Tretmani protiv starenja usporavaju širenje sinukleinopatije vraćanjem lizosomske funkcije

Uvod:

Karakteristično je nakupljanje specifičnih proteinskih agregataneurodegenerativne bolesti, kao što jeAlchajmerova bolest(AD),Parkinsonova bolest(PD), iamiotrofična lateralna skleroza(ALS). Proteini koji se agregiraju u ovim bolestima uključuju Ab i MAPT/tau kod AD, SNCA/a-sinuklein kod PD i TARDBP/TDP-43 kod ALS. Agregacija proteina je posljedica poremećene proteostaze, koja se održava koordiniranom regulacijom sinteze, savijanja i razgradnje proteina. Mutacije u sintezi proteina i mašinama za razgradnju uzrokujuneurodegeneracijana životinjskim modelima i često su povezani s ljudimaneurodegenerativne bolesti. Proteini se agregiraju uneurodegenerativne bolestiprogresivno se šire iz ograničenih područja mozga na veća područja kako bolest napreduje. U slučaju PD, SNCA agregati se u početku javljaju u jezgrima donjeg moždanog debla i olfaktorne lukovice i uzastopno se šire uzlaznim putevima kroz gornje regije moždanog debla do kortikalnih područja. Prenos proteinskih agregata sa ćelije na ćeliju je predložen kao osnovni mehanizam za ovu patološku diseminaciju u mozgu pacijenata sa neurodegenerativnim bolestima.1-3 Detalji mehanizma prijenosa agregata od stanice do stanice ostaju nedostižni, međutim, dokazi sugeriraju da nekonvencionalna egzocitoza i naknadna endocitoza u susjednim stanicama čine glavni okvir mehanizma. Pod pretpostavkom da razmnožavanje agregata dovodi do progresije fenotipova bolesti, poremećaj međustanične agregatne transmisije pojavljuje se kao obećavajuća strategija za zaustavljanje progresije bolesti.4,5 Prijenos proteinskih agregata sa ćelije na ćeliju je 2-proces koraka: prijenos agregata sa ćelija donora na ćelije primaoca i koagregacija prenesenih proteina i endogenih proteina.6 Ovdje smo razvili Caenorhabditis elegans (C. elegans) modele koji koriste bimolekularnu fluorescentnu komplementaciju (BiFC)7 da ispolje fluorescenciju u mišićima ždrela i njihovim povezanim neuronima samo kada SNCA proteini intercelularno interaguju jedni s drugima. Koristeći ove životinjske modele, istražili smoefekti starenjao prenosu agregata od ćelije do ćelije i mehanizmuu osnovi efekata starenja.

Kliknite ovdje da biste saznali Cistanche za neurodegenerativne bolesti

Rezultati Generisanje i karakterizacija C. elegans modela za prijenos sinukleinopatije

Kako bismo razvili životinjski model za pogodan test prijenosa proteina od stanice do stanice, proizveli smo transgene linije C. elegans koje eksprimiraju SNCA spojene na N-terminalni ili C-terminalni fragment Venere, varijantu žutog fluorescentnog proteina (Sl. 1A). N-terminalni dio Venere (V1) bio je vezan za SNCA N kraj (V1S), a C-terminalni dio Venere (V2) za C kraj SNCA (SV2). U modelu C. elegans, V1S je eksprimiran u mišiću ždrijela pomoću promotora myo-2 (Pmyo-2),8 a SV2 i DsRed su koeksprimirani u neuronima povezanim sa ždrijelom pomoću flip{{ 16}} promoteri (Pflflp-21) 9 (slika 1B). Prisustvo i ekspresija ovih transgena je verifikovana korišćenjem PCR-a jednog crva i imunofluorescencije sa anti-SNCA antitelom Ab27410 (sl. S1A do D), verifikovanjem specifične ekspresije proteina isključivo u predviđenim tipovima ćelija. Obrazac ekspresije Pflflp- 21 je opisan9, a naš vlastiti marker za aktivnost promotora flip-21 (DsRed) je također pokazao isti obrazac ekspresije, koji uključuje ekspresiju u ADL, ASE i ASH senzornim neuronima, motornih neurona URA, MC, M2 i M4 faringealnih neurona i crijeva (slika S1E).

