Alternativni terapijski pristupi konvencionalnim antibioticima: prednosti, ograničenja i potencijalna primjena u medicini Ⅱ

4. Antimikrobni peptidi

Posljednjih godina, epidemije i epidemije su pokazale da javno zdravlje može biti ugroženo globalno u smisluzarazne bolesti, tako da ovaj problem hitno zahtijeva pronalaženje alternativa zatradicionalni antibioticikoje su nove i manje sklone otpornosti bakterija. U potrazi za novimantibiotici,antimikrobni peptidi(AMP), također poznati kao peptidi za odbranu domaćina, nedavno su dobili veliko interesovanje [146–148]. AMP su klasa malih peptida koji postoje široko u prirodi i važne su komponente urođenog imunološkog sistema različitih organizama. Imaju širok inhibitorni učinak na bakterije, gljivice, parazite i viruse. Otkriveni su 1939. godine, nakon otkrića lizozima 1922., kada je mikrobiolog Rene Dubos izolirao soj Bacillus iz tla, antibakterijsko sredstvo zvano gramicidin, za koje se pokazalo da štiti miševe od pneumokokne infekcije [149]. Nakon toga, nekoliko AMP je identificirano i u prokariotskom i u eukariotskom kraljevstvu [150]. Prvi opisani AMP životinjskog porijekla bio je defensin, koji je izoliran iz leukocita kunića [151], kasnije je laktoferin identificiran u kravljem mlijeku, a pokazalo se da lizosomi ljudskih leukocita i ljudski ženski reproduktivni trakt sadrže AMP niske molekularne težine [152]. Do danas je više od 3000 AMP-ova otkriveno, okarakterizirano i označeno u AMP bazi podataka (APD3) [153]. 

Trenutna istraživanja fokusiraju se na ove prirodne spojeve kao inovativneantiinfektivnih lijekovai novi imunomodulatori [148,154], ali i u hrani, stočarstvu, poljoprivredi i akvakulturi. Interes za AMP je nedavno povećan tokom pandemije teškog akutnog respiratornog sindroma koronavirusa 2 (SARS-CoV-2) u potrazi za novim antivirusnim molekulima za suzbijanje COVID-19 [154]. 

Kliknite ovdje da biste dobili više detalja o Cistanche Herbs As

Alternativni terapijski pristupi konvencionalnim antibioticima

4.1. Prednosti

Od otkrića prirodnih bioaktivnih AMP-ova sposobnih da u velikoj mjeri pogode više patogena, terapeutici zasnovani na peptidima su pod lupom istraživača. AMP inhibiraju širok spektar mikroorganizama kroz različite i posebne mehanizme prvenstveno ciljajući ćelijske membrane ili specifične intracelularne komponente [155]. AMP su potencijalni multifunkcionalni terapeutski agensi, koji su efikasni protiv širokog spektra mikroorganizama. Zovu se "prirodni antibiotici". Neki AMP mogu uzrokovati brzu smrt gram-pozitivnih i gram-negativnih, gljivica, parazita, inkapsuliranih virusa ili tumorskih stanica u roku od nekoliko minuta. AMP imaju nizak rizik od razvoja rezistencije i čak mogu inhibirati mikroorganizme otporne na antibiotike [155]. Ovaj princip proizlazi iz činjenice da AMP općenito (ali ne uvijek, kao što je gore navedeno) pogađaju lipidnu komponentu plazma membrane, ćelijsku komponentu za koju se inherentno smatra da je teško promijeniti u svojim osnovnim fizičko-hemijskim karakteristikama mikrobnim ciljevima.

Konačno, AMP se sve više vidi kao obećavajuća terapijska alternativa za liječenje infekcija povezanih s biofilmom, jedne od glavnih prijetnji u području bakterijskih infekcija. Sve ove prednosti čine AMP idealnim kandidatima za farmakološku primjenu. AMP ispoljavaju svoje antimikrobne efekte prvenstveno kroz dva različita mehanizma. AMP-ovi koji ciljaju na membranu mijenjaju strukturni integritet ćelijske membrane, dok AMP-ovi koji koriste mehanizme ne-membranskog ciljanja prvenstveno inhibiraju sintezu nukleinskih kiselina, esencijalnih enzima i drugih funkcionalnih proteina. Ovi novi proteini mogu biti prirodnog ili sintetičkog porijekla. AMP iz mnogih vrsta, uključujući vodozemce, insekte, sisare i ribe, čine 75,65 posto ukupnih AMP, dok je ostatak uglavnom iz biljaka i bakterija i čini 13,5 posto i 8,53 posto ukupnih AMP, respektivno [156]. Bakterijski AMP se često nazivaju bakteriocini, efikasni u nižim koncentracijama od AMP i imaju ograničen učinak na nekoliko vrsta. Bakteriocini pokazuju antimikrobnu aktivnost i inhibiraju glavne mikrobne konkurente [157,158]. Zanimljivo je da je otpornost na antibiotike i bakteriocine nezavisna i do sada nije zabilježena unakrsna rezistencija [159]. Geni uključeni u proizvodnju bakteriocina su dio mobilnih genetskih elemenata kao što su konjugativni transpozoni (nizin) i plazmidi (laktokok 972) [160]. To olakšava njihovo razmnožavanje i objašnjava, na primjer, sposobnostP. pentosaceusiLactobacillussintetizirati PA1/AcH predviđanje [161]. Može se zaključiti da su bakteriocini nova perspektiva za prevazilaženje problema rezistencije pod uslovom da se temeljno razume mehanizam delovanja ovih molekula i njihova degradacija. Zauzvrat, poznato je da je morsko okruženje jedan od najbogatijih izvora AMP, uključujući okeane koji pokrivaju nešto više od 70 posto Zemlje. Za razliku od kopnenog okruženja, oni su prilagodljiviji na teške životne uslove, kao što je visok salinitet [156,162]. AMP-ovi biljnog porijekla su peptidi koji pokazuju snažno antimikrobno djelovanje širokog spektra. Osim snažnog mikrobicidnog djelovanja biljnih AMP protiv virusa, bakterija, gljivica, parazita i protozoa, oni također imaju djelovanje protiv insekata i protiv oomiceta i štetočina biljojeda, te djelovanje protiv raka nekih stanica raka [155,156,162,163]. Što se tiče AMP insekata, oni igraju važnu ulogu u humoralnom imunološkom sistemu. AMP insekata sintetiziraju se u tjelesnoj masti insekata i skladište u hemolimfi [164]. Do danas je identifikovano preko 200 AMP kod insekata

