Urođena strategija otkrivanja patogena koja uključuje ubikvitinaciju površinskih proteina bakterija 1. dio

UVOD

Patogena invazija pokreće bateriju imunoloških odgovora stimuliranih nadzornim mehanizmima domaćina. Ovo se općenito pokreće prepoznavanjem očuvanih mikrobnih molekularnih struktura poznatih kao molekularni obrasci povezani s patogenom (PAMPs). Efikasno otkrivanje ovih PAMP-ova pomoću receptora za prepoznavanje uzoraka (PRR) brzo indukuje različite imunološke odgovore domaćina putem aktivacije složenih signalnih puteva koji pokreću čišćenje patogena.

Posljednjih godina, s razvojem biotehnologije i stalnim unapređenjem istraživačke tehnologije, ljudi imaju dublje razumijevanje odnosa između mikrobnih molekula i imuniteta. Očuvane mikrobne molekule su klasa mikrobnih molekula koje organizmi mogu prepoznati i pokrenuti imunološki odgovor. Oni uglavnom uključuju molekularne komponente mikroorganizama kao što su bakterije, virusi i gljivice, te su visoko očuvane i specifične. Istraživanja su pokazala da konzervirani mikrobni molekuli mogu odoljeti raznim patogenima i poboljšati imunitet aktiviranjem imunološkog sistema tijela.

Očuvani mikrobni molekuli pokreću upalne i imunološke odgovore aktiviranjem važnih molekula u imunološkom sistemu, kao što su T ćelije, B ćelije i makrofagi. Nakon što prepoznaju očuvane mikrobne molekule, ove ćelije će osloboditi različite imune medijatore, uključujući citokine i hemokine, privlačeći na taj način druge imunološke ćelije da se pridruže imunološkom odgovoru. U isto vrijeme, konzervirani mikrobni molekuli mogu poslužiti i kao antigeni za aktiviranje odgovora antitijela u tijelu, čime se formira zaštita antitijela. Interakcija ovih ćelija i imunoloških faktora može bolje zaštititi tijelo od patogena.

Mnoga istraživanja su pokazala da konzervirani mikrobni molekuli mogu poboljšati imunitet organizma, čime se sprječavaju i liječe niz bolesti, kao što su zarazne bolesti, alergijske bolesti, rak, itd. Na primjer, uobičajena rekombinantna vakcina protiv hepatitisa B napravljena je na bazi očuvana mikrobna molekula na površinskom antigenu virusa hepatitisa B. Imuni odgovor organizma može se inducirati inokulacijom vakcine, kako bi se stvorilo površinsko antitijelo virusa hepatitisa B, kako bi se postigla svrha prevencije infekcije virusom hepatitisa B.

Zaključno, postoji snažna veza između očuvanih mikrobnih molekula i imuniteta. Punim korištenjem imunomodulatorne funkcije očuvanih mikrobnih molekula može se poboljšati imunitet organizma, a razne bolesti se mogu bolje spriječiti i liječiti. Stoga treba aktivno obratiti pažnju na primijenjena istraživanja konzerviranih mikrobnih molekula i promovirati njihovu primjenu u prevenciji i liječenju bolesti. Sa ove tačke gledišta, moramo poboljšati imunitet. Cistanche može značajno poboljšati imunitet, jer mesni pepeo sadrži razne biološki aktivne sastojke, kao što su polisaharidi, dvije pečurke, huangli itd. Ovi sastojci mogu stimulirati imunološki sistem. Različite vrste ćelija povećavaju njihovu imunološku aktivnost.

Kliknite na zdravstvene prednosti cistanchea

Do danas je otkriveno i okarakterisano nekoliko klasa PRR-ova, kao što su Toll-slični receptori, receptori slični genu I (RIG-I) induciranog retinojskom kiselinom, receptori slični NOD-u i DNK receptori (citosolni senzori za DNK) (1 ). Ovi PRR su na čelu i ekstracelularnog i intracelularnog prepoznavanja patogena i osjećaju različite klase molekula u mikrobima uključujući proteine, lipide, ugljikohidrate i nukleinske kiseline (2). Ovo je ključno za zaustavljanje progresije bolesti i promicanje preživljavanja domaćina.