Ekspresija V1S ili SV2 sama nije proizvela BiFC fluorescenciju. Međutim, koinjekcija oba konstrukta proizvela je snažnu fluorescenciju BiFC u faringealnom mišiću i susjednim neuronima, a potonji je označen sa DsRed (sl. 1C i D; slike S1E i G). Podaci su pokazali da se prijenos proteina odvijao u oba smjera. Koekspresija Pflflp-21::SV2-DsRed i Pmyo-2::V1 (bez SNCA gena) nije generirala BiFC signal (sl. 1C i D; sl. S1E), što ukazuje da signal nije nastao zbog nespecifičnih interakcija između fragmenata Venere. Da bismo testirali specifičnost BiFC sistema, generirali smo Pmyo-2::V1Q25 C Pflflp-21::SV2-DsRed liniju, transgenog crva koji eksprimira huntingtin ekson 1 sa 25 glutaminskih dionica pod kontrolom Pmyo-2 i SV2 u neuronima. Ovi crvi nisu pokazivali BiFC signal ni u faringealnim mišićima ni u neuronima (slika 1D; slika S1E). Ovaj rezultat potvrđuje specifičnost BiFC transgenih crva za SNCA prijenos. Također smo uspostavili integrirane transgene linije koje eksprimiraju V1S i SV2-DsRed respektivno i ukrstili ih kako bismo stvorili integriranu dvostruku transgenu liniju. Kao što se očekivalo, ni V1S ni SV2-DsRed integrisana linija nije proizvela BiFC FL fluorescenciju, dok je integrisana dvostruko-transgena linija pokazala snažnu BiFC fluorescenciju i u faringealnom mišiću i u susjednim neuronima (sl. S1F i H). Dakle, ovaj C. elegans BiFC sistem se može koristiti kao in vivo model u kojem se i transfer proteina i koagregacija između SNCA proteina izvedenih iz susednih ćelija mogu precizno i ​​kvantitativno analizirati u realnom vremenu.

BiFC FL fluorescencija se povećavala kako su crvi starili (Sl. 1E i F), a starije životinje su pokazivale nakupine BiFC signala, dok su mlađe pokazivale uglavnom difuzne obrasce (Slika 1E). Ovi podaci ukazuju da je SNCA prijenos kontinuiran proces i da akumulirani agregati čine velike inkluzije kasnije u životu.

Zatim smo ispitali degeneraciju aksonskih procesa iz URA motornog neurona.9 Ovi nervi su bili netaknuti u divljem tipu N2 na d 8. Ekspresija SV2 u neuronima je uzrokovala formiranje neuritičnog mjehurića i fragmentaciju živca kod malog broja crva (Sl. 1G do K), što ukazuje na autonomnu ćelijsku toksičnost SNCA u neuronima. Ovi degenerativni fenotipovi su dodatno pogoršani kada je V1S eksprimiran u faringealnom mišiću. U potonjem slučaju, otprilike 15 posto nerava je potpuno izgubljeno (slika 1K). Da bismo potvrdili fragmentaciju nerva, izveli smo 3-D rekonstrukciju naslaganih slika nervnih procesa. Ovaj eksperiment je jasno pokazao fragmentaciju živca i formiranje mjehurića (slika 1H). Ovi podaci jasno pokazuju neautonomne ćelijske efekte na vitalnost neurona. Degeneracija nerva se pogoršavala kako su transgeni crvi starili (slika 1J).

Kako bismo procijenili promjene ponašanja uzrokovane prijenosom SNCA agregata, izvršili smo analizu faringealnog pumpanja. Brzine pumpanja divljeg tipa N2 nisu se značajno promijenile sa starenjem do 16. godine. Jedna ekspresija V1S ili SV2-DsRed u faringealnom mišiću i susjednim neuronima, respektivno, rezultirala je blagim padom brzine pumpanja u starosti (slika 1L i tabela S1). Smanjenje brzine pumpanja svih pojedinačnih ekspresanata postalo je značajno na d 13 (slika 1L i tabela S1). Koinjekcija i dvostruko integrisane linije pokazale su ozbiljnije fenotipove za brzinu pumpanja, pri čemu je pad postao očigledan već u d 2 i progresivno se pogoršavao kako crvi stari (Slika 1L i Tabela S1). U testovima dugovječnosti, jednotransgene životinje su pokazale nešto kraći životni vijek u odnosu na N2 crve, dok je životni vijek dvostruko transgenih životinja bio kraći od jednotransgenih linija (slika 1M i tabela S2). Dakle, agregatni prijenos i formiranje inkluzijskih tijela, kao i povezani degenerativni fenotipovi, napreduju sa starenjem. Poređenje vremenskih linija pokazuje da smrti organizma prethodi akumulacija BiFC signala, degeneracija nerva i opadanje pumpnog ponašanja. Ovi rezultati su replicirani sa crvima koji eksprimiraju neoznačeni SNCA u istim tipovima ćelija kao i BiFC model (sl. S1I do L), što sugerira da se fenotipovi uočeni u BiFC modelu pripisuju SNCA.

