Derivati ​​anastatina ublažavaju ishemijsko-reperfuzijsku ozljedu miokarda putem antioksidativnih svojstava

Za dodatne informacije kontaktirajtetina.xiang@wecistanche.com

Abstract:(±)-Anastatini A i B su flavonoidi izolovani iz Anastatica hierochuntica. U prethodnoj studiji, dizajnirana su dvadeset četiri di- i tri-supstituirana nova derivata anastatina i procijenjena njihova preliminarna antioksidativna aktivnost. U ovoj studiji dalje je proučavan zaštitni efekat ishemije miokarda-reperfuzije (I/R) i sistematski antioksidativni kapacitet 24 derivata. Jedinjenje 13 bilo je najmoćnije među svim proučavanim jedinjenjima, što je povećalo preživljavanje H9c2 ćelija na 80,82 posto. Antioksidativna sposobnost jedinjenja 13 procijenjena je u antioksidativnoj moći redukcije željeza, uklanjanju radikala 2,2'-azino-bis (3-etilbenzotiazolin-6-sulfonske kiseline) i 2,2-difenil{ {20}}pikrilhidrazil testovi. Uočeno je da jedinjenje 13 značajno smanjuje infarktna područja i poboljšava histopatološke i elektrokardiogramske promjene kod pacova s ​​I/R ozljedom miokarda. Štaviše, spoj 13 je smanjio stope curenja serumske laktat dehidrogenaze, kreatin kinaze i malonil dialdehida iz tkiva miokarda štakora i povećao nivo aktivnosti glutationa i superoksid dismutaze nakonI/R povreda miokardakod pacova. Uzeto zajedno, zaključili smo da jedinjenje 13 ima moćne kardioprotektivne efekte protiv oštećenja miokarda I/R, kako in vitro tako i in vivo, zbog svojih ekstenzivnih antioksidativnih aktivnosti.

Ključne riječi: derivati ​​flavonoida; H9c2 ćelije; hipoksija/reoksigenacija; kardioprotektivni efekti

Kliknite ovdje za više informacija o proizvodu

1. Uvod

Ishemijska bolest srca (IBS) je vodeći uzrok smrti u svijetu [1]. Pravovremena obnova protoka krvi može efikasno poboljšati klinički ishod bolesti; međutim, reperfuzija nije bez rizika zbog obima ćelijskog oštećenja uzrokovanog samom reperfuzijom. Stoga je izuzetno važno razviti efikasne terapijske strategije protiv ishemijsko-reperfuzijske (I/R) ozljede miokarda [2]. Mehanizam I/R povrede miokarda je veoma komplikovan; uključuje apoptozu, oksidativni stres [3], preopterećenje kalcijem [4] i upalu [5].Oksidativni stresmože dovesti do apoptoze kroz različite puteve transdukcije signala, uključujući signalno reguliranu kinazu (ERK), c-Jun amino-terminalnu kinazu (JNK), aktivaciju p53 (tumorski protein p53) i varijantu p66shc. Štaviše, prekomjerna proizvodnja reaktivnih vrsta kisika (ROS) može uzrokovati nepovratno oštećenje staničnih membrana i ćelijskih molekula, kao što su DNK, nukleinske kiseline, proteini, lipidi i pokrenuti lančane reakcije, dodatno oštećujući tkivo miokarda. Oksidativni stres [6], koji je uzrokovan neravnotežom između formiranja slobodnih radikala i uklanjanja ROS-a, igra važnu ulogu u patogenezi I/R ozljede I. Stoga se strategije koje štite miokard od oksidativnog stresa veoma razmatraju u liječenju I/R ozljede miokarda. Stoga su, zbog svojih potencijalnih sposobnosti uklanjanja slobodnih radikala, strategije zasnovane na antioksidansima korisne u zbrinjavanju I/R ozljeda.