Unatoč raznolikosti mnogih prednosti AMP ekstrahiranih iz prirodnih izvora, oni imaju niz nedostataka, uključujući lošu stabilnost, toleranciju soli i visoku toksičnost, što ometa njihovu široku terapijsku upotrebu, otuda i pojavu sintetičkih AMP-ova. Razvijeno je nekoliko metoda za dizajniranje novih sintetičkih AMP-ova modificiranjem sekvenci AMP-a koji su prirodno prisutni u različitim organizmima. Pokazalo se da male promjene u sastavu aminokiselina mogu rezultirati promjenama svih konformacijskih i fizičko-hemijskih svojstava peptida [165]. Sve u svemu, ovi AMP su sigurni, bez ili sa manje toksičnih nuspojava i teško izazivaju otpornost bakterija na lijekove u usporedbi s konvencionalnim antibioticima [166]. 

4.2. Primjena u medicini

AMP su multifunkcionalni agensi s nekoliko terapijskih funkcija kao što su protuupalne, imunomodulatorne, aktivnosti neutralizacije endotoksina i citotoksični efekti na stanice raka, što ih čini dobrim kandidatima za farmakološku praksu, pored njihovih direktnih antimikrobnih učinaka [167,168]. Brze aktivnosti širokog spektra, raznovrsne mogućnosti upotrebe i nizak potencijal za razvoj rezistencije na AMP su glavni faktori koji povećavaju njihovu privlačnost u biofarmaceutskoj industriji i ulaganja u tržište peptidnih antibiotika. Nekoliko studija je izvijestilo o važnosti nizina u liječenju nekoliko zaraznih bolesti, kao što su mastitis, oralni, respiratorni i kožni [148,152,169]. Mastitis je česta upalna bolest u dojilja koja rezultira prestankom laktacije [170]. Staphylococcus aureusiStaphylococcus epidermidissu dva uobičajena agensa koja uzrokuju infekcije povezane s mastitisom [170]. Peptid nizin uzrokuje inhibiciju rasta bakterija kroz formiranje membranskih pora i prekidanjem biosinteze staničnog zida kroz specifičnu interakciju lipida II [171]. Još jedan primjer bakterijski izvedenih AMP-ova koji se klinički koriste kao alternativa antibioticima je gramicidin, koji je mješavina gramicidina A, B i C. To su AMP-ovi koje prirodno proizvodiBrevibacillus brevis, s aktivnošću protiv nekoliko gram-pozitivnih bakterija, izazivajući depolarizaciju membrane i posljedično ćelijsku lizu [152,172,173]. Gramicidin je sastavni dio Neosporina®, trostruki antibiotik koji se koristi u oftalmološkim i lokalnim preparatima [152]. Odobren je i plasiran na tržište kao anionski AMP za liječenje kožnih infekcija uzrokovanih Gram-pozitivnim bakterijama [174]. Nedavna studija je pokazala da predtretman tahiplezinom III na miševima štiti od njihPseudomonas aeruginosaiAcinetobacter baumanniiinfekcija, smanjuje proizvodnju proinflamatornih citokina (IL-1 , IL-6 i TNF- ) i inducira fagocitozu makrofaga, ključnu za klirens bakterija na način ovisan o dozi [152,175]. Svi ovi nalazi moraju biti potvrđeni u kliničkim ispitivanjima na ljudima. S obzirom na široku lepezu AMP-ova koji postoje u prirodi, očekuje se da bi drugi novi farmakološki aktivni peptidi inspirisani prirodom mogli naći kliničku primjenu u budućnosti.

4.3. Ograničenja

Iako AMP ima mnogo prednosti, samo tri AMP je odobrila američka FDA za terapijsku upotrebu, naime, gramicidin, kolistin i daptomicin [176]. Gramicidin je aktivan protiv niza gram-pozitivnih i gram-negativnih bakterija, iako njegova teška toksičnost za ljudske eritrocite ima kliničku indikaciju ograničenu na lokalnu primjenu. Polimiksin i kolistin, koji su kationski peptidi koji se koriste decenijama, u novije vrijeme ponovo su se pojavili zbog njihove snažne aktivnosti protiv MDR gram-negativnih patogena. Njihova sposobnost da vežu komponentu lipida A LPS-a čini ih vrijednim oružjem, posljednjim resursima za borbu protiv septičkog šoka, bez obzira na njihovu poznatu nefrotoksičnost. Međutim, otpor se pojavio i širi se alarmantnom brzinom, ugrožavajući efikasnost ovih vrijednih terapeutika. Što se tiče daptomicina, ovaj ciklični lipopeptid vezan za membranu dobio je zeleno svjetlo od strane FDA 2003. za liječenje gram-pozitivnih infekcija. Zadnjih godina,Staphylococcus aureusrezistencija se sve više javlja i potraga za zamjenama koje mogu produžiti kliničku upotrebu ovog važnog antibiotika je aktivno u toku. Pored gore opisane otpornosti na AMP, postoji nivo poteškoća u dovođenju ovih molekula na tržište, bilo za lokalni ili sistemski tretman. Polyphor's faza 3 klinička ispitivanja sigurnosti i efikasnosti intravenskog murepavadina su prerano prekinuta zbog povišenih nivoa kreatinina u serumu kod pacijenata liječenih AMP, što ukazuje na zatajenje bubrega [177]. 

5. Nanočestice

Prvi tragovi empirijske upotrebe nanočestica od strane čovječanstva datiraju još iz carstva Maja (800. godine prije Krista), koristili su plavu boju koja je mogla odoljeti vremenskim uvjetima napravljena od mješavine nanoporozne gline i boje koja sadrži metalne nanočestice [178]. Proizvodnja nanočestica je brzo rastuća tema za biomedicinsku primjenu, posebno u liječenju tumora i njihovoj dijagnostici, od početka 1970-ih i eksponencijalno od 2000-ih [179]. Ove izvanredne karakteristike (optičke, fizičke, termičke, hemijske, itd.) nano-objekata omogućavaju njihovu upotrebu kao vektora, kao iu dijagnostičke i terapeutske svrhe. Nanotehnologije posvećene medicinskoj primjeni danas se definiraju pod pojmom "nanomedicina". Nanočestice s antimikrobnim djelovanjem su neorganske čestice nanometričke veličine. Oni mogu napasti membranu bakterija ili kvasca i prodrijeti u ove patogene kako bi stupili u interakciju sa specifičnom metom, ali i potaknuti proizvodnju slobodnih radikala. Što je još važnije, višestruki i jedinstveni mehanizmi djelovanja nanočestica čine malo vjerojatnim da bakterije razviju otpornost i mogu pomoći u ograničavanju globalne krize nove bakterijske rezistencije [179,180]. 