Efekti genetskih faktora povezanih sa starenjem na prijenos SNCA sa stanice na ćeliju

Zatim smo ispitali efekte genetskih varijacija povezanih sa starenjem na agregatni prijenos i degenerativne fenotipove. BiFC SNCA konstrukti su ubrizgani u daf-2(e1370) i ​​daf-16(mu86) mutante (sl. S2A i B), koji modeliraju efekte starenja, sa daf{{6 }} (e1370) mutanti koji pokazuju sporiju brzinu starenja i produženi životni vijek, dok daf-16(mu86) mutanti stare brže od divljeg tipa i imaju skraćeni životni vijek.11 Daf{{11 }}(e1370); V1SCSV2 životinje su pokazale smanjen BiFC signal (sl. 2A i B; slika S2D), manji broj inkluzijskih tijela (sl. 2C i D; slika S2E), manju degeneraciju živaca (sl. 2E i F; slika S2F i G) poboljšano ponašanje pumpe (slika 2G; slika S2H) i produžen životni vek od linije V1SCSV2 (slika 2H; slika S2I). Obrnuto, u daf-16(mu86); V1SCSV2 životinje, BiFC-pozitivna inkluzija pojavila su se mnogo ranije nego kod V1SCSV2 životinja; već od 2-d nakon L4- faze (sl. 2C i D; slika S2E). Sam BiFC signal je bio niži u daf-16(mu86); V1SCSV2 nego u V1SCSV2 (slika 2B; slika S2D), vjerovatno zbog ranog i robusnog formiranja inkluzijskih tijela. Daf-16(mu86); V1SCSV2 životinje su pokazale ozbiljniju degeneraciju nerva (Sl. 2E i F; Sl. S2F i G), smanjeno ponašanje pumpanja (Slika 2G; Slika S2H) i kraći životni vek od V1SCSV2 životinja (Sl. 2H; Sl. S2I). Slični rezultati su dobijeni u 3 nezavisne linije za svaki genotip. Ovi rezultati pokazuju da genetski faktori koji utiču na procese starenja mogu promijeniti brzinu prijenosa SNCA agregata sa stanice na ćeliju i pridruženih degenerativnih fenotipova in vivo.

Slika 1. Generisanje i karakterizacija C. elegans modela za prijenos sinukleinopatije. (A) Pretpostavljeni događaji koji dovode do stvaranja BiFC fluorescencije putem prijenosa SNCA od stanice do stanice. (B) Transgeni koji se koriste u C. elegans. DsRed se izražava kao nezavisna translaciona jedinica, koja se koristi za označavanje neurona. (C) BiFC fluorescencija u faringealnim mišićima i neuronima. Sve slike sadrže DIC i fluorescentne slike. Strelice označavaju BiFC signale od neurona (vidi i slike S1E do H). Mjerne trake: 20{{20}} mm. (D) Kvantifikacija BiFC fluorescencije u (C) i V1S C SV2 dvostruko-transgenoj integriranoj liniji. Korišteno je dvadeset pet crva iz svake linije. (E) Povećanje BiFC fluorescencije sa starenjem. Bijele strelice ukazuju na BiFC signale u neuronima, a crvene strelice ukazuju na inkluzije u ždrijelu. Mjerne trake: 200 mm. (F) Kvantifikacija BiFC fluorescencije u (E) i V1SCSV2 dvostrukoj transgenoj integriranoj liniji. Korišteno je dvadeset pet crva iz svake linije; , P < 0,001. (G) Nervni procesi koji eksprimiraju DsRed analizirani su na neurodegeneraciju. Skala bar: 200 mm. (H) 3-dimenzionalna rekonstrukcija aksonskih procesa iz URA motornog neurona koji sadrži DsRed fluorescenciju. N, normalni aksonski proces; F, fragmentirani aksonski proces. "Fragmentirano" predstavlja potpunu degeneraciju nerava. Skala bar: 40 mm. (I i J) Blebbing fenotip. Postotak crva koji imaju mjehuriće na d 8 (I) i fenotip mjehurića sa starenjem (J). Trideset crva iz svake linije korišteno je n D 3; , P < 0,05; , P < 0,01. (K) Fragmentacija aksonskog procesa na d 8. Korišteno je trideset crva iz svake linije, n D 3; , P < 0,05. (L) Brzina faringealnog pumpanja sa starenjem; Korišteno je 25 crva iz svake linije, vrijednosti P su navedene u tabeli S1. (M) Analize životnog vijeka. Korišteno je 150 crva za svaku liniju, P vrijednosti su navedene u Tabeli S2.

