SNP Rs708727 povezan s Alchajmerovom bolešću u SLC41A1 može povećati rizik od Parkinsonove bolesti: Izvještaj iz proširene slovačke studije, dio 2

2.2. Genetske analize

Genetske analize su obavljene na A1 SNP-ovima rs11240569, rs708727 i rs823156 u kohorti od 508 pacijenata sa PD (u odnosu na 150 pacijenata u pilot studiji) i kohorti od 472 kontrolne grupe (naspram 120 kontrola u pilot studiji) [37]. Dakle, broj pacijenata sa PD i kontrolnih probanda povećan je u ovoj studiji za 34-puta i 3,9 puta, respektivno, u poređenju sa pilot studijom.

Mnogi ljudi doživljavaju gubitak pamćenja kako stare, ali kod osoba s Parkinsonovom bolešću promjene pamćenja mogu biti izraženije. Međutim, ne bismo trebali razmišljati o osobama s Parkinsonovom bolešću kao da će patiti od pada pamćenja, jer postoje stvari koje možemo učiniti da im pomognemo da održe pamćenje.

Prvo, dosljedno obavljanje nekih aktivnosti za treniranje mozga može pomoći osobama s Parkinsonovom bolešću da poboljšaju svoje pamćenje. Ove aktivnosti mogu uključivati: bavljenje sudokuom, igranje društvenih igara, rješavanje zagonetki i još mnogo toga. Kroz ove aktivnosti mogu vježbati svoje pamćenje, poboljšati funkciju mozga i pomoći im u održavanju mentalnog stanja.

Drugo, ishrana takođe ima veoma važan uticaj na pamćenje pacijenata sa Parkinsonovom bolešću. U prehranu možemo dodati namirnice bogate proteinima i nutrijentima, poput ribe, pasulja, orašastih plodova itd. Ove namirnice nam mogu pomoći da ostanemo zdravi i poboljšamo pamćenje.

Konačno, redovna vježba također može pomoći osobama s Parkinsonovom bolešću da poboljšaju svoje pamćenje. Vježbanje ne samo da nam pomaže da ostanemo fizički zdravi, već, što je još važnije, poboljšava funkciju našeg mozga. Redovnim vježbanjem mogu povećati svoju kardiopulmonalnu funkciju, povećati elastičnost mišića i kostiju te poboljšati pamćenje.

Sve u svemu, da li ljudi s Parkinsonovom bolešću doživljavaju pad pamćenja ovisi o njihovom načinu života i prehrambenim navikama, kao i da li obraćaju pažnju na stvari poput treninga mozga i vježbanja. Sve dok obraćamo pažnju na ove aspekte, verujem da se pamćenje pacijenata sa Parkinsonovom bolešću može efikasno poboljšati. Vidi se da moramo poboljšati svoje pamćenje. Cistanche deserticola može značajno poboljšati pamćenje jer je cistanche deserticola tradicionalni kineski ljekoviti materijal s mnogim jedinstvenim efektima, od kojih je jedno poboljšanje pamćenja. Efikasnost mljevenog mesa dolazi od raznih aktivnih sastojaka koje sadrži, uključujući karboksilnu kiselinu, polisaharide, flavonoide, itd. Ovi sastojci mogu promovirati zdravlje mozga kroz različite kanale.

Kliknite znati načine za poboljšanje funkcije mozga

In the sub-cohort of 96 PD patients and 100 controls, we also examined A1 SNPs rs9438393, rs56152218, and rs61822602 (first identified in the PD sub-cohort by the Sanger sequencing and afterward by RFLP analysis of the sub-cohort of controls). They were not analyzed in the pilot study (37]. The allele and genotype count and frequencies (fq) for each particular A1 SNP in the PD and the control cohorts are summarized in Table 3. The minor allele fa was, for rs11240569 (C>A) u našoj ukupnoj kohorti (PB slučajevi + kontrolni probandi), otprilike uporedivi sa rasponom fq ukupnog alela manjeg alela (MATPFR) koji su prijavile baze podataka gnomAD i ExAC, kako slijedi: fqo (opaženo) naspram za (prijavljeno) {{1 }}% ​​naspram 29-30%.

Manji alel fq za rs708727 (G > A) u našoj ukupnoj kohorti bio je viši od MATPFR u gnomAD i ExAC bazama podataka (fq, u odnosu na=40% naspram 29-30%), ali je bio uporediv sa rs708727 minor alel fq prijavljen za evropsku populaciju u bazi podataka ALFA (41%). rs823156 (A > G) minor alel fq u našoj ukupnoj kohorti bio je 17% i stoga je bio niži od MATPFR u bazama podataka gnomAD i ExAC (23-30%), ali je bio uporediv sa rs823156 manjim alelom fq prijavljen za evropsku populaciju u baza podataka ALFA (18%).

Učestalost manjeg alela rs9438393 (A > G) u ukupnoj kohorti bila je 40% i stoga je bila značajno viša od MATPFR od 26-29% prijavljenog u bazama podataka gnomAD i TOPMED, ali je bila uporediva sa rs9438393 manjim učestalost alela prijavljena u bazi podataka ALFA za evropsku populaciju (41%). Manji alel rs56152218 (T > C) u ukupnoj kohorti bio je prisutan sa fq od 38%, što je unutar MATPFR od 32-46% prijavljenih u bazama podataka ALSPAC, TOPMED i ALFA (evropska populacija).

Zanimljivo je da u populaciji Vijetnama, Koreja i Katara, manji alel je T, a ne C, kao što je uočeno u evropskoj populaciji [https://www.ncbi.nlm.nih.gov/snp/?term{{0} }rs56152218, pristupljeno 2. avgusta 2021.)]. Utvrđeno je da je fq manjeg alela u rs61822602 (G > T) 12%. Ovo je uporedivo sa frekvencijama T alela prijavljenih u bazama podataka ALSPAC i TWINSUK (12% i 13%, respektivno), ali je daleko veće od fq alela T prijavljenog u evropskoj populaciji u bazi podataka ALFA (6%).