U kliničkim studijama antioksidansi se koriste za smanjenjeI/R povreda miokardauglavnom se dijele na dvije vrste: enzimske i neenzimske. Enzimi kao što su katalaza i glutation peroksidaza smanjuju koncentraciju vodikovog peroksida kako bi spriječili oštećenje stanica; neenzimski antioksidansi kao što su vitamin E, vitamin C, -karoten, itd., slabe reakciju tkiva na oksidativni stres kako bi smanjili oštećenje tkiva i promovirali funkcionalnu popravku. Međutim, primjena oba trenutno ima određena ograničenja. Velika molekulska masa enzimskih preparata ne pogoduje apsorpciji [8]. Postoje i određeni problemi sa stabilnošću neenzima, što dovodi do slabe stabilnosti lijekova, pa se oni lako oksidiraju [9].Flavonoidi, kao vrsta neenzimskih antioksidansa, za koje se navodi da posjeduju niz moćnih svojstava, uključujući antioksidans, antikancer, antiapoptotičku i kardiovaskularnu zaštitu [10]. Oni sprečavaju stvaranje visoko reaktivnih oksida i inhibiraju oksidativne reakcije uklanjanjem ROS, kao što su vodikovi radikali i peroksinitrit. Anastatini A i B [11] su flavonoidi sa hepatoprotektivnim djelovanjem. Anastasius A i B su aktivne komponente u Anastatica hierochuntica (podtip Anastatica, porodica Brassicaceae). Trenutno postoji vrlo malo izvještaja o hemijskoj sintezi i strukturnim modifikacijama anastatina A i B. Godine 2003. izolovana su aktivna jedinjenja iz Anastatica hierochuntica i otkriveno je da imaju hepatoprotektivne efekte protiv citotoksičnosti izazvane D-galaktozaminom u primarno kultivisanim hepatocitima miša. Nakashima i Eman su također pokazali da spojevi pokazuju in vitro antioksidativno i antikancerogeno djelovanje. Međutim, farmakološki efekti anastatina A i B i njihovih derivata, kao i postupci njihove sinteze, ostaju nejasni. Stoga smo željeli sintetizirati anastatine A i B i neke od njihovih derivata i procijeniti ih na antioksidativno djelovanje u hipoksiji/reoksigenacija(H/R) model, koji je efikasan za proučavanje I/R povrede miokarda [12].

U prethodnoj studiji, sintetizirali smo anastatine A i B i njihove analoge i procijenili njihove antioksidativne kapacitete koristeći model stanične kulture oksidativnog oštećenja izazvanog H2O2 (vodikov peroksid)13. Naši prethodni rezultati su pokazali da anastatini A i B imaju moćne hepatoprotektivne aktivnosti koje su povezane s njihovim antioksidativnim sposobnostima.

U ovoj studiji, anastatini A i B i 24 njihova derivata su sintetizirani i procijenjeni na antioksidativne sposobnosti korištenjem testova smanjenja snage i uklanjanja radikala. Pored toga, korišćeni su jednostavni model H9c2 ćelija H/R i pacovski model I/R povrede miokarda za procenu kardioprotektivnih efekata jedinjenja.

2. Rezultati

2.1. Uspostavljanje modela H/R

Koncentracija tretmana Na2S, O4 procijenjena je kao što je prikazano na slici 1A, a stopa preživljavanja H9c2 ćelija je smanjena sa povećanjem koncentracije Na2S2O4. Pod 4 mM Na, S, Oa, vitalnost ćelija se smanjila na manje od 50 posto (13,7,25, odnosno 43,4 posto, redom u vremenu reoksigenacije od 2,1 i 0 h) , a nivo smanjenja vitalnosti ćelija bio je niži. Stoga je 4 mM koncentracija Na2S2O4 korištena za oponašanje hipoksičnog tretmana. Slika 1B pokazuje da je tretman sa 4 mM Na2S2O4 tokom 2 h bez reoksigenacije (0 h) značajno smanjio vitalnost ćelije i ostao stabilan. Pod uslovom koncentracije od 4 mM NazS2O4 za 2 h oponašanja hipoksije, 2 h reoksigenacije smanjilo je stopu preživljavanja ćelija na 17,37 posto (slika 1C). Kao što je jasno prikazano na slici 1D, 10 μM resveratrola je preokrenulo smanjenu vitalnost ćelija uzrokovanu H/R, koja je bila snažnija od iste koncentracije galne kiseline (74,34 naspram 60,44 posto za galnu kiselinu).

Kao rezultat toga, model hipoksije/reoksigenacije je uspostavljen korištenjem Na2S, O4 u konačnoj koncentraciji od 4 mM za 2 h oponašanja hipoksije, nakon čega je uslijedila kultura u normalnom DMEM (Dulbecco-ova modifikacija Eagleove podloge)/visoka glukoza za oponašanje reoksigenacijske ozljede . Resveratrol u konačnoj koncentraciji od 10 μM korišten je kao pozitivna kontrola.