Slika 2. Efekti daf-2, daf-16 mutanata na SNCA prijenos sa ćelije na ćeliju. (A i B) BiFC fluorescencija u mutantima povezanim sa starenjem, daf-2(e1370) i daf-16(mu86) (vidi također sliku S2D) . Mjerne trake: 200 mm (A). Dvadeset crva za svaku liniju korišteno je n D 3; , P < 0.05; , P < 0.01; , P < 0.001. (C i D) Procenat crva koji imaju BiFC-pozitivne inkluzije sa starenjem (videti takođe sliku S2E). Dvadeset crva za svaku liniju korišteno je n D 3; , P < 0,05; , P < 0,01. (E i F) Kvantifikacija broja aksonskih mjehurića (E) i fragmentacije nerva (F) na d 8 (vidi također slike S2F i G). Dvadeset crva za svaku liniju korišteno je n D 3; , P < 0,05; , P < 0,01. (G) Brzine faringealnog pumpanja na d 13 (vidi takođe sliku S2H). Dvadeset crva za svaku liniju korišteno je n D 3; , P < 0,01. (H) Analize životnog vijeka (vidi također sliku S2I). Korišteno je tri stotine crva za svaku liniju, P vrijednosti su navedene u Tabeli S2.

Učinci farmakološkog tretmana protiv starenja na transcelularni SNCA prijenos

Zatim smo pokušali da utvrdimo efekte agensa protiv starenja, N-acetilglukozamina (GlcNAc),12 na prenos agregata. Kada je GlcNAc primijenjen na V1SCSV2 i daf-16 (mu86); V1SCSV2 životinje, obje životinje su pokazale smanjeno formiranje BiFC-pozitivnih inkluzijskih tijela (sl. 3A i B) i značajno ublažene fenotipove za degeneraciju živaca (sl. 3C do F), ponašanje pumpanja (slika 3G) i životni vijek (sl. 3H). Ovi rezultati sugeriraju da farmakološki tretmani protiv starenja mogu usporiti napredak sinukleinopatije

Promjene u stabilnom stanju poliubikvitiniranih proteina tretmanom protiv starenja

Da bismo potvrdili mikroskopske podatke za promjene u nivoima agregata, izvršili smo dot blot analizu sa antitijelima specifičnim za SNCA multimere bogate b-listovima (Syn-O2).13 U skladu sa analizom inkluzije BiFC, dot blot analiza je pokazala da su SNCA agregati bogati b-listom smanjeni daf-2 mutacijom i GlcNAc, dok je daf-16 mutacija povećala agregate (sl. 4A i B). Starenje uzrokuje progresivni pad homeostaze proteina.12,14,15 Ovo nas je navelo da ispitamo stabilne nivoe poliubikvitiniranih proteina, koji predstavljaju aktivnosti glavnih sistema degradacije proteina, kao što je sistem ubikvitin-proteazom i autofagija. Nivoi poliubikvitiniranih proteina su povećani kod daf-16 transgenih životinja, dok su smanjeni kod daf{16}} transgenih životinja (slike 4C do F). Slično, tretman životinja sa GlcNAc smanjio je nivoe poliubikvitiniranih proteina (slike 4G do J). Ovi rezultati sugeriraju da su efekti tretmana starenja i anti-aging tretmana na propagaciju sinukleinopatije posredovani promjenama u kapacitetu sistema za razgradnju proteina.

