Pregled strukture D7 proteina i fiziološke uloge u hranjenju Nematocera krvlju, 1. dio

Jednostavan sažetak:

Vektori su organizmi koji mogu prenijeti infektivne patogene s jednog domaćina (ljudi ili životinje) na drugog. Mnogi vektori (uključujući komarce, peščane mušice i krpelje) imaju jednu zajedničku karakteristiku: oni su člankonošci koji se hrane krvlju (hematofagi). Svaki put kada ugrizu svog domaćina kralježnjaka, ozljeda kože i krvnih žila izaziva niz reakcija koje bi mogle dovesti do prekida dotoka krvi do njihovih usnih organa i svijesti domaćina zbog svraba i boli. Ipak, njihova pljuvačka sadrži koktel molekula sposobnih da se suprotstave ovim odgovorima domaćina (hemostaza, upala i imunitet), omogućavajući im da se uspješno hrane.

Mnogo puta se patogeni koje prenose ubrizgavaju u domaćina sa pljuvačkom. Stoga je razumijevanje sastava pljuvačke vektora ključno za proučavanje njihove biologije i vektorskog kapaciteta, kao i za predlaganje novih metoda za kontrolu bolesti koje prenose (uključujući nove kandidate za vakcinu). Među važnim porodicama proteina pljuvačke je D7, obilno eksprimiran u Diptera koji sišu krv i koji je daleko povezan sa proteinima koji vezuju mirise (OBP). Ovdje pružamo opsežan pregled strukture, funkcije i evolucije proteina D7, raspravljajući o tome kako umnožavanje i modifikacije gena u njihovim domenima sličnim OBP-u dovode do povećanja i gubitka funkcije kod različitih hematofagnih vrsta Diptera.

Infektivni patogeni mogu uzrokovati infekcije, a imunološki sistem je odgovoran za odbranu od ovih patogena i sprječavanje nastanka infekcije. Imuni sistem igra ključnu ulogu u identifikaciji i uništavanju patogena. Infektivni patogeni indukuju imuni sistem da proizvodi antitela i ćelijske imune odgovore koji sprečavaju ponovnu infekciju.

Međutim, određeni patogeni mogu zaobići ili oslabiti odbrambene mehanizme imunološkog sistema, što dovodi do smanjenja imuniteta i na taj način povećava rizik od infekcije. Na primjer, HIV može napasti CD4 plus T ćelije imunološkog sistema, poremeteći funkciju imunološkog sistema i olakšajući infekciju.

Također, oslabljen imunitet može učiniti određene infekcije ozbiljnijim i teškim za liječenje. Stoga je razumijevanje odnosa između infektivnih patogena i imuniteta veoma važno za prevenciju i liječenje zaraznih bolesti. Sa ove tačke gledišta, moramo poboljšati imunitet. Cistanche može značajno poboljšati imunitet. Polisaharidi u mesu mogu regulisati imuni odgovor ljudskog imunog sistema, poboljšati stresnu sposobnost imunoloških ćelija i pojačati baktericidni efekat imunih ćelija.

Kliknite cistanche tubulosa kupiti

sažetak:

Svaki put kada insekt ugrize domaćina kralježnjaka, ozljeda kože i krvnih žila uzrokovana pirsingom pokreće niz reakcija uključujući hemostazu, upalu i imunitet. Na mjestu, ovaj skup suvišnih i međusobno povezanih odgovora bi na kraju uzrokovao zgrušavanje krvi, svrab i bol koji bi doveli do svijesti domaćina, što bi rezultiralo prekidom hranjenja u najboljem slučaju. Ipak, pljuvačka hematofagnih artropoda sadrži složeni koktel molekula koji su ključni za uspjeh hranjenja krvlju.

Među važnim porodicama proteina koje su do sada opisane u pljuvački artropoda koji sišu krv, je D7, obilno izražen u Nematocera koji se hrani krvlju. D7 proteini su udaljeni od insekata koji vezuju mirise (OBP), i uprkos niskom identitetu sekvence, posmatranje strukturne sličnosti dovelo je do sugestije da bi, poput OBP-a, trebalo da vežu/sekvestiraju mala hidrofobna jedinjenja. Članovi koji pripadaju ovoj porodici dijele se na kratke forme i duge forme, koje sadrže jedan ili dva domena slična OBP-u. Ovdje pružamo pregled strukture i funkcije proteina D7, raspravljajući o tome kako duplikacija gena i neke modifikacije u njihovim domenima sličnim OBP-u tokom evolucije dovode do povećanja i gubitka funkcije među različitim hematofagnim vrstama Diptera.