2.2. Anastatini i njihove derioacije poboljšavaju održivost ćelija H9c2 podvrgnutih H/R tretmanu

Prvo smo ispitali efekte anastatina A i B (Slika 2A, B) i njihovih derivata na vitalnost ćelija H9c2 u MTT(3-(4,5)-dimetiltiahiazo(-z-y1){{ 10}},5-di-fenitetrazolijumromid) test [13]. Jedinjenja 20a, 21a, 22a, 20b, 22b, 20c, 20c', 21c, 22c, 10 i 11 nisu bila značajno citotoksična za ćelije H9c2 (Slika 3A, B, Tabela S2). Anastatini A i B, njihovi derivati ​​i resveratrol (pozitivna kontrola) poništili su oštećenje ćelija izazvano hipoksijom (Slika 4). U grupi modela, vitalnost ćelija je smanjena na 20,31 posto, što je povećano na 82,68 posto resveratrolom, a anastatin A i jedinjenja 22b, 22c, 24b, 24c, 13 i 14 povećavaju stopu preživljavanja stanica na više od 70 posto ( 71,49,71.00, 76,50, 73,24, 77,57, 80,82 i 77,13 posto, respektivno). Stoga je spoj 13 (Slika 2C) imao najjači zaštitni učinak među derivatima anastatina od H/R ozljede i korišten je u kasnijim eksperimentima.

2.3. Jedinjenje 13 ublažava oštećenje ćelija izazvano H/R i oksidativni stres

Kako bi se istražio antioksidativni kapacitet spoja, trioksidativni stresindikatori, LDH (laktat dehidrogenaza), GSH (L-glutation) i SOD (superoksid dismutaza), odabrani su za procjenu antioksidativnog kapaciteta jedinjenja. LDH je stabilan citoplazmatski enzim prisutan u ćelijama miokarda, koji se brzo oslobađa iz medijuma za kulturu ćelije nakon povrede ćelijske membrane miokarda. Što je ozljeda ozbiljnija, to je viši nivo LDH u mediju kulture. Slika 5A pokazuje da 2 h hipoksije praćeno 2 h reoksigenacije značajno povećava oslobađanje LDH (478,98 U/L naspram 55,84 U/L u praznoj grupi, p<0.001), which="" was="" inhibited="" by="" resveratrol="" (284.07="" u/l="" vs.="" the="" model="" group=""><0.01) and="" compound="" 13(276.61="" u/l="" vs.the="" model="" group,=""><0.001).gsh can="" act="" as="" a="" hydrogen="" donor="" for="" glutathione="" catalase="" (cat),="" eliminating="" o2-="" and="" its="" derivatives="" in="" the="" organism,="" thereby="" cells="" are="" protected="" from="" oxidant="" damage.="" additionally,="" sod="" can="" catalyze="" the="" disproportionation="" of="" superoxide="" anions="" and="" protect="" cells="" from="" damage.="" as="" shown="" in="" figure="" 5b,="" c,="" compound="" 13="" significantly="" increased="" gsh="" release="" and="" sod="" activity=""><0.01）. it="" increased="" gsh="" level="" to="" 39.93="" μmol/gprot="" which="" was="" higher="" than="" the="" level="" in="" the="" model="" group="" （18.2="" μmol/gprot）="" but="" slightly="" lower="" than="" that="" in="" the="" resveratrol="" group.="" additionally,="" it="" reversed="" h/r-induced="" reduction="" in="" sod="" activity="" by="" increasing="" sodlevel="" from="" 12.00="" u/mgprot="" to="" 22.98="" u/mgprot.="" these="" findings="" demonstrate="" that="" compound="" 13="" has="" a="" protective="" effect="" on="" h9c2="" cells="" subjected="" to="" h/r="">

2.4. Antioksidativni kapacitet jedinjenja 13

Vitamin C(Vc) was used as an antioxidant control in order to evaluate the antioxidant effects of resveratrol and compound 13 intuitively. FRAP assay was used to evaluate the reducing power of the compound that can transfer ions from Fe3+ into Fe2+ to determine the antioxidant capacity of compounds. The results of the experiment showed that the reducing power of compound 13 was 354.80 mg/mmol, significantly stronger than the values obtained for the positive control Vc (127.47 mg/mmol) and resveratrol (261.91 mg/mmol) (Figure 6A).ABTS (2'-Azinobis-(3-ethylbenzthiazoline-6-sulphonate)and DPPH (2,2-Diphenyl-1-picrylhydrazyl) are stable free radicals insolvent, but when a radical scavenger is added to the solvent, the result is a reduction in the number of free radicals and the degree of reduction in the number of free radicals is directly proportional to the antioxidant capacity. Figure 6B, C show the ABTS and DPPH radical scavenging abilities of compound 13. The results indicate that compound 13 had the strongest scavenging activity on ABTS and DPPH with EC50 values of 1.38 and 0.07 mM, respectively. The antioxidant capacities of the compounds tested in all three antioxidant assays followed the same trend: compound 13>resveratrol. Stoga, antioksidativni kapacitet spoja 13 može biti veći od onih drugih tipičnih antioksidansa.