5.1. Prednosti

Nanomedicina je isporuka lijeka korištenjem nano vektora koji omogućavaju transport i oslobađanje aktivnog sastojka na njegovom farmakološkom cilju. Ovaj pristup, dakle, povećava efikasnost lijekova i ograničava njihove štetne efekte modulacijom farmakokinetičkog puta i biodostupnosti [181]. Jedinstvena antibakterijska svojstva prisutna su u metalnim nanočesticama (MNP) napravljenim od srebra, zlata, cink oksida i titanijum oksida. Njihov hemijski sastav omogućava duže vezivanje, aktivno ciljanje antibiotika sa površinskom funkcionalizacijom na ciljnoj lokaciji i zaštitu od razgradnje enzima [182]. Najzanimljiviji dio je da oni mogu isporučiti antibiotike u intracelularni odjeljak gdje je patogen. Tako poboljšavaju stabilizaciju lijeka, povećavaju cirkulaciju lijeka i obezbjeđuju poboljšanu isporuku na cilj i veću efikasnost liječenja. Paralelno, smanjuju toksičnost i nuspojave, povećavaju antibakterijski spektar i smanjuju potrebnu dozu lijeka, pa čak i vrijeme liječenja [183,184]. Sve ove prednosti čine njihovu upotrebu među najperspektivnijim strategijama za prevladavanje rezistencije na antibiotike [185]. 

5.2. Primjena u medicini

Nanobiotici su antibiotici sljedeće generacije i mogu se koristiti kao lijekprotiv bakterijskih infekcija uglavnom intracelularnih bakterija. Antibakterijska svojstvaplemenitih metala (uglavnom bakra i srebra) poznati su od davnina i koriste se u svakodnevnom životu. Na primjer, neke bolnice su opremile kvake na vratima bakrenim premazom kako bi ograničile prijenos bakterija u bolničkom okruženju [186]. Studije nanočestica su pokazale in vitro antimikrobnu aktivnost protiv MDR organizama, uključujući ESKAPE patogene (Enterococcus faecalis, Staphylococcus aureus, Klebsiella pneumoniae, Acinetobacter baumannii, Pseudomonas aeruginosaiEnterobacter) [180,187–189]. Zapravo, studija je jasno utvrdila antibakterijsku aktivnost zavisnu od doze nanočestica srebra protiv enterobakterija poputEscherichia coliiliKlebsiella pneumoniaesa počasnim MIC-om od oko 1,4µg/mL, kao i antibakterijska aktivnost gentamicina, cefotaksima i meropenema prema ovim vrstama povećana je uz istovremeno prisustvo nanočestica srebra [190]. Druge studije su pokazale i in vitro i in vivo efikasnost protiv gram-pozitivnih i gram-negativnih bakterija [191,192]. Nadalje, mogao bi biti alternativa u liječenju tuberkuloze, koja je veliki zdravstveni problem koji inficira milione ljudi širom svijeta. Zloupotreba lijekova prve linije može dovesti do MDR tuberkuloze, koja se zatim liječi kemoterapijom ili lijekovima druge linije kao što je etionamid (ETH). Međutim, pacijentima je često teško pridržavati se režima liječenja koji zahtijevaju visoke doze ETH. Nanočestice bi mogle inkapsulirati sinergističke lijekove, što bi uvelike pojednostavilo liječenje i povećalo pridržavanje pacijenata [181]. Na kraju, sve ove studije ostaju na eksperimentalnom nivou, in vitro ili in vivo koristeći životinjske modele. Klinički prijevod zahtijeva temeljito razumijevanje farmakokinetike i farmakodinamike NP-a i procjenu njihove toksičnosti na ćelijskom i sistemskom nivou [180]. Stoga se pokazalo da su metalni nanobiotici učinkovitiji od samih antibiotika zbog svoje stabilnosti u slučaju infekcija uzrokovanih unutarćelijskim klicama [193–195]. U praksi, nan obiotici bi obezbijedili sisteme za isporuku lijekova za sistemske, oralne, transdermalne ili druge metode primjene, bolje antibakterijsko zavoje rana, odlične obloge za medicinske uređaje za implantaciju i efikasnije antibakterijske adjuvanse za vakcinu [193].

5.3. Kombinacija

TerapijaNanočestice se mogu kombinovati sa antimikrobnim lekovima (antibiotici, antivirusni, antifungalni). Kombinacija sa molekulama antibiotika je najviše dokumentovana, a nazivaju se nanobiotici [196]. MNP se koriste zbog smanjene cijene, jednostavne sinteze i upotrebe [193]. MNP se baziraju na različitim vrstama metala: uglavnom zlatu (Au), srebru (Ag), oksidu bakra (CuO), oksidu željeza (Fe3O4 ili Fe2O3), titanijum dioksid (TiO2), i cink oksid (ZnO) [193]. Srebrne nanočestice (AgNP) se koriste ne samo u istraživačkim laboratorijama, već iu polju ljudi i veterine zbog svojih katalitičkih, jedinstvenih optičkih i bioloških svojstava. Glavna prednost nanočestica zlata (AuNP) je njihova jednostavna proizvodnja i modifikacija pomoću jednog ili više hemijski različitih tiolnih liganda i smatraju se najmanje toksičnim MNP [182]. Budući da MNP djeluju kao nosači lijekova, oni olakšavaju transport antibiotika do površine ćelije. Ova interakcija između nanočestica i antibiotika povećava koncentraciju antimikrobnih lijekova na specifičnim lokacijama na ćelijskoj membrani. Posebno se poboljšava kontakt sa ćelijama i povećava propusnost membrana afinitetom AgNP-a i AuNP-a za proteine ​​bakterijskih ćelijskih membrana koji sadrže sumpor. To olakšava antibioticima da uđu u ćeliju [194].