Svi testirani A1 SNP-ovi u našoj PD i kontrolnoj kohorti bili su u Hardy-Weinbergovoj ravnoteži (HWE; Tabela 4).

Zatim smo izračunali omjere šanse (OR) manjeg alela i genotipova koji sadrže manji alel za svaki testirani SNP. Ovi rezultati su sažeti u tabeli 5. GA genotip u rs708727 bio je povezan sa PD (OR=1.42 (1.08–1.87), p=0.01) u našoj populaciji. Nadalje, testirali smo povezanost određenih genotipskih kombinacija za svaki testirani SNP sa PD u recesivnim, dominantnim i potpuno nad-dominantnim genetskim modelima (Tabela 6). U skladu s prethodnim podacima, identificirali smo povezanost rs708727 minor alela (A) s PD u dominantnim (GG vs. GA + AA) i potpuno naddominantnim (GG + AA vs. GA) genetskim modelima (ORD {{16} }.36 (1.05–1.77), p=0.02 i ORCOD=1.34 (1.04–1.72), p=0.02, respektivno). Preostali SNP-ovi nisu pokazali povezanost sa PD u testiranim genetskim modelima (tabela 6).

Također smo testirali jednakost proporcija populacije bilo koje genotipske kombinacije sastavljene od dupleta, trojki, četvorki, petorki ili sekstupleta testiranih SNP u PD kohorti (N {{0}}) i kohorti kontrola ( N=100) da ispitamo veličinu efekta interakcija između testiranih A1 SNP-ova na podložnost razvoju PD-a u našoj populaciji. Ukupno, ukupno 12 genotipskih kombinacija (dva dupleta, sedam trojki i tri četvorke, tabela 7) sa značajno (p < 0.05, 10 genotipova; p < 0,06, dva genotipa ) identifikovani su različiti brojevi u PD i kontrolnim kohortama (Tabela 7). Slijedeći Cohenove kriterije [39], koji opisuju razlike u proporcijama, samo triplet GG(rs708727) + AG(rs823156) + CC(rs61822602) od 12 genotipova pokazao je "srednju" razliku u veličini definiranu Cohenovim h(2arcsin√ –2arcsin√ prp2) Veće ili jednako 0,5.

Vrijednost h za preostalih 11 genotipova kretala se između 0.32 i 0.46 i stoga je bila unutar h intervala od 0.2 do 0.5, što definira male razlike u proporcijama (Tablica 7) [39]. Stoga bi triplet GG(rs708727) + AG(rs823156) + CC(rs61822602) mogao biti klinički značajan, te bi trebalo provesti buduća ispitivanja ovog genotipa o osjetljivosti na PD. Za rs11240569, rs708727 i rs823156, izvršili smo isti tip analize sa izvornim podacima iz kohorte od 508 pacijenata sa PD i kohorte od 472 kontrolne grupe. Četiri genotipa, dva dupleta (GG(rs11240569) + AG(rs708727), GG(rs708727) + AG(rs823156)) i dva tripleta (GG(rs11240569) + GG(rs708727) + AA(61561)314561 + GG(rs708727) + AG(rs823156)), sa značajno (p < 0,05) različitim brojem u PD i kontrolnim kohortama, identifikovani su. Cohenov h izračunat za svaki od četiri genotipa bio je ispod praga od 0,2 [39], tako da je razlika između proporcija stanovništva između testiranih grupa bila, u sva četiri slučaja, zanemarljiva.

Starenje, a zatim muški spol, smatra se najistaknutijim faktorom rizika za nastanak idiopatske PD [37]. U našoj pilot studiji, starost početka idiopatske PD u kohorti od 150 pacijenata sa PD nije bila u korelaciji sa prisustvom bilo koje genotipske kombinacije za SNP rs11240569, rs708727 i rs823156 [37]. Ovdje smo povezali starost početka PD sa (1) prisustvom svake genotipske kombinacije za SNP rs11240569, rs708727 i rs823156 u grupi od 508 pacijenata sa PD (slika 2) i (2) sa prisustvom svakog od njih. genotipska kombinacija za SNP-ove rs11240569, rs708727, rs823156, rs9438393, rs56152218 i rs61822602, u pod-kohorti pacijenata sa PD, nasumično odabranim iz PD promotivne kohorte A za sekciju A1 promotivne grupe). Otprilike u dobi od početka, jednosmjerna ANOVA analiza je otkrila da nema značajne (p < 0,05) razlike između genotipskih subpopulacija za svaki od testiranih SNP-a iu velikoj PD kohorti i u podkohorti PD pacijenata. Dakle, bilo koji određeni genotip u testiranim SNP-ovima ne utiče na dob nastanka idiopatskog oblika PD. Ovo je u potpunosti u skladu sa zaključkom iz naše pilot studije [37].

Također smo izvršili istu vrstu analize za svaki od testiranih SNP-a u podpopulacijama žena i muškaraca koje su izvedene iz velike kohorte (N=508) i podkohorte (N=96 ) pacijenata sa PD. Kao što je pokazano na dodatnim slikama S1–S3, nema značajne (p < 0.05) povezanosti između starosti početka i prisustva bilo koje određene kombinacije genotipa u testiranim SNP-ovima rs11240569, rs708727, rs823156, rs9438392, rs18615 i rs61822602 u rodno podijeljenim podgrupama izveden je ili iz velike PD kohorte (NM=306, NF=202) ili PD podkohorte odabrane za sekvenciranje A1 promotora (NM {{20} }, NF=42).