Nadzor intracelularnog miljea radi ograničavanja proliferacije patogena je kritičan za očuvanje citosolne sterilnosti. Kršenje takvih odbrambenih mehanizama pruža patogenu utočište od ekstracelularnog urođenog imuniteta i nudi priliku za brzo umnožavanje i diseminaciju unutar domaćina (3). Stoga su snažni mehanizmi za otkrivanje patogena i ćelijski autonomni odbrambeni sistemi kritični za ograničavanje invazivnih patogena. Ubikvitinacija je jedna od strategija koja igra ključnu ulogu u prepoznavanju i eliminaciji patogena (4).

Degradativni put diktiran ubikvitinacijom djeluje kao konačna granica protiv bakterija koje žive u citosolu i koje često izbjegavaju klasično ubijanje endocita rupturirajući vakuole koje sadrže patogene kako bi napale citosol domaćina. Identificirano je nekoliko domaćinskih E3 ubikvitin ligaza za ukrašavanje tereta, uključujući unutarćelijske patogene s poli-ubikvitinskim (Ub) lancima (5), i iako je otkriveno nekoliko bakterijskih meta kao što su proteini vanjske membrane (6), opsežno znanje o strategiji identifikacije supstrata ostaje ograničeno.

Nedavna studija je pokazala da izlučeni efektorski proteini sadrže domenu povezanu s ubikvitinom (UBA) u Mycobacterium tuberculosis (Mtb) koja pasivno regrutuje ubikvitinske dijelove, na kraju isporučujući patogene proteinu 1A/1B-lakog lanca 3 (LC3) -gusca povezanom s mikrotubulama. (7). Pored toga, neobični supstrati ubikvitina poput lipopolisaharida (LPS) i glikana elegantno su ilustrirani u nekoliko bakterijskih patogena, pokazujući svestranost supstrata za ubikvitinaciju (8, 9).

Komplementarno, otkriveno je da Rickettsia parkeri aktivno modificira površinske proteine, štiteći ih od ubikvitinacije i kasnijeg ubijanja (10). Zajedno, ove nezavisne studije naglašavaju značaj površinske lokalizacije ubikvitinskog supstrata. Međutim, identitet proteinskog supstrata u patogenu i kako bi se oni mogli precizno identificirati pomoću E3 ligaze domaćina ostaju nedostižni.
Dosta ubikvitinskih ligaza domaćina, kao što su repeticija bogata leucinom i sterilni motiv koji sadrži 1 (LRSAM1), Parkin, protein prstenastog prsta 166 (RNF166), RNF213, Ariadne RING-BetweenRING-RING (RBR) E3- Ubikvitin proteinska ligaza 1 (ARIH1), SMAD-specifična E3-ubikvitin proteinska ligaza 1 (Smurf1) i kompleks koji sadrži protein 2 Skip-Cullin-F-box (SCFFBXO2) ukrašavaju vakuole koje sadrže patogene ili patogene sa različitim topologijama ubikvitinskih lanaca (8, 9, 11–18). Konkretno, LRSAM1 putem auto-ubikvitinacije možda generiše robustan ubikvitin signal oko bakterija da regrutuje autofagičnu mašineriju (19, 20). Ubikvitinske ligaze odgovorne za obilježavanje patogena također su uključene u održavanje ćelijske homeostaze, stvarajući izuzetno štedljiv sistem za efikasno i optimalno korištenje resursa.

Među različitim topologijama ubikvitinskog lanca formiranih na patogenu, M1-Ub dekoracija prvenstveno pokreće indukciju upale (21), dok i K48- i K63-Ub topologije lanca efikasno ciljaju mikrobe prema autofagija, odnosno proteazomalni sistem (22). Nedavno smo pokazali da lanac K48-Ub ima dominantniji antibakterijski efekat u odnosu na K63-Ub (23). Generalno, ćelijski proteini namijenjeni proteazomalnoj degradaciji su označeni ligazama specifičnim za K48- Ub lanac. Kritični signal za prepoznavanje supstrata od strane takvih ligaza je uglavnom usmjeren degronskim motivom (24).