Slika 3. Efekti GlcNAc u transcelularnom SNCA prijenosu. (A) Promjene u BiFC fluorescenciji sa tretmanom GlcNAc na d 13. Bijele strelice ukazuju na BiFC signale iz neurona, a crvene strelice ukazuju na inkluzije u ždrijelu. Mjerne trake: 200 mm. (B) Crvi sa BiFC-pozitivnim inkluzijama su kvantitativni. Korišteno je trideset crva za svaku liniju. (C i D) Aksonalni bleb brojevi u V1SCSV2 (C) i daf-16(mu86); V1SCSV2 životinje (D) sa tretmanom GlcNAc na d 8. Dvadeset crva za svaku liniju korišteno je n D 5; , P < 0.05. (E i F) Fragmentacija nerva u V1SCSV2 (E) i daf-16(mu86); V1SCSV2 (F) transgene linije na d 8. Dvadeset crva za svaku liniju korišteno je n D 5; , P < 0,05. (G) Brzine faringealnog pumpanja na d 11. Korišteno je četrdeset crva za svaku liniju; , P < 0,05; , P < 0,01. (H) Analize životnog veka sa tretmanom GlcNAc. Korišteno je pet stotina crva za svaku liniju, P vrijednosti su navedene u Tabeli S2.

Endolizozomalni put u SNCA prijenosu

Prethodne studije na ćelijskim modelima su pokazale da je međućelijski prijenos SNCA posredovan endocitozom, a preneseni proteini se isporučuju u lizozome radi razgradnje.16-19 Kada je V1SCSV2 uveden u dinaminske mutante, dyn-1 (ky51), 20 BiFC fluorescencija je značajno smanjena u poređenju sa onom kod divljeg tipa (sl. 5A i B). Smanjenje BiFC signala kod dyn-1(ky51) transgenih životinja bilo je veće na d 5 nego na d 2, što sugerira da je efekat bio kumulativan. Naše prethodne studije su pokazale da je lizosomska funkcija važna za čišćenje "sjemena" u procesu međućelijske SNCA prijenosa, a lizosomska disfunkcija je rezultirala povećanjem prijenosa agregata.17,19,21 U skladu s ovim studijama, kada je V1SCSV2 uveden u mutanti asp-4 (ok2693) i asp-1(tm666), koji nose mutacije u genima katepsina,22 BiFC fluorescencija je značajno povećana kod oba mutanta, često u obliku inkluzijskih tijela (slika 5C do E; sl. S3D i E). Ovi rezultati sugeriraju da su lizosomski odgovori ključni za zaštitu životinja od razmnožavanja agregata ovisno o dobi. U skladu sa ovim tumačenjem, tretman GlcNAc je povećao ekspresiju lizozomalnih gena kao što su lamp-1/LAMP1, sul-3/ARSB i asp-1/ CTSD (sl. 4K i L). Ovo je dalje potvrđeno analizom epistaze, gdje je asp-4(ok2693); V1SCSV2 i asp-1(tm666); V1SCSV2 crvi su tretirani sa GlcNAc. Za razliku od crva V1SCSV2, fenotipovi povezani sa starenjem nisu spašeni tretmanom GlcNAc kod asp-1 i asp{41}} mutantnih transgenih životinja (slike 5F do J). Također smo analizirali ekspresiju sqst- 1/p62, ključne komponente autofagnog procesa, i činilo se da je njegova ekspresija pojačana, iako promjena nije pokazala statističku značajnost (sl. 4K i L).

