskih lijekova. U našoj studiji, mastociti su degranulirani kao odgovor na jedinjenje 48/80 i kalcijum jonofor A23187 i anti-DNP/IgE plus DNP/HSA. Otkrili smo da referenca efikasno inhibira efekat degranulacije mastocita, pokazujući njegovu antialergijsku reakciju. Štaviše, referencom je inhibirano povećanje intracelularnog kalcijuma i aktivacija MAPK. Nadalje, infiltracija mastocita kože uzrokovana DNCB-om i ponašanje grebanja uzrokovano spojem 48/80 također su smanjeni. Stoga mehanizam neferinskog antiatopijskog dermatitisa ima multiplikativni učinak na keratinocite i mastocite.

Patogenia atópica dermatitisa (DA) ne comprende por completo, pero la enfermedad está mediada por una respuesta inmunitaria anormal de la inmunoglobulina E (IgE) en la disfunción de la barrera cutánea. Entre ellos, los mastocitos (MC) pueden causar enfermedades alérgicas mediadas por IgE, incluida la EA. Cuando los mastocitos se activan, liberan sus partículas citoplásmicas unidas a la membrana, lo que lleva a la liberación de una variedad de moléculas. Estas moléculas juegan un papel importante en la patogénesis de la EA y la defensa del huésped [27]. Debido a que la inhibición de la activación o desgranulación de los mastocitos ayuda a regular varias reacciones de hipersensibilidad mediadas por IgE, los mastocitos son uno de los objetivos ideales para explorar fármacos antialérgicos. En nuestro estudio, los mastocitos se desgranulan en respuesta al compuesto 48/80 y al ionóforo de calcio A23187, y anti-DNP/IgE plus DNP/HSA. Encontramos que la referencia inhibió efectivamente el efecto de desgranulación de los mastocitos, mostrando su reacción antialérgica. Además, el aumento de calcio intracelular y la activación de MAPK fueron inhibidos por referencia. Además, también se redujeron la infiltración de mastocitos en la piel causada por DNCB y el comportamiento de rascado causado por el compuesto 48/80. Por lo tanto, el mecanismo de la dermatitis antiatópica de la neferina tiene un efecto multiplicador sobre los queratinocitos y los mastocitos.

Molimo kliknite ovdje da saznate više

Citoplazma mastocita pronađenih u tkivima ispunjena je velikim, gustim česticama prethodno formiranih inflamatornih medijatora[28]. Proces oslobađanja ovih medijatora iz sekretornih granula u mastocitima naziva se degranulacija. Budući da inhibicija degranulacije mastocita može regulisati različite reakcije preosjetljivosti posredovane IgE, mastociti su jedna od idealnih meta za istraživanje antialergijskih lijekova [29,30]. Naši rezultati pokazuju da referenca ima veoma dobar efekat na degranulaciju mastocita bez obzira na upotrebu antigena, stimulatora receptora ili jonofora. Ovo pokazuje da je referenca potencijalno antialergijsko sredstvo (slika 2).

Sve prethodno uskladištene granule, novosintetizovani medijatori, pa čak i granule i njihove komponente mogu se koristiti kao indikatori aktivacije MC [31]. Osim toga, standardna metoda je mjerenje intracelularne koncentracije Ca4t. Većina MC sekretagoga (npr. antigen, spoj 48/80) koji se generalno koriste u laboratoriji izazvali su povećanje intracelularne koncentracije Ca2 plus. U stvari, povećanje intracelularne koncentracije Ca2 plus također može izazvati degranulaciju MC. Obično se povećanje intracelularnog Ca4t inducira aktivacijom MC spojevima, kao što su tapsigargin (posebno blokiraju Sarco/endoplazmatsku Ca2 plus ATPazu, SERCA) pumpe i jonofore (tj. jonomicin i A23187) [32,33]. Stoga, u Ca2t-ovisnoj MC aktivaciji, mjerenje priliva Ca2t se također smatra metodom za određivanje uslova MC aktivacije. U istraživanju MC, Fura-2 se široko koristi za određivanje intracelularnih promjena Ca2 plus. U našim eksperimentima otkrili smo da je intenzitet fluorescencije aktiviranih mastocita bio značajno potisnut nakon tretmana referentnom (slika 3). Prethodni izvještaji su ukazivali da je povećanje intracelularne koncentracije Ca4t u skladu s oslobađanjem histamina [34]. Prema tome, zaključujemo da će oslobađanje histamina također biti inhibirano tretmanom reference. Dalji eksperimenti su opravdani kako bi se potvrdila ova hipoteza.