U ovoj studiji identificiramo postojanje degron motiva u površinskim proteinima filogenetski raznolikih bakterija kako Gram-pozitivnog tako i Gram-negativnog porijekla. Ciljanje takvih supstrata pomoću mašinerije za ubikvitinaciju pokreće efikasnu eliminaciju patogena iz ćelije domaćina. Koristeći ovo, demonstriramo pretvaranje površinskog proteina koji se ne može ubiti u ubikvitin u supstrat ubikvitina inženjerskim umetanjem degrona za promicanje uklanjanja bakterija. Ovaj jednostavan, ali generički princip za identifikaciju bakterijskih supstrata potencijalno služi kao očuvani mehanizam prepoznavanja citosolnog patogena, obećavajući da će biti efikasan i višenamjenski u odbrani od bakterijskih infekcija.

REZULTATI

K48-Ub lanac promovira otkrivanje citosolnih bakterijskih patogena

Nakon što je osetio citosolnu invaziju patogena, domaćin ih je obeležio poli-Ub lancima da bi pokrenuo njihovo uklanjanje (22). Budući da se takvi poliUb lanci prvenstveno sastoje od K48- i K63-Ub, prvo smo istražili dominaciju i prostornu lokaciju ovih tipova lanaca na dva filogenetski različita patogena, Streptococcus pneumoniae (SPN) i Salmonella enterica serovar Typhimurium (STM), koji izazivaju upalu pluća i gastroenteritis kod ljudi. Za ove patogene, opstanak i proliferacija unutar citosola ćelije domaćina su dokumentovani (13, 25). Koristeći ubikvitin-specifična antitijela, uočili smo da je značajno veći udio intracelularnih bakterija označen tipom K48- Ub lanca (~26 posto za SPN i 37 posto za STm) za razliku od K63- Ub (slika 1A).

Analiza prostorne lokacije strukturiranom iluminacijskom mikroskopijom (SIM) pokazala je da su citosolne (bez vakuolnih ostataka) ili bakterije izložene citosolu (unutar oštećenog endosoma) prvenstveno povezane s K48-Ub, dok su K63-Ub signal je lociran na oštećenim endosomima, označenim galektinom-8 (Gal8; marker za otkrivanje oštećenja endosoma) (sl. 1, B do E) (26). Oko 99 i ~76 posto K48-ubikvitiniranih SPN i STm, respektivno, bilo je bez Gal8 (slika 1F). Prisustvo bakterija u citosolu dalje je potvrđeno transmisijskom elektronskom mikroskopijom (TEM) i imunološkim bojenjem membranskim markerom FM4-64 (sl. S1, A do F). Otkrili smo 78,4 i 80,4 posto K48-Ub-pozitivnih SPN i STm, respektivno, bez ikakve membranske povezanosti, dok je 77,7 i 74,4 posto K63-Ub-pozitivnih SPN i STm, respektivno, bilo ograničeno unutar vakuola (slika 1G). Zajedno, ovi nalazi sugeriraju da je oblaganje površine bakterije K48-Ub lancima glavni mehanizam za otkrivanje patogena koji koristi domaćin za prepoznavanje mikroba koji žive u citosolu.

Degron je generički kod za ubikvitinaciju bakterija

Zatim smo pokušali identificirati supstrat za ubikvitinaciju K48 na površini bakterije. Kritično, E3 ubikvitin ligaze domaćina, za koje se navodi da su uključene u bakterijsku ubikvitinaciju, također su uključene u ključne ćelijske funkcije (12, 14) gdje K48-Ub lanci djeluju kao glavni signal za ćelijsku proteostazu. Pretpostavili smo da bi slične principe mogao usvojiti domaćin za identifikaciju K48-Ub supstrata na površini bakterije. Za proteine ​​domaćina, prisustvo tripartitnog motiva (primarna degron sekvenca praćena proksimalnim lizinskim ostatkom i neuređenim regionom između) je preduslov za ubikvitinaciju K48 (24).