2.5. Učinci derivata anastatina 13 na ozljedu miokarda I/R kod pacova

2.5.1.Efekti spoja 13 na oksidativni stres i aktivnosti antioksidativnih enzima

Nivo oštećenja miokarda procijenjen je detekcijom markera oksidativnog stresa i aktivnosti antioksidativnih enzima. Procenjivani su efekti jedinjenja 13 na aktivnost MDA (malondialdehida) u tkivu miokarda, kao i na nivoe LDH, CK (kreatin kinaze), GSH i SODin serum. Kao što je prikazano na slici 7, I/R povreda je rezultirala povećanjem nivoa LDH (slika 7A) i CK (slika B) i značajnim smanjenjem aktivnosti GSH (slika 7C) i SOD (slika 7D) (p<0.001). the="" level="" of="" mda(figure="" 7e)increases="" after="" i/r="" injury,="" which="" is="" a="" critical="" diagnostic="" marker="" of="" i/r="" injury.="" however,="" pretreatment="" with="" a="" positive="" control="" drug="" and="" different="" concentrations="" of="" compound="" 13="" significantly="" alleviated="" these="" injuries.="" ldh="" activity="" obtained="" for="" the="" i/r="" model="" group="" was="" 771.37="" u/ml,="" which="" was="" remarkably="" decreased="" to="" 416.129="" u/ml="" under="" resveratrol="" treatment.="" in="" the="" high-and="" low-dose="" 13="" groups,="" ldh="" activity="" decreased="" to="" 408.05="" and="" 462.81="" u/ml,="" respectively="" similar="" trends="" were="" observed="" for="" other="" myocardial="" injury="" markers,="" including="" the="" level="" of="" ck,="" gsh,="" sod,="" and="" mda="" release.="" these="" results="" indicated="" that="" compound="" 13="" exerted="" protective="" effects="" against="" oxidative="" stress-induced="" i/r="" injury="" in="" a="" dose-dependent="">

2.5.2. Efekti spoja 13 na promjene na elektrokardiogramu (EKG) i otkucaje srca

Tipične promene EKG (elektrokardiograma) izazvane povredom miokarda I/R prikazane su na slici 8. U poređenju sa normalnim EKG (slika 8A), povreda miokarda I/R može izazvati povećanje amplitude ORS (deo elektrokardiografskog talasa) (slika 8B); fuzija QRS talasa i ST talasa (Slika 8C); elevacija ST segmenta (interval između S talasa i T talasa) (Slika 8D); i inverzija ST-segmenta (Slika 8E). Nakon 15 minuta LAD ligacije, QRS amplituda je značajno povećana sa oko 0,5 mV na 1,2 mV u grupi modela (Slika 9A), dok je manji porast QRS amplitude uočen u svim tretiranim grupama (od oko 0.4 mV do 1,0.8 i 0.6 mV za grupu resveratrola, niske doze 13 i visoke doze 13) (Slika 9B-D ). Dodatno, sličan trend je uočen i kod podvezivanja od 30 min. Tokom reperfuzije, QRS amplituda je počela da se smanjuje; međutim, QRS talas u grupi modela ostao je najviši u čitavom periodu. Nakon 20 min reperfuzije, amplituda QRS-a u grupi modela smanjena je na oko {{30}}.8 mV, vrijednost u tretiranoj grupi bila je oko 0,6,0,5, 0,5 mV za grupa resveratrola, niske doze 13, odnosno visoke doze 13. Sve u svemu, liječenje resveratrolom, niskom dozom 13 i visokom dozom 13, sve je smanjilo patološko povećanje amplitude QRS-a u usporedbi s modelnom grupom tokom ishemije i ranog procesa reperfuzije, što se može pripisati njihovoj zaštitnoj aktivnosti miokarda.

Uporedo sa praćenjem EKG-a, pomno su detektovane i promene u otkucajima srca. Kao što je prikazano u Tabeli S3, 30 minuta ligacije je dramatično smanjilo broj otkucaja srca u svim grupama, dok nisu otkrivene značajne razlike između bilo koje od tretiranih grupa i grupa modela. Nakon 2 sata reperfuzije, broj otkucaja srca se povećao, ali nisu nađene značajne promjene ni u jednoj od grupa.

2.5.3. Efekti jedinjenja 13 na infarktno područje i histopatološke promjene

Za procjenu stepena oštećenja miokarda, srčano tkivo je obojeno TTC-om (2,35-Trifeniltetrazolijum hlorid) i otkrivene su histopatološke promjene. Kao što je prikazano na slici 10, u lažnoj grupi, nisu primijećene promjene na miokardu nakon TTC bojenja, dok je skala od oko 30 posto bijelih infarktnih područja uočena u I/R grupi. U grupi sa resveratrolom i grupama sa niskim dozama 13, infarktna područja su značajno smanjena na oko 10 posto, a područje infarkta u grupama sa visokim dozama 13 je smanjeno na oko 5 posto. Slika 10 prikazuje rezultat ispitivanja bojenja HE (hematoksilin-eozin): povećanje srčanih ćelija, djelimično otopljene membrane i jezgra, te infiltracija inflamatornih ćelija uočena je u presjecima tkiva iz grupe modela. Međutim, predtretman spojem 13 značajno je ublažio ove histopatološke promjene. Rezultati TTC bojenja i HE bojenja su pokazali da spoj 13 može smanjiti infarkt miokarda izazvan I/R na način ovisan o dozi.

