Povoljan/nepovoljan efekat kvercetina na membrane SK-N-SH ćelija neuroblastoma, 2. deo

Molimo klikniteoscar.xiao@wecistanche.comza više informacija

2.2.2. Antioksidativna aktivnost kvercetina

Da bi se testirala efikasnost kvercetina u zaštiti membrana od oksidativnog stresa, izvedeni su eksperimenti u kojima su lipidni modeli membrane bili izloženi ozonu u odsustvu (slika 4a) i prisutnosti kvercetina u koncentraciji od 6,25 μM (slika 4b).

Pod uticajem ozona, tok obe zavisnosti, tj. π{{0}}f(A) i Cs-1=f(rn) se menja. Dobijene izoterme za jednoslojno širenje na podfazi koja sadrži ozon karakterizira manji nagib i pomak prema nižim A vrijednostima. Štaviše, vrijednosti Cs-1 su se smanjile pod uticajem ozona. Ove promjene su bile najveće pri koncentraciji ozona od oko 0,4 ppm.cintancheDaljnji porast koncentracije ozona nije povećao promjene u karakteristikama monosloja (slika 4a umetak).

Slika 4. Izoterme površinskog pritiska i odgovarajući modul kompresibilnosti (inset) lipidnog modela slojeva neuroblastoma raširenih na podfazi sadržavali su naznačene koncentracije ozona otopljenog u puferu. Izoterme: (a) u odsustvu antioksidansa; (b) u prisustvu kvercetina (6,25 μM) dodanog puferu koji sadrži ozon.

Kada je kvercetin u koncentraciji od 6,25 μM uveden u podfazu, ozon nije značajno uticao na tok r(A) izoterme; međutim, vrijednosti kompresijskog modula su se mijenjale u prisutnosti ozona slično kao u slučaju odsustva kvercetina (slika 4b umetnuti).

Molimo kliknite ovdje da saznate više

Numeričke vrijednosti parametara koji karakteriziraju monoslojeve određene na osnovu dobivenih izotermi prikazane su u tabeli 3.

Tabela 3. Površinski parametri monoslojeva Alim i Cs-I izračunati za monoslojeve modela raširenosti membrane neuroblastoma na podfazi sadržavali su naznačene koncentracije ozona otopljenog u puferu u odsustvu i u prisustvu kvercetina (6,25 uM). Podaci predstavljaju srednju vrijednost iz tri eksperimenta ± SD. Različita slova označavaju značajne razlike (p manje od ili jednako 0.05).

U prisustvu ozona, uočeno je blago smanjenje površine po molekulu (Alim) u gusto zbijenom monosloju. Maksimalno smanjenje ovog parametra je 3,2 posto u odnosu na kontrolu (jednosloj na čistom puferu). Cs-I parametar je također smanjen, dostižući plato vrijednosti pri koncentracijama ozona iznad 0.6 ppm O. Maksimalno smanjenje ovog parametra dostiže 24 posto u odnosu na kontrolu.

Kada je kvercetin u koncentraciji od 6,25 uM prisutan u podfazi, Alim vrijednosti (1-2 posto) blago se smanjuju, dok je smanjenje vrijednosti Cs-1 oko 27 posto.

Promjene prirode Alima u prisustvu ozona i ozona u kombinaciji s kvercetinom imaju različite tokove. Pri koncentraciji ozona od oko 0.3 ppm, u odsustvu kvercetina, Aim se naglo smanjuje na oko 88,3 A2. Tada dostiže minimalnu vrijednost platoa dajući karakterističnu ovisnost u obliku slova S (Slika 5a, crvene tačke). U prisustvu kvercetina, dolazi do blagog glatkog monotonog smanjenja Alima, dostižući višu koncentraciju ozona na platou od oko 93,5 A2 (Slika 5a, zelene tačke).

Slika 5. Zavisnost površine po molekulu od koncentracije ozona (a) i zavisnost modula kompresije od koncentracije ozona (b) za membranu neuroblastoma o podfazi: Bez kvercetinsko-crvenih tačaka; sa kvercetinsko-zelenim tačkama. Linije ne predstavljaju nikakav fizički model, matematički su prilagođene i nacrtane radi lakšeg praćenja promjena parametara. Vrijednosti maksimalnog modula kompresije sloja mijenjaju se slično sa koncentracijom ozona za oba: U odsustvu i u prisustvu kvercetina (Slika 5b).

