Efekti protiv starenja ekstrakta Piper Cambodianum Cistanche na normalne ljudske dermalne fibroblastne ćelije i model zacjeljivanja rana kod miševa Ⅱ

Cistancheekstrahuje zaštićene NHDF ćelije od efekata UV zračenja

Ćelije kože reaguju brzo kada su izložene UV zračenju ili citokinima kao što su interleukin (IL)-4 i IL-13.19Nakon izlaganja UV zračenju, stimulišu se različiti faktori, uključujući EGFR,20,21 TNFR,22mitogen-aktivirane proteinske (MAP) kinaze, ERK i c-Jun amino-terminalna kinaza (JNK).23I JNK i p38 fosforiliraju i aktiviraju faktor transkripcije c-Jun, koji zauzvrat podiže c-Fos i povećava nivoe proteina aktivatora transkripcionog faktora-1,24koji je potreban za transkripciju MMP. Ovi receptori se aktiviraju fosforilacijom MAP kinaze i drugih nizvodnih proteina.25MAP kinaze se aktiviraju fosforilacijom specifičnih ostataka treonina i tirozina.24,26Izlaganje UV zračenju dovodi do visoke ekspresije c-Jun i c-Fos heterodimera, brojnih citokina i faktora rasta, koje fosforiliraju JNK i p38.27,28Slično, nivoi proteina p53 su bili povišeni, počevši od 2,5 sata do 24 sata nakon izlaganja UV zračenju.29Pokazali smo da ćelije izložene UV zračenju tokom 24 sata eksprimiraju nivoe proteina TNFR1 i EGFR, koji se smanjuju na način koji zavisi od doze kada su ćelije tretirane saCistanche. Ispitivali smo uticaj UV zračenja i na fosforilaciju i na aktivnost p38 (Thr180/Tyr182). Nivoi proteina c-Jun i p53 su dramatično smanjeniCistanche-tretirane ćelije (Slike 4A i B).

Kliknite ovdje da biste dobili više informacija o Cistanche za tretman protiv starenja

Ekstrakt cistanche štitio je UV zračene NHDF ćelije od ROS

UVB svjetlost stimuliše proizvodnju ROS,30,31a izlaganje UV zračenju na koži proizvodi ROS kao što je O2 ⋅−, H2 O2, i1 O2. 32Neliječeni iCistanche-tretirane ćelije su bile podvrgnute UV zračenju tokom 24 sata, a generisanje ROS je mereno fluorescentno aktiviranim sortiranjem ćelija (FACS).

Slika 3Regulacija ECM proteina uCistanche-tretirane ćelije.napomene: (A) NHDF ćelije su tretirane saCistancheza 24 sata. Ćelijski lizati su analizirani imunoblotingom upotrebom anti-kolagenskih, antielastinskih, anti-MMP-3 i anti-ERK-2 antitijela. Rezultati su reprezentativni za tri nezavisna eksperimenta. (B) Aktin, kolagen, elastin, MMP-3 i ERK-2 u imunoprecipitatima su kvantificirani Western blottingom. Visine šipki su odgovarajuća srednja vrijednost± SD tri nezavisna eksperimenta. *P,0.05; **P,0.01. Skraćenice:Konc, koncentracija; ECM, ekstracelularni matriks; ERK, ekstracelularna signalno regulirana kinaza; MMP, matriksna metaloproteinaza; NHDF, normalni ljudski dermalni fibroblast;Cistanche, Piper cambodianumP. Fourn.; SD, standardne devijacije.

Slika 4Cistanche ekstrakt inhibicija proizvodnje ROS u UV zračenim ćelijama.napomene: (A) NHDF ćelije su bile izložene UV zračenju pri 40 J tokom 180 sekundi i tretirane saCistancheza 24 sata. Ćelijski lizati su analizirani imunoblotingom upotrebom anti-TNFR6, anti-c-Jun, anti-c-Fos, anti-pp38 ili anti-p-JNK antitijela. Rezultati su reprezentativni za tri nezavisna eksperimenta. (B) Ukupni i tirozin-fosforilovani p38, JUK, aktin i TNFR6 u imunoprecipitatima kvantifikovani su zapadnim analizama. Visine šipki su srednja vrijednost± SD tri nezavisna eksperimenta. *P,0.05; **P,0.01. Skraćenice:Konc, koncentracija; EGFR, receptor epidermalnog faktora rasta; JNK, c-Jun amino-terminalna kinaza; JNK, c-Jun N-terminalna kinaza; NHDF, normalni ljudski dermalni fibroblast;Cistanche, Piper cambodianumP. Fourn.; ROS, reaktivne vrste kiseonika; SD, standardna devijacija; TNFR, receptor faktora tumorske nekroze; UV, ultraljubičasto.