Mastociti imaju značajno različite funkcionalne izlaze.cistanche dosage redditTo uključuje degranulaciju, stvaranje prekursora arahidonske kiseline, kemotaksiju i proizvodnju citokina, a svi su u određenoj mjeri ovisni o signalima kalcija, bez obzira na stimulanse [32] Aktivirani MC oslobađa citokine, koji su glavni posrednici alergija i upalnih bolesti [ 35]. Proizvodnja citokina od strane aktiviranih mastocita rezultat je indukcije transkripcije gena citokina u tim stanicama. Stimulacija mastocita dovodi do aktivacije NF-kB i AP-1 i proizvodnje mnogih citokina [36]. MAPK kaskadni signalni putevi igraju bitnu ulogu u regulaciji ekspresije citokina. Aktivacija ovih puteva kroz aktivaciju PKC-a pomoću PI rezultira aktivacijom različitih gena, uključujući inflamatorne citokinske gene kao što su IL-1, IL-6 i TNF [37]. Naše nedavne studije su pokazale da referenca može inhibirati citokine koji se oslobađaju aktivacijom keratinocita. U isto vrijeme, također smo otkrili da će aktivacija puta MAPK također biti inhibirana tretmanom reference [18]. U našoj trenutnoj studiji, pokazali smo da referenca takođe može smanjiti ekspresiju citokina kroz inhibiciju MAPK aktivacije u mastocitima (Slike 4 i 5). Aktivacija NFkB je takođe smanjena zbog inhibicije aktivacije MAPK (slika 6).

Cistanche može protiv starenja

Brojne studije su izvijestile da su različiti citokini kod pacijenata s AD povišeni, što dovodi do disfunkcije kožne barijere, uključujući citokine koje luče keratinociti i citokine izvedene iz Th2- [38,39]. Osim toga, objavljeno je da ovi izlučeni citokini također mogu smanjiti ekspresiju proteina uske spojnice (T]) i gena za terminalnu diferencijaciju, uključujući filagrin (FLG), loricrin (LOR) i involukrin (IVL) [39,40 ](Pro)filagrina ekspresija je smanjena u AD i obrnuto je povezana sa MC triptazom i IL-6[41]. IL-1 posreduje kod hronične upale kod miševa sa oštećenom kožnom barijerom [35]. U prethodnoj studiji je objavljeno da je ekspresija FLG, IVL i LOR smanjena nakon primjene DNCB na dorzalnu kožu NC/Nga miševa[42,43]. U ovoj studiji, ekspresija FLG, IVL i LOR je značajno smanjena u dorzalnoj koži kontrolne grupe, što ukazuje na oštećenje epidermalne barijere. Referentna primjena značajno je oporavila smanjenu ekspresiju FLG, IVL i LOR nakon liječenja DNCB, dok je referentna primjena blago povećala ekspresiju IVL i LOR u poređenju sa kontrolnom grupom (Slika 8). Poznato je da je jedinjenje 48/80 efikasan aktivator mastocita kože. Reakcija kože stimulisana jedinjenjem 48/80 može izazvati ponašanje češanja oslobađanjem histamina iz mastocita [44]. Histamin oslobođen iz aktiviranih mastocita igra važnu ulogu u povećanju vaskularne permeabilnosti uzrokovane spojem 48/80. Tokom svraba kod ljudi, takođe se uzima u obzir histamin koji se oslobađa iz mastocita putem različitih podražaja. postao važan posrednik. Stoga je inhibicija degranulacije mastocita važan korak u regulaciji oslobađanja histamina tokom ponašanja češanja. U ovom ispitivanom spoju, 48/80 je izazvalo efikasnu aktivaciju mastocita kože. Međutim, predtretman sa referencom značajno je smanjio nivo degranulacije mastocita (Slika 2).prednosti ekstrakta cistancheOvi rezultati ukazuju na to da referentni učinak na ponašanje protiv ogrebotina može biti posljedica smanjenja vaskularne permeabilnosti regulacijom degranulacije mastocita (Slika 9).