5.4. Ograničenja

Nanočestice predstavljaju rizik za ljudsko zdravlje uprkos svojim odličnim kvalitetima i širokom spektru primjena. Studije provedene in vitro i in vivo pokazale su da MNP mogu ući u stanice i uzrokovati oksidativni stres, upalu, oštećenje DNK i toksičnost organa, što ograničava njihovu upotrebu [197,198]. Glavna svojstva MNP-a odgovorna za njihov toksikološki učinak pripisuju se:• Veličina, zbog njihove brze difuzije u ljudske ćelije i njihove sposobnosti da prođu kroz krvno-moždanu barijeru (200 nm). NP ispod 10 nm često pokazuju značajnu antibakterijsku aktivnost, ali i visoku citotoksičnost;Aglomeracija, koja pomaže u procesu sedimentacije i usporava difuziju NP što povećava efektivne doze;

• Površinski naboj, da bi se kontroliralo vezivanje proteina za NP, staničnu uzimanje, oksidativni stres, autofagiju, upalu i apoptozu, naboj NP-a je ključan (pokazano je da su nabijeni NP-ovi više citotoksični od neutralnih oblika, a pozitivno nabijeni NP-ovi su više citotoksični od negativnih varijanti slične veličine). Trenutno, MNP-ovi mogu biti dizajnirani da smanje njihovu toksičnost za ljude [199]. Veličina se može prilagoditi za optimalnu efikasnost, a sredstva za zatvaranje mogu se koristiti za sprječavanje aglomeracije, izbjegavanje neželjene oksidacije nanočestica i poboljšanje oslobađanja jona. Često korišteni agensi za zatvaranje su oleinska kiselina, poliakrilna kiselina, polietilen glikol (PEG), polivinil alkohol (PVA) i polivinilpirolidon (PVP) [200,201].

6. Eterična ulja

Prirodni proizvodi, kao što su ljekovito bilje, eterična ulja (EO) i biljni ekstrakti, smatraju se obećavajućim alternativnim agensima. EO su među ekonomski najrelevantnijim proizvodima biljnog porijekla, često su odgovorni za nekoliko svojstava koja promiču zdravlje [202,203]. EO formiraju MAP kao sekundarni metaboliti i vrlo su heterogene mješavine koje mogu sadržavati desetine spojeva u različitim koncentracijama [204]. Trenutno je poznato preko 3000 EO, od kojih je 10 posto komercijalno i ekonomski relevantno. Ovi proizvodi su potencijalni rezervoari mnogih bioaktivnih spojeva s nekoliko korisnih svojstava i usklađeni su s trenutnim preferencijama potrošača za prirodnim proizvodima. Oni također nude prednost što se bolje podnose u ljudskom tijelu uz manje nuspojava [205,206]. 

6.1. Prijave EO

U prirodi, EO igraju važnu ulogu u zaštiti biljaka, djelujući kao antibakterijski, antivirusni, antifungalni i insekticidni, a također i protiv biljojeda smanjujući njihov apetit za takvim biljkama. Oni također mogu privući određene insekte kako bi pogodovali raspršivanju polena i sjemena ili odbili druge koji su nepoželjni. Zbog svojih baktericidnih i fungicidnih svojstava, također se koriste kao alternativa sintetičkim kemijskim proizvodima za zaštitu ekološke ravnoteže bez istih sekundarnih efekata [207,208]. EO se koriste više od 5000 godina u različitim kulturama iu različite svrhe, uključujući ličnu njegu (parfemi i kozmetika), hranu, kućnu njegu, repelente za ljude i životinje (stoku i domaće životinje) i sredstva za promicanje zdravlja za liječenje raznih bolesti [203,209–211]. Općenito je poznato da EO ispoljavaju različite farmakološke učinke, kao što su antialergijski (lavanda, žalfija), antikancerogen (salvija), protuupalni (eukaliptus, lavanda), analgetski (lavanda), anksiolitički (koromač), antidepresiv (citron) imunomodulatorni ( eukaliptus) antibakterijsko (karanfilić, kim, timijan, origano), antifungalno (kurkuma, lavanda, eukaliptus), antivirusno (eugenol, eukaliptus, đumbir trava, karanfilić), insekticidno (artemizija, eukaliptus, antioksidans lave, lavande), , aneth) [206,212–214]. Također, EO bi se mogli koristiti kao alternativni konzervansi za produženje roka trajanja žitarica i usjeva i za sigurnost hrane [215]. Dakle, sastav i farmakološka svojstva EO su predmet velikog istraživačkog interesa.

6.2. Antimikrobni efekat EO

EO i njihove glavne komponente su se pokazale efikasnim u kontroli širenja određenih bakterijskih agenasa. Antibakterijska svojstva EO-a poznata su dugo vremena i danas postoji veliki broj važnih publikacija koje su potvrdile njihovo bakteriostatsko i baktericidno djelovanje protiv patogenih bakterijskih sojeva, čak i pri vrlo niskim koncentracijama [216,217]. Nekoliko molekula prisutnih u EO ima antibakterijska svojstva, posebno fenole (kao što su karvakrol, timol i eugenol), alkohole (kao što je linalol) i aldehide (kao što je cinamaldehid). Na antibakterijsko djelovanje utječu različiti faktori kao što su hemijski sastav testiranog EO, korištena eksperimentalna metoda i testirani soj bakterija. Njihovo antibakterijsko djelovanjezavisi od koncentracije glavnih jedinjenja, sinergijskih efekata i/ili prisutnih aditiva i manjih jedinjenja [218,219]. Bioaktivne komponente EO imaju specifična antibakterijska dejstva; na primjer, ćelijsko uništavanje patogena je rezultat sposobnosti ovih spojeva da poremete ćelijsku membranu mikroorganizma, što rezultira promjenama u ćelijskoj morfologiji, promjenama u propusnosti membrane i curenju elektrolita. Na primjer, timol, karvakrol i eugenol (glavna fenolna jedinjenja nekoliko EO) ​​mogu povećati količinu C16 i C18 zasićenih masnih kiselina i smanjiti količinu C18 nezasićenih masnih kiselina. Djelovanje EO nije ograničeno na same masne kiseline, već može utjecati i na enzime odgovorne za njihovu biosintezu. Na primjer, neke studije su pokazale da neki EO inhibiraju različitim mehanizmima (kompetitivnim, nekonkurentnim i nekonkurentnim) [213,220]. Različite komponente EO mogu djelovati na proteine ​​prisutne u bakterijama i utjecati na diobu stanica. Nadalje, mogu smanjiti stopu proizvodnje ATP-a i uzrokovati poremećaje u membranskom respiratornom lancu. Neki EO-i djeluju na otkrivanje kvoruma, koje koriste bakterije za koordinaciju i osiguranje komunikacije između njih [221,222]. Nekoliko studija je istraživalo sinergiju između komponenti EO [223,224]. Uočena je varijacija između različitih ishoda prema testiranom organizmu, antibiotiku i eteričnom ulju [225]. Kombinacija dva antimikrobna agensa rezultira antagonističkim, indiferentnim ili sinergističkim učinkom, ovisno o mehanizmima koje svaki agens vrši protiv testnog organizma, karakteristikama testnog organizma i bilo kojoj kemijskoj interakciji između dva antimikrobna agensa [226]. 