3. Diskusija

Mehanizam djelovanja kvercetina se intenzivno proučava dugi niz godina, ali su rezultati eksperimenata često kontradiktorni i ukazuju da je u nekim okolnostima ovaj spoj koristan, au drugim nepovoljan za stanice. Analiza dostupnih studija pokazuje da je efekat ovog jedinjenja na ćelije povezan sa dva aspekta, odnosno interakcijom sa membranama i antioksidativnom aktivnošću. Međutim, u ćelijama nije moguće razlikovati ova dva načina delovanja kvercetina i procenu podobnosti ovog jedinjenja kao potencijalne supstance, npr. antitumorske aktivnosti. Zbog toga su eksperimenti planirani tako da se kvalitativno i kvantitativno procijeni uticaj ovog jedinjenja na mehanička svojstva membrana, kao i njegova antioksidativna aktivnost u modelnom sistemu, čime se eliminišu efekti aktivnost drugih metaboličkih puteva.

Na osnovu sprovedenih eksperimenata, potvrđeno je da i pri najnižim koncentracijama (6,25 uM), kvercetin modifikuje (na šta ukazuje povećanje Alimvalue) modelne monoslojeve, oponašajući lipidni deo membrane ćelija neuroblastoma. To ukazuje na mogućnost interakcije kvercetina sa membranama ovih ćelija kada dođe do mozga, čak i u malim koncentracijama. Ovo je od posebnog značaja za nervne ćelije čije membrane sadrže relativno velike količine lipida.

Cistanche može poboljšati imunitet

Približan odnos lipida i proteina za nervne ćelije je 80:20 procenata, a na primer, za membranu eritrocita taj odnos je 50:50 procenata [29]. Takav nivo lipida u membrani nervnih ćelija povezan je sa ulogom ovih ćelija u prenošenju električnih signala. Istovremeno, čak i suptilne promjene u fizičko-hemijskim svojstvima, kao što su fleksibilnost i krutost ćelijske membrane, mogu značajno poremetiti ovu funkciju.

Akcioni potencijal se prenosi duž membrane nervne ćelije zahvaljujući radu jonskih kanala, a zatim se, zahvaljujući delovanju jonskih pumpi, obnavlja potencijal mirovanja. Pravilno funkcioniranje ovih proteina (posebno određeno njihovim oblikom) usko ovisi o lipidnom okruženju. Štoviše, promjene u mehaničkim svojstvima membrane mogu poremetiti rad kanala čiji mehanizam zatvaranja ovisi upravo o mehaničkim svojstvima membrane.

Ove teze potvrđuju studije koje su pokazale da je efekat kvercetina na ćelijsku membranu povezan, između ostalog, sa transportom Ca2 plus jona i/ili metabolizmom Ca2 plus [30,31]. Dakle, uvođenje molekula kvercetina u okolinu membrane (posebno nervnih ćelija) može imati značajne posledice na njihovo funkcionisanje.

Kako bi se provjerilo da li djelovanje kvercetina određeno u modelnim sistemima ima korisnu ili nepovoljnu ulogu u stanicama, rezultati dobiveni za modelne membrane upoređeni su sa djelovanjem ovog spoja na cijele ćelije neuroblastoma. Za SK-N-SH ćelije urađen je MTT test,Ekstrakt Cistanche protiv Alchajmerove bolestidajući informaciju o vitalnosti stanica koja je zauzvrat direktno proporcionalna enzimima mitohondrijalne dehidrogenaze.

Dobijeni rezultati su pokazali da prisustvo kvercetina u koncentracijama od 100 i 200uM povećava broj živih ćelija. Slične rezultate dobili su Bao et al. [32], istražujući efekat kvercetina na PC-12 ćelije. Propuštanje LDH u ekstracelularno okruženje, koje daje informaciju o narušavanju ćelijske membrane, takođe je ispitano na istim nivoima kvercetina. Dobijeni rezultati su pokazali da membrane ispitivanih ćelija nisu oštećene u takvim uslovima. Boots et al. [2], proučavajući efekte kvercetina na epitelne ćelije pluća, uočili su slične rezultate. Stoga se može zaključiti da pri ovim koncentracijama kvercetin ima pozitivan učinak na stanice, povećavajući njihovu vitalnost.

Drugi važan aspekt mehanizma djelovanja kvercetina je vezan za njegova antioksidativna svojstva. Da bi se procijenio povezani učinak proučavanog polifenola, provedeni su eksperimenti u kojima je provjereno da li kvercetin ima zaštitnu ulogu u stanicama izloženim oksidativnom stresu. Oksidativni stres je nastao uvođenjem H, O2 u ćelijsku sredinu.Cistanche za poboljšanje pamćenjaKao što je pokazano u ovoj studiji, vodikov peroksid uzrokuje značajan mortalitet ćelija, izražen kao oštećenje mitohondrija.

Kada su SK-N-SH ćelije kultivisane 3 h u medijumu koji sadrži 3 i 5 mM H2O2, vitalnost ćelija se smanjila na približno 44 procenta u odnosu na netretirane ćelije (MTT test). Istraživanja su pokazala da 24 h predtretman ćelija kvercetinom izaziva povećanje broja živih ćelija u odnosu na ćelije tretirane H2O2. Suematsu et al. [13] prijavili su slične efekte.