Pregledali smo površinske proteine ​​SPN-a na prisustvo sličnih karakteristika (slika 1H), identifikujući BgaA i PspA kao pretpostavljene mete za ubikvitinaciju (slika 1H i slike S2, A i B). BgaA je -galaktozidaza za koju se navodi da funkcioniše kao adhezin za SPN, dok je PspA protein koji veže holin koji vezuje laktoferin i potreban je za izbegavanje komplementa (27, 28). Uočili smo smanjenje od ~50 do 53 posto u povezanosti tipa K48-Ub lanca i za ΔbgaA i ΔpspA mutante, bez ikakvih promjena u nivoima K63-Ub (slika 1I). Ovo smanjenje je bilo izraženo (~75 posto) u soju sa dvostrukim nokautom (ΔbgaAΔpspA), što ukazuje na neredundantnu prirodu ovih ubikvitinskih supstrata (slika 1I).

Štaviše, ekspresija BgaA-T (skraćena verzija proteina, koja se sastoji od aminokiselina 1 do 1049) i PspA u ćelijama domaćinima dovodi do njihove ubikvitinacije sa K48-Ub topologijom (slika 1J). Valjanost predviđenih ciljeva potvrđena je komplementacijom, a model je ojačan korištenjem ΔhysA (SPN površinski protein koji ne ispunjava tripartitne degron kriterije) mutanta kao kontrole za ocjenjivanje nivoa K48-Ub asocijacije (slika 1I ).

Zatim smo istražili uticaj K48-ub dekoracije na uklanjanje bakterija.

Odsustvo K48-Ub supstrata ometa bakterijski klirens, što rezultira značajno poboljšanom intracelularnom postojanošću za oba mutantna soja SPN (~1.8- puta za ΔbgaA i ~2- puta za ΔpspA) ( Slika 1K). Univerzalnost našeg pristupa predviđanju supstrata potvrđena je identifikacijom nekoliko površinski izloženih proteina u raznim drugim patogenima kao pretpostavljenih supstrata za ubikvitinaciju (tablica S1). Jedan od takvih potencijalnih kandidata, protein vanjske membrane RlpA na STm je potvrđen kao meta za mašineriju za ubikvitinaciju domaćina, pošto je ΔrlpA mutant pokazao ~1.5- puta smanjenu povezanost sa K48-Ub u poređenju sa divljim -tip (WT) STm (slika 1L). Ovaj nalaz je utvrdio široku primjenu naše strategije odabira supstrata. Koliko nam je poznato, ovo su prvi površinski proteini bakterija koji su prepoznati od strane mašinerije za ubikvitinaciju domaćina za otkrivanje i uklanjanje patogena.

Tripartitni motiv je preduvjet za precizno ubikvitinsko označavanje površinskih proteina bakterija

Nakon identifikacije supstrata, imali smo za cilj da testiramo kritične karakteristike trodelnog motiva koji je činio okosnicu našeg ekrana (sl. 2A i sl. S2A). Brisanje degron sekvence (102VTPKEE107) u BgaA-T rezultiralo je padom od ~50 posto u povezanosti tipa K48-Ub lanca, u poređenju sa WT SPN, bez obzira na sličnu kinetiku rasta i sposobnost prianjanja ćelija (slika 2C i sl. S3, A i B). Ovo smanjenje je bilo uporedivo sa ΔbgaA nokaut sojem, potvrđujući fenotip specifičan za degron. Osim degron sekvence, lizinski ostatak u neposrednoj blizini je ključan za vezivanje ubikvitinskog dijela za supstrat. U BgaA, degron sekvenca je praćena sa dva proksimalna značajno smanjena K48 ubikvitinacija u poređenju sa BgaA-T (slika 2D). Značajno je da je mogućnost ozbiljne konformacijske promjene u BgaA-TΔDegron proteinu da utiče na ubikvitinaciju poništena in silico predviđanjem i spektroskopijom kružnog dihroizma (CD) pročišćenog BgaA-TΔDegron proteina, koji je pokazao slične strukturne potpise kao BgaA-T (slika S3 C i D). Poput BgaA, delecija degron sekvence (327PETPAPE333) i mutacija lizina (K315R) u PspA su također dovele do značajno smanjene asocijacije K48-Ub, zajedno sa produženom sposobnošću preživljavanja (sl. S4, A do D).