Ključne riječi:

D7 proteini; proteini koji vežu miris; vektorska biologija; hematofagija; vektorska pljuvačka; hemostaza; upala.

1. Uvod

Bolesti koje se prenose vektorima prilično su raznolike u smislu simptoma, karakteristika, etioloških uzročnika i njihovih vektora. Uprkos ovoj raznolikosti, zajednička karakteristika koju dijele većina poznatih vektora je činjenica da su hematofagni artropoda. Sposobnost hranjenja krvlju predstavlja mnoge izazove, uključujući sposobnost pronalaženja domaćina, probijanja njegove kože i pronalaženja izvora krvi, sisanja krvi da bi je kasnije probavila i suočavanja s oksidativnim stresom koji nastaje njegovom probavom (pregledano u [1–3] ).

Svaki put kada insekt ugrize svog domaćina kralježnjaka, ozljeda kože i krvnih žila izaziva niz reakcija uključujući hemostazu, upalu i imunitet [1,2,4–8]. Ovi složeni i redundantni biološki procesi su međusobno povezani i sposobni da se razmnožavaju zbog proizvodnje/lučenja mnogih klasa medijatora, uključujući eikosanoide, biogene amine, faktore koagulacije i komplementa.

Na mjestu bi izazvali prekid dotoka krvi u usta hematofagnog člankonožaca (zbog vaskularne konstrikcije, agregacije trombocita i koagulacije krvi) i pokrenuli bi svijest o domaćinu (zbog svraba i boli). Ipak, pljuvačka člankonožaca koji se hrane krvlju sadrži jednako složenu i suvišnu mješavinu molekula sposobnih da se suprotstave odbrani domaćina i igra ključnu ulogu u uspjehu hematofagije (pregledano u [1,2,4–8]). Zaista, kao što je već rekao Ribeiro, hematofagni člankonošci su "živi špricevi" i njihova pljuvačka je još uvijek relativno neiskorišten izvor farmakološki aktivnih molekula [4].

Prisustvo molekula antikoagulansa u slini hematofagnih artropoda prvi put je objavljeno početkom prošlog stoljeća [9,10], a demonstracija važnosti lučenja pljuvačke u hranjenju krvlju prvi put je predložena 800-ih godina [11–13] . Ipak, sastav pljuvačke i specifična funkcija njenih komponenti još uvijek su bili slabo shvaćeni. Upotreba velikih razmjera sekvenciranja i proteomike tokom posljednjih desetljeća omogućila je bolje razumijevanje sastava pljuvačke, ali je također otkrila njegovu složenost i koliko je malo poznato [2,14]. Budući da se hematofagija pojavila neovisno nekoliko puta tijekom evolucije artropoda, mnogi načini za rješavanje izazova koje nameće ova navika pojavili su se među različitim redovima insekata, ili čak unutar istog roda, što je dovelo do široke varijacije u repertoaru proteina za suprotstavljanje odbrani domaćina. ugriz [2,4,5,7,15,16].

Među važnim porodicama proteina koje su do sada opisane u pljuvački člankonožaca koji sišu krv, je D7, obilno eksprimiran u hematofagnim Diptera [17–19] i udaljeni srodnik s insektima koji vežu mirise (OBP)/proteini koji vežu feromone (PBP) .

Kod insekata, OBP se obično kreću od 100 do 160 ostataka, ali kao što je uočeno za neke članove koji pripadaju "atipičnom/dvije domene" ili "Plus C" podfamiliji opisanim u Diptera, koji mogu imati do 300 aminokiselina [20-22 ]. Oni su prisutni u različitim redovima i broj označenih OBP gena uvelike varira među različitim vrstama, kao i sekvenca aminokiselina.