3. Diskusija

U cilju utvrđivanja potencijalne antioksidativne aktivnosti anastatina A i B, naša laboratorija je sintetizirala 24 derivata anastatina i izvršila preliminarnu analizu citotoksičnosti jedinjenja prema PC-12 i njihove citoprotektivne aktivnosti u oksidativnom oštećenju izazvanom HO [13] . U ovoj studiji smo uglavnom proveli dubinsku biološku evaluaciju 13 od 24 derivata s najjačim antioksidativnim djelovanjem.

U ovoj studiji, I/R povreda miokarda ustanovljena je u ćelijama H9c2 kroz indukciju H/R tretmanom. Rezultati studije su pokazali da su anastatini A i B i njihovi proučavani derivati ​​poboljšali vitalnost ćelija H9c2 nakon H/R tretmana. Utvrđeno je da je spoj 13 najmoćniji među 26 proučavanih spojeva i stoga je odabran za dalju evaluaciju. Aktivnosti LDH (markera ćelijske povrede), SOD i GSH (markeri oksidativnog stresa) otkrivene su u supernatantima ćelija H9c2 nakon H/R tretmana. Otkrili smo da je predtretman ispitivanim jedinjenjima značajno smanjio nivoe LDH i povećao nivoe SOD i GSH u ćelijama. Stoga smo pretpostavili da derivati ​​anastatina posjeduju kardioprotektivnu aktivnost koja se može pripisati njihovoj sposobnosti da suzbiju oksidativni stres. DPPH i ABTS testovi se koriste za procjenu moći uklanjanja radikala jedinjenja [14]. Kao rezultat toga, jedinjenje 13 ima visoku antioksidativnu moć, i uklanja ABTS i DPPH na niskim vrijednostima EC50, što dalje ukazuje na supresiju oksidativnog stresa. LAD ligacija je uobičajena metoda koja se koristi za uspostavljanje I/R modela miokarda. Procjenom amplitude QRS kompleksa prije ishemije, nakon ishemije i nakon reperfuzije, otkrili smo da predtretman jedinjenjem 13 može značajno ublažiti ventrikularnu aritmiju tokom ishemije i rane reperfuzije. Nadalje, spoj 13 je utjecao na infarktna područja i histopatološke promjene infarkta miokarda. Ovi rezultati, zajedno sa otkrićima da jedinjenje 13 potiskuje oksidativni stres i povećava nivoe antioksidativnih enzima u serumu štakora na način ovisan o dozi, pokazali su da jedinjenje 13 ima snažan efekat protiv povrede miokarda.

U zaključku, derivati ​​anastatina imali su moćne antioksidativne sposobnosti, pri čemu je jedinjenje 13 pokazalo najveću antioksidativnu aktivnost među testiranim spojevima. Mehanizmi odgovorni za efekat derivata anastatina na signalne puteve povezane sa oksidativnim stresom još uvek treba da se raspravlja. Astaksantin (podtip karotenoida) može pokupiti ROS i dodatno ublažiti ishemijsku/reperfuzijsku ozljedu [15]. Lijekovi s potencijalom da spriječe stvaranje ROS-a mogu biti obećavajući kod bolesti povezanih s oksidativnim stresom [4] kao što su ćelijska terapija i kardiovaskularne bolesti. Nadalje, ROS potiskuje hipoksičnu indukciju ekspresije ciljnog gena faktora induciranog hipoksijom -1 (HF-1), za koji se navodi da ima kardioprotektivni efekat na ishemijsko-reperfuzijsku ozljedu [16]. Pretpostavljamo da regulatorni protein ROS i HIF-1 može igrati ključnu ulogu u kardioprotektivnom učinku jedinjenja 13. Turnefolična kiselina B (TAB), koja je izvedena iz kineske biljne medicine, štiti od I/R ozljede miokarda [17 ]. Studija je otkrila važnu ulogu TAB-a u stresu endoplazmatskog retikuluma (ER), apoptozi i PI3K (fosfatidilinozitol 3 kinaza)/AKT (protein kinaza B) putevima u liječenju I/R ozljede miokarda. Drugi putevi, kao što je put protein-kinaze aktivirane mitogenom (MAPK) [18] i signalni put AMPK (Adenozin 5'-monofosfat-aktivirana protein kinaza) [19], također mogu biti uključeni u I/R ozljedu miokarda. Stoga je sljedeći korak započeti s ROS i HIF-1 regulatornim proteinima i koristiti TAB-posredovane puteve za istraživanje mehanizama pomoću kojih 13 ispoljava antioksidativni efekat i štiti I/R miokarda. Štaviše, eksperimente na ćelijskom nivou u ovoj studiji takođe treba izvesti na ljudskim ćelijskim linijama.