Efekti tretmana protiv starenja na prijenos agregata povezani su s poboljšanom funkcijom lizosoma

Da bismo potvrdili ulogu lizosoma u zaštiti od razmnožavanja agregata, generirali smo visoke-30 transgene linije koje prekomjerno eksprimiraju vektor hlh-30p::hlh-30, 14 ortolog TFEB-a, glavnog kontrolni faktor transkripcije za biogenezu lizosoma,23 u daf-16(mu86); V1SCSV2 transgene životinje (slika S4A). Pored lizosomalnih i autofagičnih gena, nizvodni ciljni geni za HLH-30/TFEB uključuju gene uključene u metabolizam, apoptozu i signalizaciju.24 Ekspresija hlh-30p::hlh-30 u daf-16(mu86); V1SCSV2 životinje su povećale ekspresiju lizosomalnog gena, asp-1 kao i gena uključenog u autofagiju, sqft-1 (slika 6A), i smanjile i stabilne nivoe poliubikvitiniranih proteina (sl. 6B do E), koji ukazuju na obnavljanje degradacije proteina i formiranje SNCA agregata (slika 6F). Visoke-30p::hlh- 30 transgene linije pokazale su smanjen BiFC signal (dakle, smanjenu propagaciju agregata), smanjenu degeneraciju živaca, povećanu brzinu pumpanja i produžen životni vijek (sl. 7A do H; sl. S4B do D).

Slika 4. Promjene u stacionarnim razinama poliubikvitiniranih proteina potretman protiv starenja. (A i B) Nivoi SNCA agregata (Syn-O2) u linijama povezanim sa starenjem i sa tretmanom GlcNAc. Podaci su normalizovani na ukupnu SNCA ekspresiju (274). Agg, SNCA agregati; Ukupna, ukupna SNCA ekspresija, n D 3 (A), n D 5 (B); , P < 0.{{20}}5. (C i D) Nivoi poliubikvitiniranih proteina u modelima povezanim sa starenjem. (E i F) Kvantifikacija nivoa u frakcijama Tx-sol (E) i Tx-insole (F). Nivoi su bili najviši u daf-16(mu86); V1SCSV2 linije. Tx-sol, Triton-topiv; Tx-uložak, Triton-netopljiv, n D 3; , P < 0.05. (G i H) Nivoi poliubikvitiniranih proteina sa tretmanom GlcNAc u modelima povezanim sa starenjem. (I i J) Kvantifikacija nivoa u frakcijama Tx-sol (I) i Tx-insole (J). n D 5; , P < 0,05. Sva linija na desnoj strani zapadnih slika označava kvantificirani raspon veličina u mrljama. Svi podaci su normalizovani na ACTB ekspresiju. (K i L) Nivoi ekspresije autofagijskih i lizozomalnih gena u V1SCSV2 (K) i daf-16(mu86); V1SCSV2 životinje (L) sa tretmanom GlcNAc izmjerenim qPCR. n D 5; , P < 0,05; , P < 0,01.

Slika 5. Učešće endolizozomalnih puteva u SNCA prijenosu. (A i B) BiFC fluorescencija u divljim i dyn{2}}(ky51) transgenim linijama. Mjerne trake: 200 mm (A). Korišteno je dvadeset i četiri crva za svaku liniju; , P < 0.01; , P < 0,001. (C do E) BiFC fluorescencija i formiranje inkluzijskih tijela kod divljeg tipa, asp-4(ok2693) i asp-1(tm666) mutantnih crva (vidi također slike S3D i E). Skala šipki: 200 mm (C). Dvadeset crva za svaku liniju korišteno je n D 3; , P < 0,05; , P < 0,01. (F do J) Analiza epistaze transgenih crva asp-4 i asp-1 sa tretmanom GlcNAc. (F i G) Nivoi poliubikvitiniranih proteina uz tretman GlcNAc. (H i I) Kvantifikacija nivoa u frakcijama Tx-sol (H) i Tx-insole (I). (J) Nivoi SNCA agregata sa GlcNAc tretmanom. Podaci su normalizovani na ACTB (F i G) i ukupnu SNCA ekspresiju (J), n D 3, ns: nije značajno.

Ćelijsko autonomna agregacija naspram međućelijske transmisije Gore prikazani rezultati ne prave razliku između međućelijske agregatne transmisije i ćelijske autonomne agregacije. Da bismo riješili ovaj problem, generirali smo 4 transgene linije koje eksprimiraju samo V1S ili SV2 u N2 i daf-16(mu86) mutantnim crvima. Također, generirana su 2 transgena crva koji prekomjerno eksprimiraju hlh-30p::huh-30 transgen sa V1S ili SV2. Nivoi ekspresije su normalizovani PCR jednom crvom i western analizom (u slučaju V1S linija) ili DsRed fluorescencijom (u slučaju SV2 linija). Degeneracija nerva, ponašanje pumpanja i životni vijek transgenih crva u mutantnoj pozadini upoređeni su s onima u normalnom genetskom porijeklu. Nismo pronašli značajne razlike u fenotipovima (sl. S5C do G), što sugerira da genetska modifikacija koju smo istraživali nema veliki utjecaj na SNCA agregaciju u odgovarajućim tkivima (slika S5H).