2.3. RandomForest mašinsko učenje (RF-ML)

Svi A1 SNP-ovi su testirani na njihovu sposobnost razlikovanja između pacijenata sa PD i kontrola sa RF-ML. RF-ML algoritam je obučen korištenjem naših podataka, a procijenjena je diskriminatorna važnost pojedinačnih SNP-ova tehničkom konstrukcijom, poznatom kao dubina grafa [37,40]. Kao iu našoj pilot studiji [37], prediktivna sposobnost testiranih SNP-ova je vizualizirana i kvantificirana ROC (operativna karakteristika prijemnika) krivuljama i AUC (površina ispod ROC krive), respektivno. Diskriminativna sposobnost prediktora je data unutar intervala AUC od 100% (maksimalna diskriminativna sposobnost) do 50% (minimalna diskriminatorna sposobnost); AUC < 50% odgovara da nema diskriminatorne sposobnosti.

RF algoritam je treniran u sljedećim modovima: (1) sa tri ili šest (Tabela 8) određenih A1 SNP-ova (svaki SNP, tri genotipa (AMAM/AMAm/AmAm, gdje AM označava glavni alel, a Am manji alel), kao prediktor (tri ili šest RF modela, po jedan za svaki SNP), (2) sa genotipskim dupletima uparenih SNP kao prediktorima (tri RF modela (tri SNP) ili 15 RF modela (šest SNP), po jedan za svaki par SNP-ovi; Tabela 8), (3) sa genotipskim tripletima tri SNP-a kao prediktorima (jedan RF model (tri SNP-a) ili 20 RF modela (šest SNP-a), po jedan za svaki triplet SNP-a; Tabela 8), (4) sa genotipske četvorke od šest SNP-ova kao prediktora (15 RF modela, po jedan za svaki kvadruplet; tabela 8), (5) sa genotipskim petorkama od šest SNP-ova kao prediktora (šest RF modela, po jedan za svaki petorki; tabela 8) i ( 6) sa genotipskim sekstupletom (jedan RF model, tabela 8).

Dakle, kada su singletoni, dupleti, trojke, četvorke, petorke i sekstuplet A1 SNP-ova korišćeni kao prediktori, oni nisu imali mogućnost razlikovanja između pacijenata sa PD i kontrolne grupe (Tabela 8). Stoga, prema RF-ML analizi, iu skladu s pilot studijom [37], A1 SNP-ovi nemaju potencijal da služe kao diskriminatori između kontrola i pacijenata s PD-om i, u vezi s PD, nemaju prediktivnu ili dijagnostičku vrijednost u slovačkoj populaciji. .

3. Diskusija

Lokus PARK16 je privukao pažnju u naučnoj zajednici zbog svoje povezanosti sa PD i njegove uloge u definisanju osetljivosti na ovu složenu bolest. U 2019. izvijestili smo o pilot studiji u kojoj smo analizirali povezanost tri A1 SNP-a, odnosno rs11240569, rs708727 i rs823156, s idiopatskim oblikom PD-a u slovačkoj (zapadnoslavenskoj) populaciji. Prijavljena povezanost rs11240569 i rs823156 sa osjetljivošću na PD uglavnom u azijsko-orijentalnim populacijama nije pronađena u našoj studiji [37]. Nijedna povezanost nije mogla biti potvrđena korištenjem frekvencijske statistike (konzervativne genetske analize) ili RF-ML analizom [37].

Glavno ograničenje naše pilot studije bio je, međutim, relativno mali broj pacijenata/probanda u PD i kontrolnoj kohorti (150 odnosno 120). Naglasili smo da se, sa statističke tačke gledišta, podaci moraju tumačiti oprezno zbog male veličine uzorka u obje kohorte i zbog niske statističke snage izvršenih analiza [37]. Ipak, korištenjem ML pristupa, koji zahtijeva znatno manje veličine uzorka od konvencionalne frekventne statistike ili približnog Bayesovog izračunavanja, bili smo u mogućnosti da sa povjerenjem ispitamo sposobnost određenih A1 SNP-ova da prave razliku između pacijenata sa PD i kontrola. U svim slučajevima, ML pristup je otkrio suštinski nultu dijagnostičku i prediktivnu relevantnost SNP-ova rs11240569, rs708727 i rs823156 u slovačkoj populaciji [37].

U ovoj studiji, ispitali smo ne samo tri gore pomenuta SNP-a, već i tri SNP-a (rs9438393, rs56152218 i rs61822602) lokalizovana unutar promotorskog regiona A1. Ovi SNP-ovi su identifikovani sekvenciranjem 96 PD uzoraka nakon čega je uslijedila RFLP analiza kontrolnih uzoraka i RFLP verifikacija sekvenciranih PD uzoraka. Naše genetske analize nisu otkrile u suštini nikakvu povezanost bilo kojeg od tri novoproučena SNP-a s PD. Isto važi i za rs11240569 i rs823156, koji su analizirani u PD i kontrolnoj podkohorti (96/100), kao iu kohortama od 508 pacijenata sa PD i 472 kontrolne grupe. Ovi rezultati se u potpunosti slažu s ishodom pilot studije [37]. Međutim, u velikim kohortama, rs708727 je povezan s povećanim rizikom od PD u slovačkoj populaciji.