Općenito je utvrđeno da pacijenti s AD pate od disfunkcije kožne barijere, upale kože ili oboje, pa je teško pronaći odgovarajuće metode liječenja. Stoga se obično preporučuje kombinovana terapija. Naše nedavno istraživanje je pokazalo da nikada nema imunomodulatornu funkciju i sposobnost popravljanja barijere. Stoga je važna referentna karakteristika u liječenju AD u budućnosti održavanje funkcije kože i poboljšanje hidratacije kože i popravka barijere. Referenca također može smanjiti ponašanje češanja uzrokovano alergenima i iritansima. Štaviše, atopijski marš je bolest povezana s fenomenom koja se javlja i napreduje korak po korak. Atopijski dermatitis se često javlja u djetinjstvu. Alergija na hranu se često javlja nakon 1-2 godina starosti. Alergijski rinitis često može početi prije i poslije škole. Simptomi astme se javljaju u različito vrijeme, ali većina ih je nakon alergijskog rinitisa. Nakon djetinjstva, atopijski dermatitis i određene alergije na hranu mogu se poboljšati ili nestati. Alergijski rinitis i astmu nije lako izliječiti[45,46]. Stoga su komorbidne pojave kod bolesti. Prirodni proizvodi, uključujući reference, imaju terapeutski potencijal komorbiditeta, a njihova efikasnost u srodnim bolestima je vrijedna proučavanja u budućnosti.

4. Materijali i metode

4.1. Bazofilne ćelije leukemije pacova

Ćelije bazofilne leukemije pacova (RBL-2H3) su poklon od TLHwanga, Univerziteta Chang Gung, Taoyuan, Tajvan. RBL-2H3 ćelije su mukozne mastocite koje se koriste za proučavanje degranulacije izazvane antigenom ili kalcijum jonoforom, intracelularnog Ca4t i transdukcije signala [29]. Ćelije su uzgajane u EMEM-u koji sadrži 10 posto FBS, s penicilinom i streptomicinom na 37 stepeni, 5 posto CO2. Iscoveov modificirani Dulbecco medij (IM) i fetalni goveđi serum (FBS) kupljeni su od Thermo Fisher Scientifica (GIBCOTM, New York, NY, SAD).

4.2.MTT test

3-(4,5-dimetiltiazol-2-il)-2,5-difenil-2H-tetrazolijum bromid (MTT) test se koristi za mjerenje metabolička aktivnost ćelija. RBL-2H3 ćelije su zasijane u 24-pločicu za kulturu u 5 × 10 plus po jažici. Nakon 24 h tretmana lijekom, dodano je 30 μL MTI po jažici i stavljeno u ćelijski inkubator na 37 stepeni na 2-4 h, a zatim su ljubičasti kristali formazana otopljeni sa DMSO. ELISA čitač je korišten za mjerenje intenziteta apsorbancije na talasnoj dužini od 550 nm kao test vitalnosti ćelije.

4.3. Mjerenje intracelularnog nivoa Ca2 plus

[Ca2t] Izmjereno mi je fura-2 kao što je prethodno opisano[47].RBL-2H3 ćelije su resuspendirane u IMDM koji sadrži 5 uM Fura 2-AM i 1,2 mM CaClz na 37 stepeni za 30 min. Nakon punjenja Fura-2, keratinociti su peletirani i resuspendirani u svježem DMEM-u. Alikvot (2 mL) je prebačen u kivetu za miješanje koja je sadržavala 1,2 mM CaClz. Fura{15}} fluorescencija Ca je ispitana na talasnim dužinama ekscitacije od 340 i 380 nm (valna dužina emisije, 505 nm) u Perkin{159 lmeru }} spektrofluorometar (PerkinElmer Life and Analytical Sciences). Podaci su snimani u intervalima od 5s[47].