4. Materijali i metode

4.1. Ćelijska kultura

Ćelijska linija kardiomiocita H9c2 pacova kupljena je od Nanjing Kebai Biotechnology Company (Nanjing, Kina). Ćelije su uzgajane u DMEM/visokom nivou glukoze (Hyclone, SAD) i dopunjene sa 10 posto FBS (Lanzhou Minhai Biological Engineering co.LTD, Lanzhou, Kina) i 1 posto penicilina/streptomicina (Hyclone, Marlborough, MA, SAD) u vlažnoj inkubator na 37 stepeni sa 5 posto CO2.

4.2. Test vitalnosti ćelija

Vijabilnost ćelija je merena korišćenjem MTT testa. H9c2 ćelije su posađene u 96-ploču sa 1×10* ćelija/jažici tokom 24 h. Nakon toga, ćelije su tretirane anastatinima A i B i njihovim derivatima 48 h ili prethodno tretirane anastatinima A i B i njihovim derivatima nakon čega je uslijedio H/R tretman. Zatim je dodan MTT (20 μL/bunarić) i kultivisan na 37 stepeni tokom 4 h. Apsorbancija je izmjerena na 578 nm pomoću čitača mikroploča (Tecan, Infinite 50). Vijabilnost ćelija u slijepoj grupi smatrana je 100 posto.

4.3. Model hipoksije/reoksigenacije(H/R) i administracija lijekova

4.3.1.H/R model

NazS, O4 je korišten za oponašanje hipoksičnog stanja, koje reaguje sa [20] kiseonikom i smanjuje napetost kiseonika. Različitih sedam koncentracija 0.5, 1, 2, 3, 4, 5 ili 6 mM je sprovedeno da bi se odredile optimalne koncentracije Na2S, O4. Da bi se odabralo optimalno vrijeme hipoksije, kulture od 0.5, 1,2, 3 ili 4 h su provedene nakon tretmana otopinom Na2S2O4. Kultura u normalnom DMEM/sredstvu sa visokim sadržajem glukoze tokom 0, 1, 2, 3 ili 4 h je sprovedena da bi se oponašalo vreme reoksigenacije [21].

4.3.2. Uprava za lijekove

Za primjenu lijekova, anastatini A i B i njihovi derivati ​​(hemijske strukture u Tabeli S1) podijeljeni su u dvije grupe: anastatini A i njegovi derivati ​​i anastatini B i njegovi derivati. Resveratrol, za koji je objavljeno da ima kardioprotektivni učinak kroz svoju antioksidativnu aktivnost, korišten je kao pozitivna kontrola. Da bi se odredila koncentracija pozitivne kontrole, resveratrol i drugo antioksidativno jedinjenje, galna kiselina (3-100 μM) su procijenjeni pomoću MTT testa u kojem su ćelije tretirane 48 h 【22】. Općenito, H9c2 ćelije su prethodno tretirane anastatinima A i B i njihovim derivatima (10 uM konačne koncentracije) kao i 10 uM resveratrola 30 minuta prije H/R tretmana.

4.4. Procjena kapaciteta antioksidansa

4.4.1. Test smanjenja antioksidativne moći željeza (FRAP).

FRAP test je urađen prema Oivuanovoj metodi 【23】. Ukupno 25 μL 1 procenta kalijum fericijanida K3Fe(CN)6 je pipetirano i 10 μL jedinjenja 13, vitamina c (askorbinska kiselina, Vc) i resveratrola (0.{{8} } mM) plus 1 × PBS (pH=6.6) je dodano. Smjesa je držana u vodenom kupatilu na 50 stepeni 20 minuta nakon čega je uslijedilo brzo hlađenje ledom. Zatim je u nizu dodano 25 μL 10 posto trihloroctene kiseline (TCA), 0,1 posto željeznog hlorida (FeCl) i destilovane vode. Smjesa je prebačena u ploču sa 96-jažicom i apsorbancija je analizirana na 650 nm. Vc otopina (20-200 ug/mL) je korištena za izgradnju standardne krive. Antioksidativne sposobnosti su izračunate iz linearne kalibracione krive i predstavljene kao Vc ekvivalenti.