6.3. Ograničenja

Uprkos tome što su prirodni spojevi i njihova terapijska primjena, izvješćeno je da neki EO izazivaju nuspojave kao što su trovanje, astma, kontaktni dermatitis, glavobolja, pojačano krvarenje, iritacija oka, neurotoksičnost, genotoksičnost i imunotoksičnost. Većina EO, u dovoljno visokim dozama, će izazvati toksične efekte. Nadalje, toksični efekti se mogu javiti nakon gutanja ili dermalnog izlaganja. Mnogi EO, uključujući lavandu,Nepeta cataria(mačja trapa), iMelissa Officinalis(matičnjak), ispitani su testovima koji pokazuju da EO pokazuju toksičnost pri vrlo niskim koncentracijama. Pretpostavlja se da je jedan od primarnih mehanizama citotoksičnosti oštećenje membrane, slično kao kod bakterija i kvasaca.226–228]. EO takođe sadrže kompleksna jedinjenja koja su veoma fotosenzitivna i podložna degradaciji. Ovo zahtijeva bolje uslove skladištenja kako bi se spriječilo smanjenje koncentracije ulja komponenti i pomaže u održavanju osnovnog esencijalnog ulja s najmanjom količinom kvarenja. Još jedan izazov za racionalnu eksploataciju EO od strane relevantnih industrija je njihova kontrola kvaliteta, kao i zakonski tekstovi koji se odnose na njihovu primjenu [228]. 

7. Antisense antimikrobna terapija

Antisense terapeutici su oblik antibiotske terapije zasnovan na biotehnologiji koristeći hemijske analoge kratkih, jednolančanih oligomera koji oponašaju strukturu RNK ili DNK i vezuju se za specifičnu, komplementarnu RNK u ciljnom organizmu. Antisense antimikrobni terapeutici stoga djeluju tako da utišaju ekspresiju specifičnih gena [229]. Antisense tehnologija se razvija dugi niz godina za borbu protiv virusnih, parazitskih i bakterijskih infekcija. Antisense tehnologija je korištena kao antibakterijska sredstva i testirana je protiv većine kliničkih izolata MDR-a, uključujući rezistentne na karbapenemEscherichia coli, beta-laktamaza proširenog spektraKlebsiella pneumoniae, Nju Delhi nosi metalo-beta laktamazu-1Klebsiella pneumoniaei MDRSalmonella enterica. U ovom pregledu fokusirat ćemo se na oligonukleotidnu terapiju kao efikasan pristup smanjenju otpornosti bakterija na liječenje antibioticima [230].

7.1. Mehanizam djelovanja

U osnovi, glavna funkcija antibiotika je da direktno inhibira rast i/iliodrživost bakterija ciljanjem na očuvane puteve kao što su replikacija DNK, ćelijski zidsinteza, sinteza proteina i metabolizam. Suprotno tome, korištenjem antisens tehnologije kao terapeutskih agenasa u mikroorganizmima, antisens agensi se vezuju za komplementarnu ciljnu mRNA i potiskuju translaciju ili pospješuju degradaciju ciljane mRNA. Razvijeno je nekoliko platformi zasnovanih na oligonukleotidima, dva primarna pristupa za utišavanje ekspresije gena uključuju antisens oligonukleotide i kratko interferirajuće RNK. Oba posjeduju komplementarne sekvence za svoju ciljnu mRNA. Hibridizacija oligonukleotida inhibira translaciju odgovarajućeg gena putem degradacije ciljne mRNA ili opstrukcije ribosomskog vezivanja [229,231–233]. Trenutno, glavne hemijske strukture koje su dizajnirane za antisens biotehnologiju uključuju fosforotioate, zaključane nukleinske kiseline, peptidne nukleinske kiseline i fosforodiamidatne morfolino oligomere [229,233]. Najvažnija briga za antisens terapiju bila je isporuka sintetičkih antisens oligomera u bakterijsku citoplazmu što zahtijeva vezivanje drugog spoja koji može prodrijeti u zid bakterije. Nedavne studije su koristile antisens oligomere spojene peptidima koji prodiru u ćeliju ili nizom naizmjeničnih kationskih i nepolarnih aminokiselina jer su ćelijski zidovi bakterija gotovo neprobojni za oligomere visoke molekularne težine [229,234,235].

7.2. Efikasnost

U februaru 2017., SZO je objavila svoju prvu ikad listu "prioritetnih patogena" otpornih na antibiotike—katalog od 12 porodica bakterija koje predstavljaju najveću prijetnju ljudskom zdravlju [236]. Ove bakterije su postale otporne na veliki broj antibiotika, uključujući karbapeneme i cefalosporine treće generacije [5]. Kao rješenje problema, antisens terapije nude potencijal za terapije specifične za genske sekvence koje mogu ciljati na veliki raspon puteva u bakterijama, brzo se dizajniraju i prilagodljivije su otpornosti od konvencionalnih molekularnih antibiotika [237]. Antisens oligonukleotidi i kratke interferirajuće RNK su alternativna strategija za dizajniranje gen-specifičnih oligomera koji mogu specifično ciljati bilo koji pojedinačni patogen. Ovaj novi pristup gotovo eliminira ili značajno smanjuje vrijeme potrebno za otkrivanje novih antibakterijskih sredstava i proširuje raspon potencijalno dostupnih meta na bilo koji gen s poznatom baznom sekvencom u bilo kojoj bakteriji [229].