4.4. Kvantitativna polimerna lančana reakcija (qPCR)

RBL{{0}}H3 ćelije su posađene u posudu za kulturu od 3,5 cm. Nakon što su ćelije narasle do 90 posto pune, ćelije su uzgajane u statičkom stanju 24 h. Nakon što su ćelije prethodno tretirane referencom tokom 20 minuta, one su stimulisane sa TNF-a/IFN-y tokom 1 ili 24 sata, respektivno. Ćelije su ostrugane, centrifugirane (16,000×g,10 min,4 stepena), a supernatant je ekstrahiran. RNK je pročišćena upotrebom kompleta za izolaciju ukupne RNK (GeneDirex@, Vegas, NV, SAD). Prema radnoj proceduri skriptnog kompleta za sintezu cDNA (BIO-RAD), reagensi su dodavani redom i radili u skladu sa naznačenim uslovima da bi se RNK pretvorila u cDNK. Nadalje, korišćen je PowerUpTM SYBRTM Green Master Mix (Applied BiosystemsTM). Dodato je ukupno 7,5 uL ddH20,2 uL cDNA, 0,25 μLof prednjeg i reverznog prajmera i 10 uL SYBR GREEN-a i jednoliko pomiješano. Sekvence prajmera su prikazane u tabelama 1 i 2. Zatim je RNK kvantifikovana korišćenjem ABI StepOnePlusTM PCR sistema u realnom vremenu.

4.5. Western blot test

Western blotting se koristi za analizu promjena različitih proteina u stanicama. RBL{{0}}H3 ćelije su zasijane u posudu za kulturu od 3,5 cm. Nakon što su ćelije narasle do 90 posto pune i izgladnjele 24 h, prethodno su tretirane referencom 20 minuta, a zatim stimulirane sa TNF-a ili IFN-y 30 minuta, odnosno 1 h. Nakon struganja, ultrazvukom su usitnjeni u prah i centrifugirani (13.200 o/min, 10 min, 4 stepena). Nakon centrifugiranja, supernatant je uzet i protein je kvantifikovan pomoću Pierceovog kompleta za analizu proteina (Pierce, Rockford, IL, USA). Podvrgnuta je elektroforezi na 10 postotnom SDS-poliakrilamidnom gelu, a zatim elektroporisana PVDF membranom. Nakon što je transfer završen, PVDF membrana je stavljena u TBS-T (Tris-puferirani slani rastvor/0,05 posto tween 20) rastvor koji sadrži 5 posto obranog mlijeka u prahu i mućkana 1 h kako bi se izbjeglo nespecifično vezivanje. Zatim je TBS-T ispran 3 puta, svaki put po 10 minuta. Zatim su dodana primarna antitela (1:1000 razblaženja) i stavljena na 4 stepena preko noći, a zatim su isprana 3 puta sa TBS-T svakih 10 minuta. Nakon dodavanja sekundarnih antitela (razblaženih 1:1000) tokom 1 h, PVDF membrana je isprana 3 puta sa TBS-T po 10 minuta svaki put. Na kraju je dodat razvijač, a membrana je stavljena u sistem za ekstrakciju hemijske luminiscencije (BIOSTEP Celvin") za snimanje.