Ipak, njihovi cisteini su visoko konzervirani – klasično 6, iako ovaj broj može varirati od 4 u minus C OBP do 8 u plus OBP do čak 9 ili 10 – pozicionirani unutar polipeptidnog lanca sa signaturnom udaljenosti između nekih od njih [20,21 ,23]. Za razliku od OBP kičmenjaka, koji su svi proteini koji pripadaju superfamiliji lipokalina (SCOP: 3001332), OBP insekata su klasifikovani kao svi proteini i pripadaju superfamiliji insekata koji vezuju feromone/mirise (SCOP ID: 4000957). Uprkos niskom identičnosti sekvenci između članova, klasični OBP-ovi insekata imaju vrlo karakterističnu tercijarnu strukturu, sa 6 - spiralama koje su tipično stabilizovane sa 3 disulfidne veze koje formiraju veznu šupljinu (slika 1A), okružene hidrofobnim ostacima [20,24-26 ]. Veliki broj i raznolikost njihove primarne strukture, uz zadržavanje cjelokupne arhitekture, učinili su ih vrlo raznovrsnim u pogledu liganada, ali svi imaju jednu zajedničku karakteristiku: njihovu sposobnost/potencijal da vežu male hidrofobne molekule.

D7 proteini su, međutim, ograničeni na Nematocera koji se hrani krvlju, gdje su obilno eksprimirani u njihovim pljuvačnim žlijezdama. Članovi ove porodice su klasifikovani u (1) kratke forme (D7S), poznate i kao D7 srodne (D7r), sa molekulskom težinom oko 15-17 kDa, koje sadrže jedan domen sličan OBP-u (Slika 1B); (2) duge forme (D7L), sa molekularnom težinom oko 30-38 kDa, sastavljene od dva domena slična OBP (slika 1C). Kao što su prvi predložili Arcà i kolege [27], a kasnije uočeno kristalografijom rendgenske difrakcije [7,28–30], uprkos njihovoj niskoj sličnosti sekvenci sa OBP-ovima, arhitektura domena D7 proteina je vrlo slična OBP-ima, a sastavljena je od - spirale (obično 7–8 -heliksa umjesto 6), formirajući hidrofobni džep (Slika 1B, C) pogodan za vezanje hidrofobnih molekula, o čemu će se dalje raspravljati u nastavku.

Većina do sada okarakteriziranih D7 proteina pronađena je u pljuvački Diptera koji sišu krv, gdje djeluju kao antihemostatski i/ili protuupalni molekuli, olakšavajući hranjenje krvlju. U ovom radu pružamo sveobuhvatan pregled strukture, funkcije i evolucije proteina poput D7 i D7-, upoređujući neke aspekte sa OBP-ovima artropoda i drugim porodicama proteina relevantnim za fiziologiju vektora.

2. D7s: Od opisa prvog gena do naznaka o njihovoj raznolikosti, distribuciji i funkcijama

Prvi gen koji kodira protein D7 izolovan je i opisan 1991. godine u Aedes aegypti [31], za koji se pokazalo da je obilno i isključivo eksprimiran u ženskim pljuvačnim žlijezdama koje proizvode protein od 37 kDa. Hibridizacija in situ korištenjem seciranih ženskih pljuvačnih žlijezda ispitanih antisens RNA za kodirajuću regiju ovog gena otkrila je da je njegova ekspresija uglavnom u distalnim bočnim i medijalnim režnjevima, regijama koje su vrlo dobro diferencirane kod ženki (hematofagi) u poređenju sa mužjacima (fitofagi). , što sugerira da je njegov proizvod vrlo vjerovatno uključen u hranjenje krvlju. Kasnije, u pionirskoj studiji koja je imala za cilj da identifikuje gene koji su eksprimirani isključivo u pljuvačnoj žlezdi Anopheles gambiae i čiji su proizvodi sadržavali signalne peptide, izolovano je šest cDNK.

Tri od njih, za koje se pokazalo da su obilno eksprimirane u ženskim pljuvačnim žlijezdama, kodirale su transkripte slične, iako kraće, prethodno opisanom Aedes aegypti D7, što sugerira da se radi o novoj porodici proteina. Sva tri su bila u potpunosti usklađena sa Aedes D7 C-terminalnom domenom, pa su stoga nazvana D7-srodni proteini (D7r): D7r1–D7r3 [32]. Isto tako, izraženi su u ženskim distalnim lateralnim režnjevima, iako je samo jedan od njih (D7r1) bio izražen iu medijalnim režnjevima [32].