Zatim smo konstruirali SPN površinski protein HysA, kojem je prvobitno nedostajala primarna degron sekvenca, dodavanjem degron sekvence unutar strukturno poremećenog regiona proteina koji sadrži lizinski ostatak (sl. 2, F i G, i sl. S2, C do E). Ova modifikacija je omogućila prepoznavanje i K48 ubikvitinaciju prethodno neubikvitibilnog proteina HysA. K48-Ub asocijacijski nivoi SPN sojeva koji nose konstruirani protein HysA (ΔbgaA:pHysADegron-BgaA i ΔpspA:pHysADegron-PspA) bili su 2.2- i 3.2-put više u poređenju sa ili ΔbgaA i ΔbgaA: pHysA ili ΔpspA sojevi, respektivno (slika 2H).

Poboljšana dekoracija sojeva ΔbgaA:pHysADegron-BgaA i ΔpspA:pHysADegron-PspA sa K48-Ub ukrala je SPN-u dobitku preživljavanja koju obezbjeđuje odsustvo degrona u ΔbgaA i ΔbgaA: pHysA ili ΔpspI (sl. ΔpspI). Svi konstruisani sojevi SPN proizveli su slične nivoe toksina koji stvara pore pneumolizina (Ply) (Slika 2, B i G), što je preduslov za oštećenje endomembrane i naknadnu ubikvitinaciju (25). Ovo poništava mogući doprinos niskog ili ekstenzivnog oštećenja membrane promovišući značajnu promjenu nivoa ubikvitinacije kod mutantnih SPN sojeva. Zajedno, ovo sugerira da umjetno dodavanje degron sekvence potiče otkrivanje i eliminaciju patogena posredovano ubikvitinom. Značajno je da je degron sekvenca u BgaA bila visoko očuvana kod različitih pneumokoknih serotipova (slika S5A).

Međutim, kod serotipa 19F koji je često povezan sa povećanim rizikom od smrti od bakteremične pneumonije i sepse (29–31), utvrđeno je da je primarni degron mutiran (P104Q). Primetili smo da oponašanje ove mutacije u BgaA (slika S5B) daje lošu ubikvitinaciju i poboljšanu sposobnost preživljavanja ΔbgaA:pBgaA-TP104Q u poređenju sa ΔbgaA:pBgaA-T (sl. S5, C i D). Ovo naglašava degron prepoznavanje kao strategiju koju koristi domaćin da se zaštiti od teških bakterijskih infekcija.

SCFFBW7 je antimikrobna E3 ubikvitin ligaza

Predviđa se da će kanonska degron sekvenca prisutna u odabranim ubikvitinskim supstratima biti identifikovana kompleksom SCFFBW7 E3 ubikvitin ligaze (24), koji je uključen u regulaciju ćelijskog ciklusa i rasta (32). Sastoji se od dva konzervirana proteina, proteina 1 povezanog s kinazom S-faze (SKP1) i člana porodice Cullin proteina, zajedno sa varijabilnim F-box proteinom koji obezbjeđuje specifičnost supstrata (33). Da bismo potvrdili uključenost SCFFBW7 u ubikvitinaciju SPN-a, prvo smo procijenili povezanost FBXW7 sa SPN-om. Otkrili smo da je ~31 posto intracelularnog SPN-a povezano sa FBXW7 nakon imunofluorescentne analize (sl. 3A i slika S6A). Očekuje se da je FBXW7-pozitivan SPN takođe kolokalizovan sa K48 ubikvitinom (sl. S6B). Da bi se dokazalo učešće SCFFBW7, označavanje bakterija sa K48-Ub lancima je ispitano imunofluorescencijom, nakon smanjenja ekspresije Cullin1, SKP1 i FBXW7 gena koristeći ciljane male interferirajuće RNK (siRNA; sl. S7, A do C).

Konkretno, utišavanje FBXW7 je potvrđeno nivoom akumulacije ciklina E1 u ćelijama tretiranim siFBXW7- (sl. S7F). Uočili smo smanjenje od ~45 do 60 posto u SPN povezanosti sa K48-Ub u Cullin1, SKP1 i FBXW7 knockdown ćelijama (slika 3B), što je zauzvrat dovelo do ~1.6- do 175- puta povećanje perzistencije SPN-a unutar ćelija domaćina (slika 3E). Specifično ciljanje motiva degrona od strane SCFFBW7 dokazano je nepromijenjenim razlikama u kolokalizaciji K48-Ub i sposobnosti preživljavanja ΔpspAΔbgaA i ΔbgaA:pBgaA-TΔDegron sojeva u ćelijama tretiranim siFBXW7-S8 do Afig. D). Ovi nalazi su potkrijepljeni značajnim smanjenjem K48 ubikvitinacije BgaA-T u ćelijama domaćinima nakon pada FBXW7 (slika 3C).