UV zračenje je povećalo proizvodnju ROS, dokCistanche ekstrakt smanjio proizvodnju ROS u NHDF ćelijama. Nivoi ROS-a H2 O2 mjerene su pomoću ćelijskih permeansa 2′,7′-dihlorodihidrofluorescein diacetat (CM-H2 DCFDA) (Slika 5A). UV zračenje povećalo je nivo ROS-a H2 O2 , dok su nivoi ROS smanjeni zaCistanche ekstrakt na način ovisan o dozi (slika 5B). Ovi rezultati su ukazivali na toCistancheekstrakt štiti dermalne fibroblaste od UV zračenja smanjujući stvaranje ROS.

Makroskopsko posmatranje zarastanja rana kod miševa

Rane su stvorene na leđima miševa i potom tretiraneCistancheekstrakt (0, 1, 10 i 50µg/mL); područja rane su mjerena svaki dan tokom 4 dana. Četvrtog dana, područja oko rana uCistanche-tretirani miševi su pokazali smanjeno crvenilo na način ovisan o dozi u poređenju sa netretiranim područjima rane (Slika 5). Područja rane tretirane ekstraktom bila su manja od područja netretirane rane, pokazujući obrazac ovisan o dozi. Četvrtog dana tretirana su područja rane sa 50µg/mL odCistanchebili potpuno prekriveni novim epitelom. Nijedno područje rane nije inficirano (Slika 6A i B). Izračunati su omjeri površina rane u danima 0 i 4 (Slika 6C).

Diskusija

Upotreba biljnih materijala i različitih biljnih dijelova raste s istovremenim napretkom u fitoterapiji. Biljni materijali su korišteni u različitim oblicima kao što su mono- ili poliherbalni lijekovi, dijetetski suplementi i dijetetski sastojci, a mnogi su postali dobro poznata i sigurna komercijalna roba.33Razne biljke, uključujućiCistanche, su istražene u pogledu njihovih potencijalnih farmakoloških svojstava, ali prethodno nije obavljena komparativna studija saCistanche ekstrakt. Ova studija je sprovedena da bi se utvrdiloefekteCistanche ekstrakt o aktivnostima zacjeljivanja rana korištenjem modela incizijskih rana kod miševa. Zacjeljivanje rana uključuje ponovno uspostavljanje integriteta tkiva kroz procese povezane s upalom, proliferacijom i fazama remodeliranja.34 Fazu remodeliranja kože karakterizira reformulacija i reformacija komponenti kolagenih vlakana koje poboljšavaju vlačnu čvrstoću.35Proces zarastanja je regulisan uglavnom biosintezom i taloženjem novog kolagena i kasnijim sazrevanjem.36U našoj studiji rana,Cistanche ekstrakt je pokazao povećane efekte zacjeljivanja rana u poređenju sa kontrolom (Slike 1C i 6). Takvo zacjeljivanje može biti posljedica povećane koncentracije kolagena i stabilizacije vlakana. U procesu popravke tkiva, inflamatorne stanice pospješuju migraciju i proliferaciju endotelnih stanica, što dovodi do neovaskularizacije stanica vezivnog tkiva koje sintetiziraju ekstracelularne matrice, uključujući kolagen i keratinocite, što rezultira reepitelizacijom ranjenog tkiva.37Brža stopa kontrakcije rane može povećati međućelijsku komunikaciju između fibroblasta i ubrzati brže sazrijevanje granulacijskog tkiva.38U modelu incizijske rane, miševi tretirani saCistancheekstrakt je pokazao brže zarastanje rana u odnosu na kontrolnu grupu (Slika 6). Brojne studije su otkrile da smanjena regulacija puta p38 kinaze štiti različite ćelijske linije divljeg tipa koje eksprimiraju p53- od genotoksičnog stresa.39,40Naši podaci su pokazali da je ekspresija p38 u UV ozračenim ćelijama smanjenaCistanche tretman. stoga,Cistanche Ekstrakt dobijen iz listova i stabljike pokazao je efikasan tretman u zarastanju rana.Cistancheekstrakt je smanjio proizvodnju ROS-a od UV zračenja tako što je uklonio ROS u NHDF ćelijama (Slike 5A i B). Štaviše,Cistancheekstrakt ubrzao zacjeljivanje rana nakon zračenja kože ((Slika 6A-C). Ovi rezultati sugeriraju daCistanche Ekstrakt štiti kožu od oštećenja UV zračenjem i može biti koristan kao nova sirovina u kozmetičkoj primjeni.