Prema našim saznanjima, nijedna studija još nije direktno povezala A1 SNP rs708727 sa izmenjenim rizikom za razvoj PD [19,37]. U našoj proširenoj studiji (u poređenju sa pilot studijom [37]), manji alel A u rs708727 je povezan sa povećanim rizikom od pojave PD kada se testira u dominantnoj [40] (ORD=1.36 (1.05– 1.77), p=0.02) ili potpuno prevladavajući [41] (ORCOD=1.34 (1.04–1.72), p=0.02) modeli (Tabela 5). Dakle, prisustvo manjeg alela (A) u rs708727 može biti povezano sa povećanim rizikom od razvoja PD. Dok Sanchez-Mut et al. [27] i Wang et al. [42] su jasno pokazali da prisustvo manjeg alela A u rs708727 mijenja metilaciju promotora PM20D1 (a samim tim i njegovu ekspresiju) na dozno ovisan (kvantitativni) način, što je genetski model koji se najbolje uklapa u našu studiju. ukazuju da je prisustvo jednog alela rs708727 A dovoljno da promijeni osjetljivost na pojavu PD. PD-osjetljivost (fenotip), o tome da li su jedna ili dvije kopije manjeg alela prisutne u rs708727 (genotip), ostaje da se dalje detaljno razjasni.
Sanchez-Mut i dr. identificirali su PM20D1 (lokaliziran unutar PARK16 lokusa i kodira za domen peptidaze M20- koji sadrži enzim protein jedan sa aktivnostima hidrolaze i peptidaze; N-masna acil amino kiselina sintaza/hidrolaza) kao kvantitativno svojstvo metilacije i ekspresije lokus (mQTL) povezan sa haplotipom povezanim sa AD-rizikom, koji pokazuje karakteristike slične pojačivaču i kontaktira promotor PM20D1 preko haplotipa zavisne, CTCF (CCCTC-vezujuće-) hromatinske petlje posredovane transkripcionim faktorom [27]. Upoređujući uzorke zdravih kontrolnih i pacijenata sa uznapredovalim stadijumom AD, otkrili su da PM20D1 konzistentno pokazuje hipermetilaciju promotora kod pacijenata sa AD [27]. A1 SNP rs708727 korelira sa nivoima metilacije PM20D1 DNK u ljudskom frontalnom korteksu i hipokampusu [27], kao i SNP rs960603 [27]. Wang i kolege, u svom radu na perifernoj krvi, došli su do podataka koji potvrđuju da je PM20D1 mQTL posredovan prvenstveno A1 SNP-om rs708727 koji je povezan s AD-rizikom [42].

Nadalje, njihovi longitudinalni podaci pokazuju da se hipometilacija događa prije simptomatskog početka AD, moguće da bi se olakšala povećana ekspresija PM20D1 kako bi se aktivirala njegova zaštitna funkcija [42]. Napredak AD je obeležen povećanim nivoom metilacije u CpG ostrvima u DMR (diferencijalno metilovanom regionu) promotora PM20D1 kod pacijenata sa AD, što na kraju dovodi do inhibicije transkripcije i ekspresije gena [27,42,43]. PM20D1 je također povezan s dijabetesom [44], gojaznošću [45] i multiplom sklerozom [46], a budući da je lokaliziran unutar PARK16 lokusa, pretpostavlja se njegova moguća uključenost/povezanost s PD [47].

Unatoč nedostatku molekularno-mehaničkih analiza, nagađamo, u svjetlu naših trenutnih podataka, da AD i PD (i druge rjeđe neurodegenerativne bolesti) dijele ne samo "dobro poznate" patofiziološke mehanizme (npr. poremećenu mitofagiju, retromer i proteazom). funkcije), ali i epigenetski mehanizmi, kao što je A1 rs708727-zavisna regulacija ekspresije PM20D1 [27,42]. Naš rad indirektno doprinosi potrebi za detaljnim rasvjetljavanjem uloge endogenih N-acil aminokiselina (NAA) koje metabolizira PM20D1 u patobiologiji PD i drugih neurodegenerativnih poremećaja. Poznato je da NAA i N-acil konjugati neurotransmitera (NAAN) igraju važnu ulogu u neuromodulaciji [48,49]. Dokaze koji povezuju ekspresiju PM20D1 sa N-acil dopaminom (NADA) pružili su nedavni rad Song et al. Ovi autori su pokazali da brisanje kir6.2 (podjedinice za formiranje pora K+ kanala osjetljivih na ATP) dovodi do smanjenog broja mitohondrija i smanjene proizvodnje ATP-a kroz povećanje nivoa PM20D1 i agenasa koji razdvajaju disanje mitohondrija. , uključujući NADA, u mišjem srednjem mozgu [49].

NADA je moćan inhibitor 5-lipoksigenaze (5-LOX) i ima distribuciju ograničenu na mozak, pri čemu su nivoi najviši u striatumu i vrlo niski na drugim mjestima [48,50,51]. 5-LOX katalizira sintezu leukotriena ili 5-HpETE (5-hidroperoksi eikozatetraenske kiseline) iz arahidonske kiseline i povezan je s neurodegeneracijom (AD i PD) kroz učešće u neuroinflamaciji [51, 52]. Stoga predlažemo da smanjena ekspresija PM20D1, naknadno niža zastupljenost NADA i povećana aktivnost 5-LOX značajno doprinose patologiji PD (i drugih neurodegenerativnih bolesti).

Sanchez-Mut i saradnici su pokazali da prekomjerna ekspresija PM20D1 u hipokampusu mišjeg AD dovodi do poboljšanja učenja, dok njegovo uništavanje povećava opterećenje amiloidnog plaka [27]. I patologije Lewyjevog i Alchajmerovog tipa važne su u demenciji povezanoj sa PD [53]. Značajan broj pacijenata sa PD pati od pogoršanja demencije tokom bolesti [54]. Uzimajući u obzir ova zapažanja, spekulišemo da li rs708727-povezana aktivnost koja utišava PM20D1 doprinosi nastanku PD-demencije i da li praćenje aktivnosti PM20D1 može poslužiti kao prognostički parametar za početak PD-demencije.