Dalje, in vitro, ubikvitinacija sa prečišćenim BgaA-T (sl. S9, A do D) i komponentama SCF kompleksa nedvosmisleno pokazuje SCFFBW7 kao vernu E3 ligazu odgovornu za ubikvitinaciju BgaA. Rekombinantni SCFFBW7 je bio sposoban da ubikvitinira pročišćeni BgaA-T, ali nije uspio ubikvitinirati degron-deleted varijantu BgaA-TΔDegron ili varijantu supstitucije lizina na arginin BgaA-TK97R (slika 3D). Štaviše, ćelije domaćini koje eksprimiraju varijantu FBXW7R505C, koja pokazuje smanjenu sposobnost prepoznavanja ciklina E1 (supstrat FBXW7) (sl. S7E), pokazale su smanjenu (~50 posto) K48 ubikvitinaciju SPN-a, kao i ~2- puta veće preživljavanje SPN-a u poređenju sa WT ćelijama (slika 3, F i G). Ovi eksperimenti dokazuju ključnu ulogu SCFFBW7 E3 ligaze u detekciji patogena koji žive u citosolu i usmjeravanju ih na puteve ubijanja.

GSK3 -posredovana fosforilacija degron motiva potencira antimikrobnu aktivnost SCFFBW7

Općenito, F-box proteini prepoznaju fosforilirane supstrate kako bi promovirali njihovu ubikvitinaciju (34). Stoga smo istražili vjerovatnoću i utjecaj fosforilacije bakterijskih supstrata na K48-Ub omotač patogena. Bioinformatička analiza je otkrila prisustvo pretpostavljenog ostatka treonina koji se može fosforilirati (102VT*PKEE107) unutar degron sekvence u BgaA. Primijetili smo da soj SPN koji ima mutaciju BgaA-TT103A (ΔbgaA:pBgaA-TT103A) (slika 4A) pokazuje 71 posto smanjenu kolokalizaciju sa K48-Ub u poređenju sa WT (slika 4B), otkrivajući relevantnost fosforilacija u prepoznavanju supstrata od strane SCF kompleksa.

Kritično je da je smanjena sklonost fosforilaciji BgaA u ΔbgaA:pBgaA-TT103A poništila sposobnost domaćina da eliminira intracelularno opterećenje bakterijama (~18- puta) (slika 4C). Paralelno sa BgaA, PspA degron varijanta (ΔpspA:pPspAT329A) je također pokazala pad od 51 posto u kolokalizaciji K48-Ub koja je bila povezana sa produženom intracelularnom perzistencijom (sl. S10, A do C). Generalno, ciljni supstrati SCFFBW7 imaju treonin/serin (T/S*) pored ostatka prolina, koji je fosforiliran protein kinazom usmjerenom na prolin, GSK3 (35–37). Stoga smo pokušali da otkrijemo učešće GSK3 u povećanju prepoznavanja supstrata.

Prvo smo pokazali da je GSK3 blisko povezan sa ubikvitiniranim SPN-om, označenim sa FBXW7 (Slika 4, D i E). Nakon toga, izvodeći in vitro test kinaze, uočili smo da GSK3 može fosforilizovati rekombinantni BgaA-T. U isto vrijeme, varijanta BgaA-TT103A je ostala nefosforilirana (slika 4F). Ovo je potvrdilo identitet ostatka treonina unutar degron sekvence BgaA-T kao mete za fosforilaciju posredovanu GSK3 -. Ciljano rušenje GSK3 od strane siRNA (slika S7D) dovelo je do ~58 posto smanjenja K48 ubikvitinacije SPN-a (slika 4G). Ova smanjena ubikvitinacija, nakon smanjenja ekspresije GSK3, rezultirala je smanjenom sposobnošću domaćina da očisti patogene koji su napadnuti u ćelije (~1.5- puta) (slika 4H), ali nije pokazao nikakav efekat na ΔbgaA : pBgaA-TT103A (sl. S8, E i F). Zajedno, ovo pruža prvi dokaz o kinazi domaćina, konkretno GSK3, koja reguliše ubikvitinaciju površinskih proteina bakterija za efikasno uklanjanje patogena (slika 4I).