4.4.2.ABTS metoda

Aktivnost uklanjanja radikala ABTS [24] izvedena je prema Sugahari et al. i Re et al. ABTS otopina je razrijeđena da se spektrofotometrijski podesi apsorpcija na 650 od 0.70±0.02 nm, a aktivnosti uklanjanja ABTS-a mjerene su prema sljedeća formula, E=((Acontrol-Ablank)-(A2 -A1)/(A control-Ablank))× 10, gdje je kontrola apsorbancija kontrolne reakcije koja sadrži 130 μL ABTS · plus radni rastvor i 5,5 μL razblaživača uzorka (DMSO), a Ablank je apsorbancija 130 μL natrijum acetatnog pufera i 5,5 μL DMSO. A je apsorbancija 130 μL ABTS plus radnog rastvora (natrijum acetat pufer) i 5,5 μL jedinjenja 13 (0.02-20 mM), a Az je apsorbancija 130 μL natrijum acetatnog pufera i 5,5 μL jedinjenja 13 0.02-20 mM）. Sve smjese su vorteksirane 30 s i inkubirane na sobnoj temperaturi 10 minuta nakon čega je mjerena apsorpcija na 650 nm. ECs0 je izračunat korišćenjem linearne relacije između koncentracije jedinjenja i verovatnoće procenta inhibicije ABTS.

4.5. Ishemijsko-reperfuzijski model

4.5.1. Briga o životinjama

Sprague Dawley (SD) pacovi su dobijeni iz laboratorijskog centra za životinje PLA Vojne akademije medicinskih nauka (Peking, Kina). Pedeset mužjaka SD pacova težine od {{0}} g aklimatizirano je jednu sedmicu na sobnoj temperaturi od 23±1 stepen uz ciklus svjetlo/mrak od 12 h, a hrana i voda su bili obezbijeđeni. Štakori su podijeljeni u pet grupa: prazna grupa (pacovi nisu primili tretman, već lažnu operaciju), modelsku grupu (štakori su primili terapiju nosačem i MI/R operaciju), resveratrolnu grupu (štakori su primili 200 mg/kg resveratrola i MI/R operacija), grupa sa niskom dozom 13 (pacovi su primili 100 mg/kg jedinjenja 13 i MI/R operaciju) i grupu sa visokom dozom 13 (pacovi su primili 200 mg/kg jedinjenja 13 i MI/R operaciju). Jedinjenja su formulirana u 0,5 posto natrijum karboksimetilceluloze i dozirana kao suspenzija od 1 mL/kg oralno jednom dnevno tokom sedam dana. Svi eksperimenti na životinjama izvedeni su u skladu sa vodičem Nacionalnog instituta za zdravlje za negu i upotrebu laboratorijskih životinja i odobren od strane Akademskog komiteta Univerziteta nauke i tehnologije u Tianjinu.

4.5.2. Eksperimentalni protokol

Sprague Dawley pacovi su anestezirani sa 20 posto uretana (0,8 mL/100 g), a zatim smo izvršili ishemiju miokarda ligacijom prednje prednje lijeve strane (LAD). Srce je izloženo kroz lijevi torakalni rez i stavljeno na 4-0 svileni šav da bi se izvršila regionalna ishemija tokom 30 minuta ishemije nakon čega je uslijedila 2 h reperfuzije. Dokaz o ishemiji miokarda potvrđen je elevacijom ST segmenta i povećanjem amplitude QRS-a. Tokom eksperimenta, pacovi su držani na ventilatoru DW3000 (Beijing Zhishu Duobao Biological Technology Co. Ltd, Peking, Kina). Otkucaji srca i EKG praćeni su putem sistema za akviziciju biološkog signala MD3000 (Beijing Zhishu Duobao Biological Technology Co. Ltd, Peking, Kina). Nakon praćenja procesa ishemije/reperfuzije, pacovi su žrtvovani, a uzorci krvi i srčani homogenati su korišteni za otkrivanje ozljede miokarda pomoću detektivskih komercijalnih kompleta.

4.5.3. TTC bojenje i HE bojenje

Opseg ishemijskog područja kvantificiran je bojenjem trifenil tetrazolijum hloridom (TTC). Uzorci srca su odmah zamrznuti na {{0}} stepenu na 10 minuta i napravljeno je pet kriški tankih 1 do 2 mm. Zatim su kriške stavljene u 1% TTCfosfatni pufer (pH=7.0) i obojene na 37 stepeni 20 minuta i fiksirane u formalinu. Slike su dobijene digitalnom kamerom, a postotak infarktnog područja (TTC-negativno) i područja pod rizikom (TTC-pozitivan) mjeren je pomoću ImageJ softvera [25]. Za HE bojenje, infarktno područje je izrezano i fiksirano u 10 posto formaldehida, a zatim uklopljeno u parafin. Nakon toga, tkiva su obojena HE (hematoksilin-eozinom) i pregledana pod svjetlosnim mikroskopom. Dehidrirane ugrađene sekcije i sekcije za zaptivanje naručila je Tianjin YiSheng Yuan Biotechnology Company (Tianjin, Kina).