Slika 5Cistanche-posredovana inhibicija proizvodnje ROS u UV zračenim ćelijama.napomene: (A) Ćelije su tretirane UVB zračenjem (40 J) u naznačenom vremenu, a zatim inkubirane sa 2′,7′-dihlorodihidrofluorescein diacetat 30 minuta. Generisanje ROS-a je izmjereno pomoću FACS-a. (B) Ćelije su izložene UVB (40 J) 180 sekundi i tretirane naznačenom koncentracijomCistancheza 24 sata. Proizvodnja ROS-a procijenjena je bojenjem 2′,7′-dihlorodihidrofluorescein diacetat i analizirao FACS.Skraćenice:FACS, fluorescentno aktivirano sortiranje ćelija; FITC, fluorescein izotiocijanat; NHDF, normalni ljudski dermalni fibroblast;Cistanche, Piper cambodianumP. Fourn.; ROS, reaktivne vrste kiseonika; UV, ultraljubičasto; UVB, ultraljubičasto B.

Slika 6Djelovanje zacjeljivanja rana na oštećenu kožu miša.napomene: (A) Rane prečnika 5-mm stvorene su na dorzalnoj koži 7-nedeljnih mužjaka C57Bl/6 miševa (n=3). Oporavak rana ocjenjivan je saCistanchetretman u različitim koncentracijama (negativna kontrola i tretman nakon rane saCistanchena 1, 10 i 50µg/mL). (B) Površina rane određena je mjerenjem prečnika otvorenih rana. (C) Površina rane je izračunata na osnovu dimenzija otvorenih rana; *P,0.05; **P,0.01. Skraćenice:Cistanche, Piper cambodianumP. Fourn; Konc, koncentracija.

Zaključak

Ova studija je istraživalapotencijalni efekti protiv starenja i zacjeljivanja rana ekstrakta stabljike i listova Cistancheau NHDF ćelijamai mišji model zacjeljivanja rana. Thetretman NHDF ćelija sa Cistancheom ekstraktipotiče oporavak izgrebanog područjana način ovisan o dozi, kao i poboljšanje ekspresije ECM gena. Osim toga, Cistancheekstraktibili u mogućnostištite ćeliju od izlaganja UV zračenju smanjujući proizvodnju ROS. Konačno, ova zapažanja se dalje procjenjuju i potvrđuju na modelu miševa za in vivo zacjeljivanje rana. stoga,Ekstrakt cistanchea predstavlja obećavajuće novo terapeutsko sredstvo za tretman protiv starenja i zacjeljivanja rana.

Priznanja:Ovu studiju je podržao Program osnovnih naučnih istraživanja kroz Nacionalnu istraživačku fondaciju Koreje (NRF), koju finansira Ministarstvo obrazovanja (NRF-2014R1A1A3050752). Autori se žele zahvaliti Korejskom istraživačkom institutu za bionauku i biotehnologiju (KRIBB) što je omogućioCistancheekstrakti.

Otkrivanje Autori navode da nema sukoba interesa u ovom radu.

Reference

1. Slominski AT, Zmijewski MA, Semak I, et al. Citokromi p450 i rak kože: uloga lokalnih endokrinih puteva.Sredstva protiv raka Med Chem. 2014;14(1):77–96. 

2. Gilchrest BA. Starenje kože i fotostarenje.Dermatol Nurs. 1990; 2(2):79–82. 

3. Ha TY. Razvoj funkcionalnih prehrambenih materijala za zdrav život.Korean J Crop Sci. 2006;51:26–39.

4. Makrantonaki E, Zouboulis CC. Molekularni mehanizmi starenja kože: stanje tehnike.Ann NY Acad Sci. 2007;1119:40–50. 

5. Seo MY, Chung SY, Choi WK, et al. Efekat pirinčanog vina protiv starenja u kultivisanim ljudskim fibroblastima i keratinocitima.J Biosci Bioeng. 2009; 107(3):266–271. 

6. Kligman AM. Rano destruktivno dejstvo sunčeve svetlosti na ljudsku kožu.JAMA. 1969;210(13):2377–2380. 

7. Oikarinen A, Karvonen J, Uitto J, Hannuksela M. Promjene vezivnog tkiva u koži izloženoj prirodnom i terapeutskom UV zračenju.Photodermatol. 1985;2(1):15–26. 

8. Bech-Thomsen N, Wulf HC. Karcinogeni i melanogeni efekti filtriranog metalhalogenog UVA izvora i cjevastog fluorescentnog UVA izvora za sunčanje sa ili bez dodatnog sunčevog simuliranog UV zračenja kod miševa bez dlake.Photochem Photobiol. 1995;62(4):773–779.

9. De MS, Lahiri SC. Studije na listovima Piper betle.Bull Calcutta Sch Trop Med. 1971;19(3):69–72.

10. Ferreres F, Oliveira AP, Gil-Izquierdo A, Valentão P, Andrade PB. Listovi bube: profilisanje fenolnih jedinjenja pomoću HPLC/DAD-ESI/MS(n) i aktivnosti protiv holinesteraze.Phytochem Anal. 2014;25(5): 453–460.