Ranije objavljeni rad sugerirao je uključivanje Mg2+ transportera u patobiologiju PD [18–22,55]. A1, kao ključni igrač u homeostazi Mg somatskih ćelija, direktno je povezan sa PD [20–22]. Tačkaste mutacije u A1 koje dovode do supstitucija p.A350V, p.R244H i p.R285Q navodno su povezane sa PD, a pretpostavlja se da i nedostatak funkcije i gubitak funkcije mutacije u A1 imaju štetne posljedice na neurone, stoga doprinose fenotipu PD [20–22]. Ovaj rad indirektno ukazuje na mogućnost da ne samo poremećaji funkcije jezgre A1 (razmjena Na+/Mg2+) već i epigenetska regulacija ekspresije (i aktivnosti) PM20D1 povezana s A1-(rs708727) patobiologija PD.

U ovoj studiji smo identifikovali genotipski triplet GG(rs708727) + AG(rs823156) + CC(rs61822602) kao potencijalno klinički značajan (h veći ili jednak 0,5). Zanimljivo je da je rs708727 sa genotipom GG dio tripleta. Međutim, u svjetlu prethodnih istraživanja, očekivalo se da će genotip koji sadrži manji alel A u rs708727 biti povezan s potencijalnim rizikom od PD povezanih s ovim tripletom. Trenutno nismo u mogućnosti da komentarišemo bilo kakve molekularne/genetske/epigenetske interakcije koje uključuju SNP u tripletu GG(rs708727) + AG(rs823156) + CC(rs61822602), a time ni navodni doprinos ovog tripleta zbroju rizika od pojave PD.

U našoj pilot studiji koristili smo RF-ML za procjenu i interpretaciju naših podataka [37]. Glavna prednost RF-ML analize podataka je dvostruka, kako slijedi: (1) dozvoljava kvantificiranje diskriminativne sposobnosti SNP-ova između pacijenata s PD i kontrola [37], i (2) zahtijeva manje veličine uzorka za procjenu diskriminatorni značaj pojedinačnih SNP-ova ili njihovih kombinacija [37]. Nadalje, RF-ML zaobilazi problem p-vrijednosti koji se često povezuje s većim uzorcima, čak i kada su dostupni [56]. Kao iu našem prethodnom izvještaju, nije dokazano da nijedan od testiranih A1 SNP-ova ima moć razlikovanja između pacijenata sa PD i probanda koji nisu PD u našoj kohorti (tabela 8). Dakle, možemo pretpostaviti da nijedan od testiranih A1 SNP-ova nije prikladan da služi kao diskriminator PD/ne-PD u slovačkoj populaciji.

Što se tiče povezanosti A1 rs708727 sa izmenjenim rizikom za PD, rezultat naše RF-ML analize izgleda da je, na prvi pogled, kontradiktoran (Tabele 5 i 6 naspram Tabele 8). Jakobsdottir et al. u njihovoj logističkoj regresiji i analizama ROC krivulje pokazalo se da čak i jake genetske asocijacije ne garantuju automatski efikasnu diskriminaciju između slučajeva i kontrola [57]. Uprkos tome što su loši klasifikatori, SNP-ovi sa značajnim OR mogu biti vrlo vrijedni za uspostavljanje etioloških hipoteza [57]. U našem slučaju, A1 SNP rs708727 nema moć klasifikacije u pogledu PD, tako da nije od kliničkog značaja. Međutim, njegova slaba, ali značajna povezanost sa izmijenjenim rizikom za PD, omogućila nam je da spekulišemo o uključenosti rs708727 u patobiologiju PD na sličan ili isti način kao što je uključen u AD [27].

4. Materijali i metode

4.1. Učesnici studija (osnovne karakteristike)

Ukupno, 980 probanda je uključeno u studiju (508 pacijenata sa PD i 472 kontrolne grupe, ispunjavajući inkluzivne kriterijume). Idiopatski oblik PD dijagnosticirali su neurolozi u pet dijagnostičkih centara za PD (u Martinu, Bratislavi, Trenčinu, Zvolenu i Košicama) prema dijagnostičkim kriterijima PD MDS-a (Društva za poremećaje kretanja). Svi pacijenti su liječeni standardnom anti-PD terapijom. Prosječna starost pacijenata sa PD je bila 68,4 ± 9,6 godina. Prosječna starost početka bolesti bila je 61,7 ± 10,7 godina. Najmlađi slučaj dijagnosticiran je sa 34 godine, a najstariji sa 89 godina. Grupu PD činilo je 202 žena (F) i 306 muških (M) pacijenata, tako da je odnos F:M bio 1:1,5.

Kontrolnu kohortu probanda činili su vanjski i interni pacijenti sa Klinike za medicinu rada i toksikologije (Univerzitetska bolnica Martin (UHM)) i Klinike za neurologiju (UHM). U kontrolnu grupu su uključeni samo oni pacijenti kod kojih prethodno nije dijagnosticirana bilo kakva neurodegenerativna i neuropsihijatrijska bolest, poput dijabetes melitusa ili osteoporoze (sve bolesti koje su navodno povezane s promijenjenom ekspresijom A1 i deregulacijom funkcije A1). Prosječna starost kontrolnih probanda bila je 68,3 ± 11,6 godina. Kontrolnu grupu činilo je 208 ženskih i 264 muške osobe, tako da je odnos F:M bio 1:1,3 u kontrolnoj grupi.

Podkohorta pacijenata sa PD, u kojoj je sekvenciran A1 promotorski region, sastojala se od 96 nasumično odabranih subjekata. Odnos F:M bio je 1:1,3 (42 žene i 54 muškarca). Prosječna starost pacijenata u podkohorti PD bila je 67.{{10}} ± 9,5 godina. Kontrolnu podkohortu činila je 41 žena i 59 muškaraca, tako da je odnos F:M bio 1:1,4. Prosječna starost probanda u kontrolnoj podkohorti bila je 59,8 ± 5,0 godina.