7.3. Primjena u medicini

Prošireni spektar Proizvodnja laktamaze je jedan od glavnih mehanizama rezistencijeEnterobacteriaceae. Nedavne studije su pokazale da je oligonukleotidna terapija efikasan pristup smanjenju otpornosti bakterija na antibiotske tretmane [238,239]. Lipidni oligonukleotidi su se dokazali kao efikasna strategija i za isporuku oligonukleotidnih sekvenci u prokariotske ćelije i za smanjenje minimalne inhibitorne koncentracije rezistentnih bakterija na cefalosporin treće generacije, ceftriakson [5]. Strategija ciljanja gena otpornosti na antibiotike ima za cilj da sruši ekspresiju rezistencije na antibiotike, što bi vratilo osjetljivost na odobreni antibiotik koji bi se davao zajedno s oligomerima. Nekoliko studija je otkrilo prednosti antisense antimikrobnih sredstava na MDR bakterije [230,240,241]. Antisens terapeutici koji ciljaju gen NDM-1 obnovili su osjetljivost na karbapeneme kod vrsta gram-negativnih patogena, uključujućiEscherichia coli, Acinetobacter baumannii, iPseudomonas aeruginosa[230]. Isto je uočeno kada se cilja aac (60 )-Ib gen, koji daje otpornost na aminoglikozide u mnogim gram-negativnim kliničkim izolatima [229,237,242,243]. Trenutno na tržištu ne postoje odobreni oligonukleotidni lijekovi za liječenje bakterijskih infekcija; međutim, postoje neke od antisens terapija u kliničkim ispitivanjima za liječenje virusnih infekcija. Fomivirsen, fosforotioatni oligodeoksinukleotid, jedini je odobreni antisens terapeutik koji cilja na virusnu infekciju [229,231,237,244]. Kako bi se odgovorilo na hitnu potrebu za razvojem novih strategija za otkrivanje novih antimikrobnih sredstava, još uvijek postoji potreba za više eksperimentalnih studija sa stvarnim kliničkim ispitivanjima kako bi se oni uspješno koristili u liječenju zaraznih bolesti kod ljudi.

8. Transplantacija fekalne mikrobiote

Mikrobiota ili "mikrobna flora" je grupa mikroorganizama (bakterije, virusi, gljivice ili kvasci) koji žive u specifičnom okruženju. Ljudsko tijelo je dom različite mikrobiote smještene na koži, usnoj šupljini, respiratornom traktu, genitalnom traktu ili crijevima. Ljudsko biće sadrži više bakterija nego ljudskih ćelija [245]. Crijevna mikrobiota se definira kao najzastupljenija mikrobiota u ljudskom tijelu sa više od 100,000 milijardi bakterija (1 do 2 kg bakterija). Sada se smatra organom za sebe, koji pruža različite fiziološke funkcije neophodne za čovjeka. Pod utjecajem nekoliko fenomena, ravnoteža između "dobrih" i "loših" bakterija mikrobiote može se pokvariti; ova neravnoteža, poznata kao disbioza, uzrok je raznih bolesti različite težine. Transplantacija fekalija (koja se naziva i fekalna transplantacija ili fekalna bakterioterapija) je tada moguće terapeutsko rješenje [245]. Antibiotici igraju glavnu ulogu u ovim pojavama mijenjajući raznolikost populacija crijevne mikrobiote (a posebno učinak barijere koji oni ispoljavaju) i povećanjem gustoće crijeva otpornih bakterija. Crijevna mikrobiota je u srcu fenomena rezistencije na antibiotike, budući da je i rezervoar enterobakterije otporne na antibiotike i "kolateralna žrtva" upotrebe antibiotika, koja selektira ove bakterije [245]. Skup gena otpornosti prisutnih u crijevnoj mikrobioti naziva se crijevni rezistom. Uključuje endogeni ili "rezidentni" rezistom sastavljen od bakterija rezidentne mikrobiote domaćina i egzogeni ili varijabilni rezistom, sastavljen od gena otpornosti koje doprinose bakterije u tranzitu kroz mikrobiotu [246]. Klasično, rezidentni rezistom uključuje gene hromozomske otpornosti koji nisu povezani s mobilnim strukturama. Suprotno tome, varijabilni rezistom je često povezan s mobilnim strukturama (kao što su plazmidi ili transpozoni), koje se mogu zamijeniti sa rezidentnim bakterijama domaćina [247]. Na temelju obnove nove crijevne mikrobiote od zdravog donora [248]. Transplantacija fekalne mikrobiote (FMT) koristi se od četvrtog stoljeća u tradicionalnoj kineskoj medicini za liječenje pacijenata koji pate od teške dijareje i za liječenje trovanja hranom. Zaista, ova tehnika je prvi put opisana prije 1700 godina u kineskom medicinskom priručniku "Handy Therapy of Emergencies" od strane kineskog liječnika Ge Hong [249]. Zatim je u 16. veku Li Shizhen opisao nekoliko načina pripreme stolice za pripremu za fekalnu transplantaciju kao što su fermentisani fekalni rastvor, sveže fekalne suspenzije, kao i suvi fekalni preparati suve stolice [249]. Kasnije u 17. stoljeću, FMT se koristio pod nazivom "transformacija" u veterinarskoj medicini oralno ili rektalno za liječenje dijareje, liječenje acidoze buraga i liječenje bacilarne dizenterije ili šigeloze kod domaćih životinja, stoke [250]. Godine 1958. američki kirurg Ben Eiseman prepoznao je efikasnost tehnike FMT vaginalnim putem za liječenje pseudomembranoznog kolitisa nakon uspješne studije na četiri pacijenta liječenih stolicom debelog crijeva (klistir) od zdravog donora [250]. Godine 1983. djelotvornost liječenja rekurentnihClostridium diificileo infekcijama FMT-om izvijestila je dr. Anna Schwan u časopisu "Lancet" [251].