4.6. Dinitroklorobenzen(2,4-Dinitrochloroben2ene, DNCB) indukovana upala kože nalik atopijskom dermatitisu kod miševa

Prvo, miševi su podijeljeni u četiri grupe: kontrolna grupa, DNCB grupa (negativna grupa), referentna (3 mg/kg i 10 mg/kg) sa DNCB grupom i deksametazon (0,2 mg/kg) sa DNCB grupa (pozitivna grupa). Deksametazon je kortikosteroidni hormon koji može smanjiti oticanje i alergijske reakcije. U ovom in vivo eksperimentu, i referentni i deksametazon su otopljeni u DMSO, dok je DNCB otopljen u 75 posto etanola ultrazvučnim šokom. Prvi je davan intraperitonealnom injekcijom, a za drugi je 100 uL naneseno na kožu leđa i 20 μL na desno uho. Tri dana prije eksperimenta, miševi su anestezirani i stražnja dlaka je uklonjena, a mali mjerni magnet (SCT-MAG-TF) je ugrađen na stražnju stranu mišjih stražnjih stopala.cistanche genghis khanNakon tri dana mirovanja, potvrđeno je da su miševi u dobroj fizičkoj kondiciji i da je koža na dorzalnoj depilaciji normalna i eksperiment je započet. Tokom eksperimenta snimljene su fotografije koje su zabilježile promjene izgleda kože. Prva faza ({{0}} dana) je bio period alergijskog atopijskog dermatitisa. Nakon mjerenja osnovnih vrijednosti miševa u DNCB grupi, referentnoj (3 i 10 mg/kg) i eksperimentalnoj grupi DNCB, te eksperimentalnoj grupi deksametazona 0,2 mg/kg i DNCB, 1 posto DNCB je ravnomjerno naneseno na kožu leđa i desno uho. Petog dana intraperitonealno su ubrizgani referentni lijekovi i deksametazon. Druga faza (od 5. do 14. dana) bila je ponovna indukcija atopijskog dermatitisa.produžetak životnog vijeka cistancheU 3 eksperimentalne grupe,0.5 posto DNCB je ravnomjerno razmazano na kožu leđa i desno uho miševa. Sljedećeg dana su snimljene i snimljene fiziološke vrijednosti kože i slike. Nakon što su miševi 15. dana eutanazirani sa prekomjernom količinom ugljičnog dioksida (CO2), tkivo dorzalne kože je uklonjeno za naknadnu eksperimentalnu analizu.

4.7. Spoj 48/80-Indukovano grebanje kod BALB/c miševa

Dlaka kože na leđima miša je ošišana i intrakutano je ubrizgano 20 μL rastvora jedinjenja 48/80. Umjesto toga, kontrolni miševi su primili injekcije slane otopine. Odmah nakon injekcije, životinja je stavljena u kavez za posmatranje (prečnik 11 cm, MicroAct, Neuroscience, Tokyo, Japan), a ponašanje miša pri češanju je automatski i objektivno detektovano i procenjeno. Ponašanje ogrebotine je mjereno 60 min. MicroAct koristi sljedeće parametre analize za detekciju valova koji odgovaraju kontinuiranom ponašanju miševa pri češanju: prag, 0,05 V; razmak događaja, 0,05 s; minimalno trajanje,0,25 s; maksimalna frekvencija,30 Hz; minimalna frekvencija,5Hz. 4.8.Statistička analiza

Za statističku analizu korišten je softver Sigma-Plot (verzija 10.0).cistanche nzPodaci su izraženi kao srednja vrijednost ± SEM, sa (*) i (#) kao napomene. Statistička značajnost podataka analizirana je neparnim, dvostranim Studentovim t-testovima.p vrijednostima manjim od 0.05 i 0,01 smatrani su značajnim.

5. Zaključci

U ovoj studiji smo utvrdili da referenca učinkovito inhibira degranulaciju mastocita i smanjuje ekspresiju proinflamatornih citokina, koji mogu smanjiti simptome slične atopijskom dermatitisu, obnoviti kožnu barijeru i smanjiti grebanje kože. Nadalje smo dokazali da referenca ne samo da može djelovati na keratinocite kože, već i utjecati na aktivaciju mastocita. Ima veći potencijal za primjenu kod alergijskih i upalnih oboljenja kože.

Ovaj članak je preuzet iz Int. J. Mol. Sci. 2021, 22, 10994. https://doi.org/10.3390/ijms222010994 https://www.mdpi.com/journal/ijms