Ovu studiju je odobrila Etička komisija Medicinskog fakulteta Jessenius Univerziteta Comenius (JFM CU). Odobrenje je evidentirano pod ID: EK 66/2019. Svi učesnici studije potpisali su formulare za informirani pristanak.

4.2. Obrada uzorka

Uzorci krvi su sakupljeni u BD Vacutainer® epruvete tretirane EDTA (Becton, Dickinson and Company, Franklin Lakes, NJ USA). Genomska DNK je izolirana iz svježih (UHM) ili smrznutih uzoraka krvi (drugi PD centri) korištenjem Wizard® kompleta za pročišćavanje genomske DNK (Promega Corporation, Maddison, WI, SAD) prema protokolu proizvođača. Izolovani uzorci DNK su čuvani na -80 ◦C.

4.3. Genotipizacija

Genotipizacija je izvršena na 358 uzoraka PD i 352 kontrolna uzorka. Rezultati ovih eksperimenata analizirani su zajedno sa rezultatima koje su prethodno objavili Cibulka i sar. [37]. SNP-ovi rs11240569, rs708727 i rs823156 analizirani su korištenjem TaqMan® sondi za genotipizaciju C_34251_20/rs11240569, C_375742_10/rs823156 i C{10}}/rs7087rmo (rs708727). MA SAD) na isti način kao što je ranije objavljeno [37].

4.4. Sanger Sequencing

Region promotora je podeljen na četiri preklapajuća fragmenta/amplikona, pošto je bio predugačak za jedno sekvenciranje. Prije sekvenciranja, ciljni regioni su amplificirani. Prajmeri su dizajnirani korištenjem online alata Primer3Plus [https:// primer3plus.com/cgi--bin/dev/primer3plus.cgi (pristupljeno 3. maja 2018.)]. Svaki par prajmera je provjeren na prisustvo višestrukih produkata amplifikacije pomoću PCR online alata UCSC [http://www.genome.ucsc.edu/cgi--bin/hgPcr (pristupljeno 3. maja 2018.)].

Prajmeri i PCR programi koji se koriste za amplifikaciju četiri fragmenta su sažeti u dodatnim tabelama S1 i S2. Kompozicije master mikseva za svaki fragment su sažete u SA3. Fragmenti 3 i 4 imaju visok sadržaj G i C nukleotida (67,4% i 71,9%, respektivno). Reakcioni prinos je povećan dodatkom 10× GC Rich Enhancer (Solis Biodyne, Tartu, Estonija). PCR proizvod je pročišćen upotrebom NucleoSpinTM Gela i PCR Clean-up kita (Macherey-Nagel GmbH&Co. KG, Düren, Njemačka). U sljedećem koraku, pročišćeni PCR proizvod je razrijeđen do odgovarajuće koncentracije za pred-sekvencioniranje PCR-a (SA4, SA5). Samo prednji (fw) prajmeri su korišćeni u predsekvencionom PCR-u. Reakciona mješavina je također uključivala BigDye Terminator v3.1 (Applied Biosystems, Waltham, MA, SAD) i dideoksinukleotide.

Kao rezultat, dobili smo mješavinu proizvoda različitih veličina završenih fluorescentno obilježenim dideoksinukleotidima. Proizvodi su naknadno pročišćeni upotrebom SigmaSpin Sequencing Reaction Clean-Up kompleta (Sigma-Aldrich, St. Louis, MO, SAD) prema protokolu proizvođača. Zapremina od 3 µL prečišćenog proizvoda je prebačena u 96- ploču sa bunarima zajedno sa 12 µL dejonizovanog formamida visokog kvaliteta (Applied Biosystems, Waltham, MA, SAD). Smjesa je denaturirana 5 min na 95 ◦C u termocikleru. Fragmenti su razdvojeni na 8-mikrokapilarnom uređaju ABI 3500 (Applied Biosystems, Waltham, MA, SAD). Sekvence su izvezene i vizualizovane pomoću softvera Chromas (Technelysium Pty Ltd., Južni Brizbejn, Australija). FASTA fajlovi su otpremljeni u BLAST (Basic Local Alignment Search Tool) i usklađeni sa referentnim ljudskim genomom (verzija GRCh38.p12).

Predviđanje mesta vezivanja transkripcionih faktora i njihovih promena izvršeno je onlajn alatom ConSite [dostupno na: http://consite.genereg.net/ (pristupljeno 3. septembra 2020.)] [38]. Učitane su sekvence sa glavnim alelom i sporednim alelom i generisani su spektri faktora transkripcije (TF). Analiza je izvedena bez prethodnog postavljanja minimalne specifičnosti. Promjene u profilima vezivanja TF na osnovu prisustva varijanti sumirane su u tabeli 2.

4.5. RFLP (Restriction Fragment Length Polymorphism) analiza

Komponente reakcione mešavine i PCR uslovi amplificiranog PCR-a su sažeti u SA6 i SA7. Online in silico alat NEBCutter 2.0 [http://nc2.neb.com/NEBcutter2 / (pristupljeno 14. februara 2020.)] korišten je za dizajniranje ograničenja amplikona. Za RFLP analizu odabrani su sljedeći restrikcijski enzimi: Hpy166II (detekcija rs9438393), NIaIII (detekcija rs56152218) i BmrI (detekcija rs61822602). Svi enzimi su kupljeni od New England Biolabs. Za varijantu rs144056491, nismo bili u mogućnosti dizajnirati RFLP eksperiment, jer nije bio dostupan odgovarajući enzim. Nakon ograničenja, očekivali smo da će fragmenti sažeti u SA8 formirati prinos. Nakon restrikcije, proizvodi su razdvojeni elektroforezom u agaroznom gelu (NIaIII i Hpy166II 1% gel; BmrI 2% gel) i zatim vizualizirani na PharosFX instrumentu (Bio-Rad Laboratories). Određeni su genotipovi za svaki SNV.