Slika 6. Obnavljanje funkcije lizozomske degradacije transgenom ekspresijom hlh-30phlh-30. (A) Nivoi ekspresije gena povezanih s autofagijom i lizozomskih gena mjereni qPCR-om. n D 3; , P < 0.05. (B i C) Nivoi poliubikvitiniranih proteina u daf-16(mu86); V1SCSV2 u prisustvu ili odsustvu transgena visokog{11}}phlh- 30. (D i E) Kvantifikacija nivoa u triton-rastvorljivim (D) i triton-nerastvorljivim (E) frakcijama. Kvantificirani rasponi veličina označeni su linijom s desne strane u mrljama. Svi podaci su normalizovani sa ACTB, n D 3; , P < 0.05. (F) Nivoi SNCA agregata u visoko-30p::hlh-30 transgenim linijama. Podaci su normalizovani na ukupnu SNCA ekspresiju, n D 3; , P < 0,05.

Također smo tretirali ekspresijske linije jednog tkiva koje nose samo V1S ili SV2 u N2 i daf-16(mu86) mutantnim crvima sa GlcNAc i uporedili istu bateriju fenotipskih testova sa netretiranim životinjama. Za razliku od modela transmisije, ekspresijske linije jednog tkiva nisu pokazale značajne promjene u patogenim fenotipovima nakon tretmana s GlcNAc (sl. S6D do M). Da bismo ispitali efekte GlcNAc na nivoe ekspresije SNCA, izmerili smo nivoe SNCA metodom dot blot (sl. S6N i O). Podaci su pokazali da nivoi ekspresije nisu promenjeni tretmanom GlcNAc. Također smo ispitali neuronsku ekspresiju promotora muhe-21 nakon tretmana GlcNAc praćenjem DsRed-a. Ekspresija DsRed-a bila je strogo ograničena u neuronskim ćelijama sa ili bez tretmana GlcNAc (Slika S6P), što ukazuje da tretman ne menja specifičnost ćelijskog tipa promotora. Konačno, ispitali smo rastvorljivost SNCA u deterdžentu u pojedinačnim (V1S ili SV2) i dvostrukim (V1SCSV2) transgenim crvima sa ili bez tretmana GlcNAc. Triton X-100-odnos netopivih i rastvorljivih je drastično povećan kod dvostrukih transgenih u poređenju sa pojedinačnim transgenim, iako je nivo ekspresije svakog proteina navodno isti (sl. 8A do E; sl. S8). Ovaj rezultat implicira transcelularno agregatno pojačanje između faringealnog mišića i povezanih neurona. Dot blot sa Syn-O2 antitijelom specifičnim za agregate pokazao je slične rezultate, potvrđujući da je dvostruki transgenik proizveo mnogo više agregata od zbroja svakog pojedinačnog transgenog (slika 8F). Još jedna važna stvar ovdje je da je jedan transgenik zaista proizveo SNCA agregate. Ovo potvrđuje da dolazi do autonomne agregacije ćelije, tako da se prijenos agregata može pokrenuti. U eksperimentu rastvorljivosti deterdženta, odnos nerastvorljivog i rastvorljivog u tritonu nije se promenio nakon tretmana GlcNAc kod pojedinačnih transgenika, dok je isti tretman značajno smanjio odnos (slika 8C prema E; slika S8), što sugeriše da anti-aging tretman je prvenstveno uticao na proces transmisije, a ne na de novo agregaciju svakog proteina. Dot blot analiza sa Syn-O2 antitelom pokazala je uglavnom iste rezultate (slika 4B; slika S6N). Ovi rezultati sugeriraju da tretmani protiv starenja i pro-lizosomski tretmani korišteni u trenutnoj studiji imaju svoje efekte na prijenos međućelijskog agregata.

Pitajte za više:

E-pošta:wallence.suen@wecistanche.com Whatsapp plus 86 15292862950