Nekoliko godina kasnije, četvrti D7r (D7r4) je također pronađen u ženskim pljuvačnim žlijezdama Anopheles gambiae i pokazalo se da se nalazi blizu ostala tri oblika formirajući klaster na hromozomu 3R [27]. Kada su poređani, ova 4 transkripta imala su sličnosti između njih u rasponu od 53 do 73 posto, i što je vrlo važno, imali su nizak nivo sličnosti sa OBP-ovima i proteinima koji vezuju feromone (PBP), ali njihova 4 cisteina su bila locirana na očuvanim pozicijama vezanim za antene. i OBP bez antene. Uprkos niskoj sličnosti sekvenci, predviđanje sekundarne strukture je sugerisalo strukturne sličnosti sa OBP-ovima, stoga je pretpostavljeno da bi D7 takođe mogao imati hidrofobni vezni džep okružen -heliksom i biti sposoban da veže ili nosi male hidrofobne molekule, verovatno medijatore uključene u odgovore domaćina (npr. upala i hemostaza), s obzirom na činjenicu da su bili obilni i isključivi na slinu žena [27].

Činjenica da su ovi An. gambiae kratki oblici usklađeni sa C-terminalom Ae. aegypti D7L, te da su Southern blot testovi otkrili druge članove u blisko srodnim vrstama povećali su mogućnost da članovi ove porodice gena mogu biti prisutni u drugim vrstama komaraca i da proteini s različitim dužinama kodirani ovim geni mogu imati slične funkcije, ali različite ciljeve zbog na razliku u njihovoj primarnoj strukturi [27].

Zaista, Suwan i saradnici su po prvi put izvijestili o genima koji kodiraju jedan D7L i 2 D7-srodna (kratka) oblika u pljuvačnoj žlijezdi Anopheles stephensi, a Western blot s poliklonskim antitijelom proizvedenim za prepoznavanje dugog oblika proteina je ukrštao reaktivnost i sa D7rs [33]. Ovo je bio prvi izvještaj koji pokazuje da se zaista dugi i kratki oblici mogu naći u istoj vrsti. Zatim su naknadne studije pokazale prisustvo drugih članova ove porodice u različitim vrstama komaraca (porodica Culicidae), uključujući Anopheles arabiensis, Aedes aegypti i Anopheles darlingi [17,18], kao i kod drugih hematofagnih Diptera koji pripadaju porodici Psychodidae ( peščane mušice) [17].

Sve u svemu, ove studije su snažno sugerirale da: (1) D7 je bila porodica proteina vjerovatno široko rasprostranjena u hematofagnim Diptera, isključivo eksprimirana u ženskim pljuvačnim žlijezdama, stoga bi mogli imati važnu ulogu u hranjenju krvlju; (2) D7 proteini različiti po dužini i sekvenci aminokiselina bili su prisutni u različitim vrstama i unutar iste vrste, vjerovatno kao rezultat duplikacije gena koja je stvorila raznolikost; (3) njihove pretpostavljene mete treba da budu mali hidrofobni molekuli, kao što su posrednici upale i/ili hemostaze [27,33]. Ipak, njihova funkcija je i dalje bila neuhvatljiva.

3. D7 proteini pljuvačke su protuupalni i antihemostatski molekuli

D7 i drugi proteini slični OBP-u prisutni u pljuvački nematocera koji sišu krv mogu imati varijabilnost u svojoj primarnoj strukturi, što dovodi do dobijanja i gubitka funkcije uprkos zadržavanju nekih ključnih karakteristika i opšte arhitekture, kao što je primećeno kod mnogih OBP. Tabela 1 sumira proteine ​​poput D7 i D7- opisane do sada u pljuvački različitih vrsta i njihove ligande i daje njihov pristupni broj Protein Data Bank (PDB), gdje je primjenjivo. Detalji i fiziološka relevantnost razmatraju se u nastavku.

3.1. Kontaktirajte inhibitore puteva

Prvi D7 koji je karakterizirao svoju funkciju bio je kratki oblik (D7r), nazvan Hamadarin [35], izražen u SG ženki Anopheles stephensi. Njegov najbliži D7 je izražen u An. gambiae bi bila D7r1. Pokazalo se da hamadarin veže faktor XII (FXII) i kininogen visoke molekularne težine (HMWK) čime inhibira aktivaciju kontaktnog puta i posljedično proizvodnju bradikinina, djelujući kao protuupalni molekul. Ipak, u oba slučaja, interakcija sa FXII i HMWK, proučavana površinskom plazmonskom rezonancom (SPR), dogodila se samo u prisustvu Zn2 plus i nije uticala na amidolitičku aktivnost aktiviranih faktora. Umjesto toga, njegov inhibitorni učinak na aktivaciju kontaktnog puta bio je posljedica njegovog ometanja u recipročnoj aktivaciji FXII i kalikreina do koje bi trebalo doći prilikom njihove interakcije s nabijenim površinama [35]. Nekoliko godina kasnije, drugi inhibitor aktivacije kontaktnog puta prisutan u pljuvački Anopheles stephensi (Anophensin) je okarakterisan i pokazao se da ima slične ciljeve kao Hamadarin, ali pripada potpuno drugoj porodici proteina [42].