4.6. Analiza podataka

Podaci su istraženi i analizirani korištenjem R [R Core Team (2021); R: jezik i okruženje za statističko računanje. R Fondacija za statističko računarstvo, Beč, Austrija. URL https://www.R-project.org/, ver. 4.0.5 (2021-03-31)]. Studija genetičke asocijacije (GAS) i analiza snage obavljeni su korištenjem R biblioteka HardyWeinberg [Jan Graffelman (2015); Istraživanje dijalelnih genetskih markera: HardyWeinbergov paket. Journal of Statistical Software, 64(3), 1-23. URL https://www.jstatsoft.org/v64/i03/], DescTools [Andri Signorelli et al. (2021); DescTools: Alati za deskriptivnu statistiku. R paket verzija 0.99.41.], epitools [Tomas J. Aragon (2020); epitools: Epidemiology Tools. R paket verzija 0.5-10.1. URL https://CRAN.R-project.org/package=epitools], pwr [Stephane Champely (2020); pwr: Osnovne funkcije za analizu snage. R paket verzija 1.3-0. URL https://CRAN.R-project.org/package=pwr] i in-house razvijen kod. RandomForest prediktivno modeliranje je izvedeno sa R ​​bibliotekom randomForestSRC [Ishwaran H. and Kogalur UB (2021); Brze objedinjene nasumične šume za preživljavanje, regresiju i klasifikaciju (RF-SRC), R paket verzija 2.11.0.]. Podaci su vizualizirani pomoću R biblioteke pčela [Aron Eklund (2021); beeswarm: Zaplet pčelinjeg roja, alternativa Stripchartu. R paket verzija 0.3.1. URL https://CRAN.R-project.org/package=beeswarm]. Jednosmjerna ANOVA je korištena za testiranje nulte hipoteze o jednakosti srednje dobi početka populacije za tri subpopulacije genotipa za svaki SNP. Nalazi sa p-vrednošću ispod 0,05 smatrani su statistički značajnim.

5. Zaključci

Ukratko, naši podaci sugeriraju slabu, ali značajnu povezanost A1 SNP rs708727 s PD u dominantnim i naddominantnim genetskim modelima u slovačkoj populaciji. Nijedan od ostalih testiranih A1 SNP-ova (rs11240569, rs823156, rs9438393, rs56152218 i rs61822602) nije bio povezan sa bolešću ni u jednom od testiranih genetskih modela. RF-ML analize su identifikovale sve testirane A1 SNP kao loše klasifikatore/prediktore PD, tako da je njihova upotreba u kliničkoj praksi kao dijagnostičkih ili prognostičkih markera i dalje zanemarljiva. Međutim, povezanost rs708727 sa PD omogućila nam je da spekulišemo da manji alel povezan sa PD-rizikom (G > A) u rs708727 doprinosi nastanku i progresiji bolesti preko poremećaja epigenetske regulacije ekspresije PM20D1, mehanizma za koji je poznato da igra važnu ulogu. u patobiologiji AD. Ovu hipotezu treba dalje ispitati kako bi se dala konačna izjava. Nadalje, treba razjasniti moguću povezanost između demencije povezane s PD i rs708727.

Doprinosi autora:

Konceptualizacija, MK; metodologija, MK, MC, MG (Marian Grendar) i MB; softver, MG (Marian Grendar); validacija, MC, MB i MK; formalna analiza, MK, MG (Marian Grendar), MC, AS, ZL, ZP, TS, SS i MG (Milan Grofik); istraga, MC i MB; kuriranje podataka, MC, MB, MG (Marian Grendar), MG (Milan Grofik), JN, VN i EK; pisanje—priprema originalnog nacrta, MK; pisanje—recenzija i uređivanje, MC, MG (Marian Grendar) i ZP; vizualizacija, MK, MC i MG (Marian Grendar); nadzor, MK; administracija projekta, MC, MK, MG (Milan Grofik), JN, JB, VH, VN, EK, MS i BV; finansiranje nabavke, MK Svi autori su pročitali i složili se sa objavljenom verzijom rukopisa.

finansiranje:

Ovaj rad podržali su Slovačka agencija za istraživanje i razvoj, grant broj APVV-19-0222, i Agencija za naučne grantove Ministarstva obrazovanja, nauke, istraživanja i sporta Slovačke Republike i Slovačke akademije nauka, grant broj VEGA 1/0554/19, oba MK

Izjava institucionalnog odbora za reviziju:

Studiju je odobrila Etička komisija Medicinskog fakulteta Jessenius Univerziteta Komenski (JFM CU). Odobrenje je evidentirano pod ID: EK 66/2019.

Izjava o informiranom pristanku:

Od svih subjekata uključenih u studiju dobijen je informirani pristanak.

Izjava o dostupnosti podataka:

Kompletan skup podataka sadržan je u članku. Priroda i obim uključenih podataka omogućavaju dalju meta-analizu. Sve informacije u vezi sa studijom dostupne su na zahtjev od odgovarajućeg autora.

Priznanja:

Zahvaljujemo se svim učesnicima studije i članovima njihovih porodica. Zahvaljujemo se i Martinu Maraku (JFM CU) za njegovu kompetentnu tehničku podršku projektu, Janu Radvanszkyju i Rastislavu Hekelu (obojica GENETON sro) za korisne savjete o analizama promotera A1, te Theresi Jones za uređivanje jezika rukopis.