Ubikvitinacija citosolnih patogena donosi različite sudbine za njihovu eliminaciju. Konkretno, ubikvitinacija K48 promovira ciljanje supstrata prema proteazomima (22). Slično, naši rezultati sugeriraju povezanost ubikvitiniranog SPN-a s proteazomalnom podjedinicom, 7 (sl. S11, A i C). Štaviše, proteasomalna inhibicija tretmanom MG132 poboljšava postojanost WT SPN-a, ali ne mijenja sposobnost preživljavanja ΔpspAΔbgaA. Slični fenotipovi su uočeni u slučaju STm i ΔrlpA mutanta (sl. S11, B i D).

Nadzor patogena vođen degronom štiti domaćina od sepse

Zatim smo pokušali utvrditi utjecaj prepoznavanja SPN-a putem ćelijske ubikvitinacijske mašinerije na ishod infekcije. Koristeći utvrđeni model SPN sepse (38), uporedili smo virulentnost mutanta ΔbgaA sa virulentnošću WT SPN-a, kao i sojeva komplementiranih ili sa BgaA-T (ΔbgaA:pBgaA-T) ili verzijom kojoj nedostaje degron sekvenca ( ΔbgaA:pBgaA-TΔDegron). U skladu s prethodnim izvještajima (39), delecijski soj bgaA pokazao je oslabljenu virulenciju, dok su miševi zaraženi WT, ΔbgaA:pBgaA-T ili ΔbgaA: BgaA-TΔDegron podlegali infekciji (slika 5A i slika S12, A do D) . Međutim, grupa miševa inficiranih SPN sojem bez degron sekvence pokazala je veći udio smrti, ali sa odgođenom smrtnošću u poređenju sa ΔbgaA:pBgaA-T-inficiranom grupom (P=0.0492, log-rank test) (Sl. 5A). Poređenje opterećenja bakterijama u krvi (Slika 5B) i slezeni (Slika 5C) i vremenski tok vidljivih znakova bolesti kod inficiranih miševa (Slika 5D) potvrdili su trend povećane virulencije kod ΔbgaA:pBgaATΔDegron soja.

Prethodne studije su pokazale da je SPN sepsa ustanovljena iz rezervoara bakterija u slezeni (38). Dok se prvi val invazijskih bakterija u cirkulaciji brzo uklanja urođenim imunološkim mehanizmima domaćina, dio SPN-a preživi i proliferira unutar makrofaga slezene, prije nego što se ponovno zasije u krv. Pretpostavili smo da odgođeni početak teške bolesti kod miševa inficiranih ΔbgaA:pBgaA-TΔDegron može biti rezultat produženog preživljavanja SPN-a unutar makrofaga slezene, zbog smanjenog unutarćelijskog prepoznavanja bakterija od strane mašinerije za ubikvitinaciju domaćina. U prilog tome, uočili smo odloženi početak drugog talasa bakterijemije kod miševa inficiranih ΔbgaA:pBgaA TΔDegron sojem u poređenju sa ΔbgaA:pBgaA-T (24 sata u odnosu na 12 sati), nakon faze ranog uklanjanja (Slika 5E).

Međutim, u fazi pomračenja, tokom koje se bakterije uklanjaju iz krvi, broj bakterija slezene je bio konstantno veći kod ΔbgaA: pBgaA-TΔDegron-inficiranih miševa (slika 5F). Ovi nalazi upućuju na to da se faza širenja SPN-a unutar makrofaga slezene produžava u odsustvu intracelularnog prepoznavanja infekcije putem mašinerije za ubikvitinaciju. Kao rezultat toga, povećana gustina bakterija može se akumulirati u slezeni (slika 5F), koja se potom širi u krv u većem broju, što može objasniti odgođenu ali povećanu smrtnost ΔbgaA:pBgaA-TΔDegron-inficiranih miševa. Zajedno, ovi podaci pokazuju da prepoznavanje i ubikvitinacija intracelularnog SPN-a doprinose kontroli patogena tokom sepse.

For more information:1950477648nn@gmail.com