8.1. Primjena u medicini

Digestivna dekontaminacija se sastoji od oralne i/ili parenteralne primjene antibiotika kako bi se iskorijenile patogene i/ili multirezistentne bakterije, a istovremeno se poštedele komenzalne bakterije (posebno anaerobne bakterije) što je više moguće [252]. Digestivna dekontaminacija se do sada najčešće koristila za eliminaciju enterobakterija (rezistentnih ili ne) kod neutropeničnih subjekata ili multirezistentnih bakterija odgovornih za epidemije u jedinicama intenzivne njege [247]. Pojavljujuće visoko rezistentne bakterijske infekcije, a posebno one koje proizvode karbapenemazuEnterobacteriaceae, rastući javnozdravstveni problem. Njihovo upravljanje u bolnicama, regulisano izvještajem Francuskog Visokog vijeća za javno zdravlje, uključuje mjere pojačane izolacije, kohorte i skrining kontakata, koje su pretjerano glomazne, skupe i teško primjenjive [247]. Antibiotska terapija ovih kolonizacija nije samo štetna već i potpuno nepotrebna. Dva klinička slučaja, jedan u Holandiji, drugi u Francuskoj, su, s druge strane, pokazala efikasnostFMT u slučajevima kolonizacije od straneEscherichia colii koji proizvode karbapenemazuKlebsiella pneumoniae[253]. Mnoga istraživanja su u toku kako bi se istražila ova opcija liječenja [247,254]. Stripling et al. izvijestio je, u izvještaju o slučaju, primjenu FMT-a na pacijentu s transplantiranim srcem i bubregom koji pati od enterokokne kolonizacije rezistentne na vankomicin, praćenu ponavljajućimClostridium dificilekolitis [255]. Transplantacija je rezultirala kliničkim izlječenjemClostridium difficileinfekcija i smanjenje udjela izolata enterokoka otpornih na vankomicin [256]. Infuzija fekalnog preparata od zdravog donora u gastrointestinalni trakt pacijenta predložena je kao novi terapijski pristup za modulaciju bolesti povezanih s patološkim neravnotežama unutar rezidentne mikrobiote, nazvane disbioza [257]. Koristi se za liječenje crijevnih bolesti kao što su IBD iClostridium diificileinfekcije, ali još uvijek nema izvještaja o njegovoj ulozi u liječenju MRSA enteritisa. Ovdje smo prijavili pet slučajeva MSRA enterokolitisa izliječenog FMT u kombinaciji s vankomicinom [258]. Po prvi put izvještavamo o promjenama u mikrobioti stolice tokom terapijskog procesa [257]. 

8.2. Ograničenja

Nuspojave povezane s fekalnom transplantacijom: rezultati FMT meta-analize u vezi sa infuzijom fecesa od zdravog donora u crijeva bolesne osobe kako bi se uspostavila ravnoteža njihove crijevne flore [259]. Ova procedura je procijenjena uglavnom za liječenje rekurentnihClostridium difficileinfekcije. U naučnoj literaturi dominiraju male studije slučaja sa nedovoljnom standardizacijom kriterijuma evaluacije. Pregledom literature obuhvaćeno je 109 publikacija koje opisuju ovu proceduru urađenu kod 1555 pacijenata. Za njih 1190 indikacija je bila ponavljanjeClostridium teškoinfekcija [257]. Za ostale, transplantacija fekalija je urađena uglavnom za liječenje kronične upalne bolesti crijeva (IBD). Tehnika je također istražena kod sindroma iritabilnog crijeva, metaboličkog sindroma i zatvora. Od oktobra 2014. mogla su se izbrojati tri randomizirana kontrolirana ispitivanja: jedno za metabolički sindrom, jedno za ulcerozni kolitis i jedno zaClostridium teškoinfekcija. Navedeni su načini primjene za 946 pacijenata. Većina (više od 500) transplantirana je kolonoskopijom. Urađena je klistirom za više od 156 pacijenata i nazogastričnom sondom za 133. Ova podanaliza se fokusira na 1190 pacijenata koji su primili fekalnu transplantaciju zbog rekurentneInfekcija Clostridium diificile. Jedan slučaj fekalne perforacije dogodio se tokom fekalne transplantacije, što je zahtijevalo kolektomiju [257,260]. Prijavljena su dva slučaja kontaminacije norovirusom, kao i četiri slučaja gram-negativne bakteremije, od kojih su dva dovela do smrti. Među pacijentima koji takođe boluju od IMiC-a, u šest slučajeva izvršena je fekalna transplantacija za liječenjeClostridium difficileinfekcija je praćena pogoršanjem upalne bolesti. Kod ove indikacije prijavljeno je oko deset febrilnih epizoda i oko stotinu blagih gastrointestinalnih nuspojava (mučnina, bol u trbuhu, zatvor, itd.). Osim smrtnih slučajeva koji su se dogodili nakon bakterijemije, zabilježena su još tri. Za jednog od pacijenata, istraživači su smatrali da veza između septičkog šoka koji je doveo do smrti i fekalne transplantacije "nije jasna". Za drugog pacijenta, greška je bila sedacija koja je dostavljena za izvođenje kolonoskopije. Treći pacijent je preminuo od septičkog šoka. Pod općom anestezijom, povratio je fekalnu materiju uvedenu endoskopijom, a zatim je postao žrtva inhalacijske upale pluća. Ostali smrtni slučajevi koji su se dogodili na duži rok prijavljeni su bez utvrđivanja veze sa transplantacijom. Za 226 pacijenata liječenih od IMiC, najčešća nuspojava je bila febrilna epizoda (14 slučajeva). Dva autora su zabilježila šest pogoršanja upalne bolesti i 28 gastrointestinalnih nuspojava: nadimanje, povraćanje i bol u trbuhu [257]. Sve u svemu, autori smatraju literaturu o fekalnoj transplantaciji "lošeg kvaliteta", a trenutne preporuke "nedovoljnim" da bi omogućili praktičarima da budu pravilno informisani. Na osnovu analize literature, proceduru smatraju „generalno bezbednom“, a ističu i prijavljivanje nekoliko slučajeva ozbiljnih štetnih događaja. Ipak, bez komparatora nije moguće utvrditi koliko je ovih nuspojava povezano s početnim zdravstvenim stanjem [257].

9. Inhibitori sensinga kvoruma

Quorum sensing (QS) je ćelijski komunikacijski sistem koji kontrolira ekspresiju gena pod kontrolom gustine stanične populacije [261]. On kontrolira ekspresiju različitih proteina na određenim gustoćama stanica. Bakterijske ćelije proizvode male molekule slične hormonima poznate kao molekule acil-homoserin laktona (AHL) i igraju ulogu u signalnom sistemu, pa su stoga poznate kao signalne molekule [262]. Ove molekule primaju druge bakterije kao dio njihovog signalnog sistema, poznatog kao QS. Bakterijske ćelije sadrže mnogo različitih proteina, od kojih je jedan AHL sintaza, koja proizvodi AHL molekule koji se izlučuju izvan ćelije u određenim koncentracijama i vezuju se za QS receptore [262]. Ovi receptori iniciraju transkripciju različitih gena. QS kontrolira različite važne karakteristike bakterija: virulenciju, pokretljivost, rast, biofilm, proteaze i elastazu, među ostalim što ga čini stubom većine bakterijskih karakteristika [263]. Ovaj signalni molekul se sastoji od dvije glavne komponente: jednog homoserinskog laktonskog prstena i bočnog lanca masne kiseline, također poznatog kao acilni lanac [264]. Antivirusni lijekovi se mogu koristiti sami ili u kombinaciji s antibioticima i njihov cilj, za razliku od antibiotika, nije ubiti bakteriju, već spriječiti ili inhibirati njenu sposobnost da izazove infekciju [265]. Njihova visoka specifičnost prema patogenu objašnjava manje štetnih reakcija na mikrobiotu domaćina i slabiji selektivni pritisak za otpornost na lijekove [266]. 