Sukobi interesa:

Autori izjavljuju da nema sukoba interesa.

Reference

1. Tatarkova, Z.; de Baaij, JHF; Grendar, M.; Aschenbach, JR; Racay, P.; Bos, C.; Sponder, G.; Hoenderop, JGJ; Röntgen, M.; Turcanova Koprusakova, M.; et al. Dijetalni unos Mg2+ i izmjenjivač Na+/Mg2+ SLC41A1 utječu na komponente mitohondrijalne energije u kardiomiocitima miša. Int. J. Mol. Sci. 2020, 21, 8221. [CrossRef] [PubMed]

2. Yamanaka, R.; Tabata, S.; Shindo, Y.; Hotta, K.; Suzuki, K.; Soga, T.; Oka, K. Mitohondrijska Mg2+ homeostaza odlučuje o metabolizmu ćelijske energije i osjetljivosti na stres. Sci. Rep. 2016, 6, 30027. [CrossRef] [PubMed]

3. Dudev, T.; Grauffel, C.; Lim, C. Kako prirodni i vanzemaljski metalni katjoni vezuju ATP: implikacije za litijum kao terapeutski agens. Sci. Rep. 2017, 7, 42377. [CrossRef] [PubMed]

4. Kolisek, M.; Zsurka, G.; Samaj, J.; Weghuber, J.; Schweyen, RJ; Schweigel, M. Mrs2p je bitna komponenta glavnog elektroforetskog sistema Mg2+ priliva u mitohondrije. EMBO J. 2003, 22, 1235–1244. [CrossRef] [PubMed]

5. Schindl, R.; Weghuber, J.; Romanin, C.; Schweyen, RJ Mrs2p formira selektivni kanal visoke provodljivosti Mg2+ u mitohondrijima. Biophys. J. 2007, 93, 3872–3883. [CrossRef] [PubMed]

6. Kolisek, M.; Sponder, G.; Pilchova, I.; Cibulka, M.; Tatarkova, Z.; Werner, T.; Racay, P. Ekstravaganca magnezijuma: kritični zbornik trenutnih istraživanja ćelijskih Mg2+ transportera osim TRPM6/7. Rev. Physiol. Biochem. Pharmacol. 2019, 176, 65–105. [CrossRef]

7. Kubota, T.; Shindo, Y.; Tokuno, K.; Komatsu, H.; Ogawa, H.; Kudo, S.; Kitamura, Y.; Suzuki, K.; Oka, K. Mitohondrije su intracelularne zalihe magnezijuma: ispitivanje simultanim fluorescentnim slikanjem u PC12 ćelijama. Biochim. Biophys. Acta 2005, 1744, 19–28. [CrossRef]

8. Sponder, G.; Abdulhanan, N.; Fröhlich, N.; Mastrototaro, L.; Aschenbach, JR; Röntgen, M.; Pilchova, I.; Cibulka, M.; Racay, P.; Kolisek, M. Prekomjerna ekspresija Na+/Mg2+ izmjenjivača SLC41A1 umanjuje signalizaciju za preživljavanje. Oncotarget 2017, 9, 5084–5104. [CrossRef] [PubMed]

9. Yamaguchi, H.; Wang, HG Protein kinaza PKB/Akt reguliše preživljavanje ćelija i apoptozu inhibirajući Bax konformacione promene. Oncogene 2001, 20, 7779–7786. [CrossRef]

10. Vauzour, D.; Vafeiadou, K.; Rice-Evans, C.; Williams, RJ; Spencer, JP Aktivacija Akt i ERK1/2 signalnih puteva za preživljavanje leži u osnovi anti-apoptotičkih efekata flavanona u kortikalnim neuronima. J. Neurochem. 2007, 103, 1355–1367. [CrossRef]

11. Muddapu, VR; Dharshini, SAP; Chakravarthy, VS; Gromiha, MM Neurodegenerativne bolesti — da li je metabolički nedostatak osnovni uzrok? Front. Neurosci. 2020, 14, 213. [CrossRef] [PubMed]

12. Pathak, D.; Berthet, A.; Nakamura, K. Energetski nedostatak: Da li doprinosi neurodegeneraciji? Ann. Neurol. 2013, 74, 506–516. [CrossRef] [PubMed]

13. Dharshini, SAP; Taguchi, YH; Gromiha, MM Istraživanje energetske krize kod Alchajmerove bolesti korišćenjem studije transkriptoma. Sci. Rep. 2019, 9, 18509. [CrossRef] [PubMed]

14. Twig, G.; Shirihai, OS Interplay između mitohondrijske dinamike i mitofagije. Antioksid. Redox Signal. 2011, 14, 1939–1951. [CrossRef] [PubMed]

15. Zhao, W.; Zhang, W.; Ma, H.; Yang, M. NIPA2 reguliše funkciju osteoblasta modulacijom mitofagije kod dijabetesne osteoporoze tipa 2. Sci. Rep. 2020, 10, 3078. [CrossRef]
16. Nadler, MJ; Hermosura, MC; Inabe, K.; Perraud, AL; Zhu, Q.; Stokes, AJ; Kurosaki, T.; Kinet, JP; Penner, R.; Scharenberg, AM; et al. LTRPC7 je Mg. ATP-regulisani dvovalentni kationski kanal potreban za vitalnost ćelije. Nature 2001, 411, 590–595. [CrossRef]

17. Kolisek, M.; Nestler, A.; Vormann, J.; Schweigel-Röntgen, M. Ljudski gen SLC41A1 kodira za Na+/Mg2+ izmjenjivač. Am. J. Physiol. Cell Physiol. 2012, 302, C318–C326. [CrossRef]

For more information:1950477648nn@gmail.com