Važno je napomenuti da je među najizraženijim proteinima u pljuvački pješčane mušice [43-45] grupa proteina koji također pripadaju OBP superfamiliji, ne nalaze se kod komaraca i razlikuju se od D7 proteina. Prvo su privukli pažnju ne samo zbog svog obilja već i zbog toga što su identifikovani kao kandidati za vakcinu protiv lišmanijaze [46,47]. Tek više od decenije kasnije, dva člana ove grupe su okarakterisana u pljuvački Phlebotomus duboscqi: PdSP15a i PdSP15b (P. duboscqi pljuvački protein 15 a i b, respektivno). Oba su vrlo slična jedno drugom i inhibiraju aktivaciju kontaktnog puta i proizvodnju bradikinina [41], ali kroz mehanizam različit od onog opisanog za Hamadarin [35]. PdSP15a i b se ne vezuju ni za jedan faktor koagulacije (zimogene ili aktivirane forme), kalikrein ili prekalikrein. Njihovo djelovanje je ipak kroz vezivanje negativno nabijenih polimera kao što su dekstran sulfat (DS), polifosfat (PP) i heparin, sprječavajući njihovu interakciju sa FXII, neophodnim za njegovo auto-cijepanje koje pokreće njegovu aktivaciju i naknadno širenje aktivacije kontaktnog puta kroz recipročna aktivacija FXII i prekalikreina u plazmi (PK), kao i aktivacija FXI trombinom i FXIIa. Važno je da dok klasični OBP i D7 imaju hidrofobni džep gdje se veže njihov mali hidrofobni ligand, strukturni podaci sugeriraju da je njihov mehanizam djelovanja kroz elektrostatičku interakciju između njegove anionske površine i negativno nabijenih liganda, umjesto bilo kakvog vezivanja unutar hidrofobne šupljine [41,47] .

Kaskadu koagulacije plazme mogu pokrenuti dvije različite grane: (1) vanjski put, pokrenut kada se faktor VII (FVII) aktivira nakon vezivanja za faktor subendotelnog tkiva (TF) izložen nakon vaskularne ozljede. (2) Kontaktni put, poznat i kao unutrašnji put, pokreće se nakon aktivacije FXII do FXIIa izazvanog njegovim kontaktom sa negativno nabijenim površinama. Oba puta nakon niza reakcija konvergiraju na zajednički put kroz FX aktivaciju što na kraju dovodi do cijepanja fibrinogena do fibrina, ključnog za stvaranje ugruška [48,49]. Posljednjih godina, lijekovi koji ciljaju komponente unutrašnjeg (kontaktnog) puta kao što su FXII i FXI su opsežno proučavani jer je pokazano da su miševi kojima nedostaje FXII zaštićeni od stvaranja tromba, a da pritom nemaju veće poremećaje krvarenja [50–52], što sugerira da je ovaj put važno za patološku koagulaciju.

Nakon aktivacije, faktor XII cijepa plazmatski prekalikrein (PK) stvarajući kalikrein, koji pored recipročne aktivacije sa FXII također katalizira hidrolizu HMWK koji stvara bradikinin (kalikrein-kinin sistem) [53]. Bradikinin je moćan proinflamatorni medijator koji povećava propusnost endotela [48,54] i bol [55]. Stoga bi prisustvo inhibitora kontaktnog puta u slini hematofagnih artropoda igralo važnu ulogu kao protuupalni molekuli smanjujući proizvodnju bradikinina (kao što je prikazano za D7s/OBP-slične proteine ​​hamada u [35] i PdSP15s [41]) , i inhibiranjem/sprečavanjem curenja plazme izazvanog aktivacijom kontaktnog puta kao što je objavljeno za PdSP15 [41].

For more information:1950477648nn@gamil.com