4.6. Spektrofotometrijski komercijalni kompleti

Komercijalni kompleti korišteni u ovom istraživanju kupljeni su od Beijing Solarbio Science & Technology Co. Ltd. (Peking, Kina) i Nanjing Jiancheng Bioengineering Company (Nanjing, Kina). U serumu i ćelijskom supernatantu štakora, marker ozljede miokarda, laktat dehidrogenaza (LDH) ), aktivnosti kreatin kinaze (CK), glutationa (GSH) i superoksid dismutaze (SOD). Aktivnosti malondialdehida (MDA) mjerene su pomoću homogenata srca pacova. Svi komercijalni kompleti su rađeni prema uputama proizvođača.

4.7. Statistički proces

Svi eksperimenti su ponovljeni najmanje tri puta. Eksperimentalni podaci obrađeni su softverom GraphPad Prism7, a eksperimentalni rezultat svake grupe izražen je kao srednja vrijednost ± standardna devijacija (x± s). Za poređenje statističke značajnosti između grupa korišten je t-test. P<0.05 was="" recorded="" as="" statistically="">

Reference

1. Uzdensky, AB; Demyanenko, S. Histonska acetilacija i deacetilacija u ishemijskom moždanom udaru. Neural Regen. Res. 2021, 16, 1529–1530. [CrossRef] [PubMed]

2. Li, H.; Yin, A.; Cheng, Z.; Feng, M.; Zhang, H.; Xu, J.; Wang, F.; Qian, L. Slabljenje signalnog puta za pojačavanje Na/K-ATPaze/Src/ROS sa pNaktide-om ublažava ishemijsko-reperfuzijsku povredu miokarda. Int. J. Biol. Macromol. 2018, 118, 1142–1148. [CrossRef] [PubMed]

3. Levin, RM; Xia, L.; Wei, W.; Schuler, C.; Leggett, RE; Lin, ADY Efekti spore razbijene ljuske Ganoderme Lucidum na oksidativni stres mokraćne bešike kunića koristeći in vivo model ishemije/reperfuzije. Mol. Cell. Biochem. 2017, 435, 25–35. [CrossRef] [PubMed]

4. Tan, Z.; Liu, H.; Song, X.; Ling, Y.; On je.; Yan, Y.; Yan, J.; Wang, S.; Wang, X.; Chen, A. Honokiol nakon tretmana ublažava ishemiju miokarda/reperfuzijsku ozljedu tako što povećava autofagni efluks i smanjuje intracelularnu proizvodnju ROS. Chem. Biol. Interakcija. 2019, 307, 82–90. [CrossRef] [PubMed]

5. Hausenloy, DJ; Yellon, DM Ishemijsko-reperfuzijska povreda miokarda: zanemareni terapeutski cilj. J. Clin. Investig. 2013, 123, 92–100. [CrossRef]

6. Yu, C.; Li, D.; Li, Z.; Yu, D.; Zhai, G. Efekat sakubitril/valsartana na upalu i oksidativni stres u modelu zatajenja srca izazvanog doksorubicinom kod kunića. Acta Pharmaceut. 2021, 71, 473–484. [CrossRef]

7. Wang, Y.; Che, J.; Zhao, H.; Tang, J.; Shi, G. Platycodin D inhibira oksidativni stres i apoptozu u H9c2 kardiomiocitima nakon hipoksije/reoksigenacije. Biochem. Biophys. Res. Commun. 2018, 503, 3219–3224. [CrossRef]

8. Pavlović, M.; BNáfrádi Rouster, P. Visoko stabilan nanokompozit antioksidativne aktivnosti koji oponaša enzim. J. Colloid Interface Sci. 2019, 543, 174–182. [CrossRef]

9. Qi, HZ; Wangi, WZ; He, JY Antioksidativni sistem Deinococcus radiodurans. Res. Microbiol. 2019, 171, 822–831. [CrossRef]

10. Shao, L.; Shao, Y.; Yuan, Y. Pinocembrin flavanon inhibira vitalnost ćelija u PC-3 humanom karcinomu prostate indukujući ćelijsku apoptozu, proizvodnju ROS-a i zaustavljanje ćelijskog ciklusa. Acta Pharmaceut. 2021, 71, 669–678. [CrossRef]