9.2. Ograničenja

Dokazano je da otpor prema QS terapijama može nastati zbog mutacije gena koji kodiraju efluks pumpe. In siliko modeli bi mogli biti potencijalno rješenje za ovaj razvoj otpornosti [271]. Pokazalo se da QS terapija utječe na ljudsko zdravlje, nuspojave uključuju modulaciju metaboličke aktivnosti mikrobiote [272], ali djeluje i kao hemoatraktant za neutrofile. Štaviše, dokazano je da izaziva proupalne i pro-apoptotske odgovore u eukariotskim stanicama [273]. Ovo može dovesti do pogoršanja proupalnih reakcija nakon upotrebe QS inhibitora. Štaviše, čini se da konačni rezultati QS terapije zavise od brojnih uzroka uključujući imuni status zaraženog pacijenta, patogeni potencijal soja bakterije i okolišstanja koja preovladavaju tokom infekcije [274]. Cilj antivirusnih terapija je već poznat i okarakterisan. Skrining komercijalnih biblioteka lijekova omogućava ubrzanje pronalaženja molekula s dobrim farmakološkim svojstvima koji će pomoći u rješavanju rastućeg problema bakterija rezistentnih na više lijekova.

Danas počinje nova era sa dugo očekivanim rastućim istraživanjimaroman protivinfektivni pristupiprotiv MDR bakterija. Ovi terapijski pristupi su definitivno amoćna neantibiotska opcija za smanjenje ogromnog povećanjabakterije otporne na antibiotiketosa kojima se danas suočavamo. Ne može se poreći da su mehanizmi djelovanja ovih terapijasu komplikovani za razradu i tokliničkim ispitivanjimanisu dovoljno potpuni da obezbedevalidne i koncizne informacije. Međutim, svi napori uloženi da ovi tretmani budu kao aklinička rutina se mora obavljati s oprezom pri uzimanjuuzimajući u obzir efikasnosti sigurnostsvaku terapiju. Na kraju smo uvjereni da je znanje i savladavanje otporaobrasci i mehanizmi djelovanja omogućit će kliničarima dasve više potiču antimikrobnetretmanprema individualiziranom iprecizan medicinski pristup. 

Doprinosi autora:Konceptualizacija, MK-H.; svi autori su učestvovali u pisanju – originalupriprema nacrta; pisanje—pregled i uređivanje, HAM, RB (Rachid Benmessaoud), HY, LS, HGA, MH, RB (Rihabe Boussettine), NF-A., FAL, ID, MME i MK-H.; nadzor,MK-H. i MME Svi autori su pročitali i pristali na objavljenu verziju rukopisa.

finansiranje:Ovo istraživanje nije dobilo vanjsko finansiranje. Članak Naknada obrade (APC) plaćaMohammed VI Univerzitet zdravstvenih nauka (UM6SS).

Sukobi interesa:Autori izjavljuju da nema sukoba interesa. Finanseri nisu imali nikakvu ulogu u dizajnustudija; u prikupljanju, analizi ili interpretaciji podataka; u pisanju rukopisa, iliu odluci o objavljivanju rezultata.

Reference

1. Chawla, M.; Verma, J.; Gupta, R.; Das, B. Antibiotski potenciatori protiv bakterija otpornih na više lijekova: otkriće, razvoj i klinička relevantnost.Front. Microbiol.2022, 13, 887251. [CrossRef] [PubMed] 

2. Li, X.; On, Y.; Wang, Z.; Wei, J.; Hu, T.; Si, J.; Tao, G.; Zhang, L.; Xie, L.; Abdalla, AE; et al. Kombinirana terapija faga i antibiotika: bolje je dvoje od jednog.Int. J. Biol. Sci.2021, 17, 3573–3582. [CrossRef] [PubMed] 

3. Lin, J.; Du, F.; Long, M.; Li, P. Limitations of Phage Therapy and Comresponding Optimization Strategies: A Review.Molekule2022, 27, 1857. [CrossRef] [PubMed] 

4. Coates, A.; Hu, Y.; Holt, J.; Yeh, P. Kombinirana antibiotska terapija protiv rezistentnih bakterijskih infekcija: sinergija, podmlađivanje i smanjenje otpornosti.Expert Rev. Anti-infective Ther.2020, 18, 5–15. [CrossRef] [PubMed] 

5. O'Neill, J.Borba protiv infekcija otpornih na lekove na globalnom nivou: završni izveštaj i preporuke; Vlada Ujedinjenog Kraljevstva: London, UK, 2016.

6. Zyman, A.; Górski, A.; Mi ˛edzybrodzki, R. Fagoterapija infekcija povezanih s ranama.Folia Microbiol.2022, 67, 193–201. [CrossRef]

7. Jernigan, JA; Hatfifield, KM; Wolford, H.; Nelson, RE; Olubajo, B.; Reddy, SC; McCarthy, N.; Paul, P.; McDonald, LC; Kallen, A.; et al. Bakterijske infekcije otporne na više lijekova kod hospitaliziranih pacijenata u SAD, 2012–2017.New Engl. J. Med.2020, 382, 1309–1319. [CrossRef] 

8. Adebisi, YA; Alaran, AJ; Okereke, M.; Oke, GI; Amos, OA; Olaoye, OC; Oladunjoye, I.; Olanrewaju, AY; Ukor, NA; Lucero-Prisno, DE COVID-19 i antimikrobna rezistencija: pregled.Zaraziti. Dis. Res. Treat.2021, 14, 11786337211033870. [CrossRef] 

9. Hsu, J. Kako covid-19 ubrzava prijetnju otpornosti na antimikrobne lijekove.BMJ2020, 369, m1983. [CrossRef]