Izmjerili smo i nivo MDA, koji je biomarker oksidativnog stresa kao krajnjeg produkta lipidne peroksidacije[33]. Prethodno tretiranje ćelija visokim koncentracijama kvercetina, praćeno dodatkom vodikovog peroksida, rezultiralo je blagim povećanjem sadržaja MDA u poređenju sa ćelijama izloženim samo HO. To može biti zato što kvercetin (u višim koncentracijama) također može biti podvrgnut oksid-reduktivnoj aktivaciji i biti predmet redoks ciklusa, stvarajući unutarćelijske reaktivne vrste kisika [34].

Nije bilo značajnih promjena u destrukciji membrane (na što ukazuje nepromijenjen nivo LDH) ćelija tretiranih kvercetinom i H2O2 u poređenju sa slučajem kada su ćelije bile izložene samo oksidativnom stresu. Stoga se može zaključiti da uprkos povećanju peroksidacije lipida (pri visokim koncentracijama kvercetina), to nije bilo dovoljno značajno da uništi membrane i naruši njihov kontinuitet.

Zapažanja dobijena za nativni sistem suprotstavljena su onima dobijenim za modelni sistem u kojem je moguće tačno kontrolisati i koncentraciju kvercetina i nivo stresa. Provjereno je koliko je lipidni dio membrane neuroblastoma otporan na oksidativni stres. Uslovi stresa su stvoreni uvođenjem ozona u pufer, pri čemu ozon u vodenoj sredini prolazi kroz reakcije razgradnje formirajući oksidativne radikale, između ostalih hidroksilne radikale i superoksidne anjonske radikale [35]. Dobijena mješavina reaktivnih vrsta kiseonika odgovara onima koje se prirodno javljaju u ćelijama, zbog neravnoteže redoks statusa [36-38].

Pod uticajem naprezanja, oblik izoterme se promenio, što ukazuje na značajno smanjenje površine po jednom molekulu u gusto zbijenom monosloju. Takve promjene su se dogodile zbog oksidacije nezasićenih veza u lancima masnih kiselina. Ovaj efekat se povećavao sa povećanjem koncentracije ozona na oko {{0}}.3 ppm, a zatim je ovaj parametar izoterme ostao na istom nivou uprkos povećanju ROS-a. To znači da su pri koncentraciji ozona od oko 0,3 ppm, sve nezasićene masne kiseline prisutne u monosloju bile oksidirane (u modelu neuroblastoma, ukupna količina nezasićenih masnih kiselina bila je 52 posto)

Oksidirani monoslojevi imaju značajnu krutost,cistanche na kineskomkao što je predstavljeno vrijednošću Cs-1 (što je veća vrijednost ovog parametra, veća je krutost sloja). U prisustvu kvercetina, čak i pri niskoj koncentraciji (6,25 μM), modifikacije membrane izložene ozonu, što se vidi po promjenama Alim vrijednosti, bile su značajno smanjene (slika 5a), što dokazuje antioksidativno djelovanje ovog spoja. . Vrijedi napomenuti, međutim, da iako je kvercetin uklanjao radikale, štiteći nezasićene masne kiseline od oksidacije, nije poništio promjene u krutosti membrane (slika 5b).

Dakle, pokazalo se da kvercetin ispoljava antioksidativno djelovanje, ali samo njegovo prisustvo između lipidnih molekula utječe (određuje) na parametre lavera, odnosno, uprkos zaštiti lanaca masnih kiselina od oksidacije, krutost membrane je značajno smanjena (Cs- Procjenjujem oko 25 posto niže u odnosu na kontrolu).

Ovi rezultati ukazuju da je promjena membrane glavni faktor u ćelijskim efektima koji su rezultat prisustva kvercetina. Međutim, posljedice ove promjene (modifikacija signalizacije, transporta) variraju u zavisnosti od broja molekula polifenola, početnog sastava membrane i funkcije ćelije. Ovo objašnjava zašto, u različitim okolnostima i u različitim studijama, kvercetin pokazuje zaštitni efekat, dok u drugim sasvim suprotno.

U situaciji visokog oksidativnog stresa, antioksidativni učinak pomaže ćeliji tako što štiti njene komponente od oštećenja. Međutim, ako se membrane značajno modificiraju lociranjem ovog spoja u njihovoj okolini, što rezultira distribucijom signalnih ili transportnih puteva promijenjenom krutošću membrane, to može dovesti do nepovoljnih učinaka. Također treba imati na umu da se mnogi procesi u ćeliji odvijaju istovremeno, kako oni koji se odnose na membrane, tako i oni koji stvaraju oksidativni stres. Efekat koji se može posmatrati i meriti određivanjem nivoa specifičnih indikatora je uvek totalan. Dakle, postoje situacije u kojima se djelovanje kvercetina percipira kao povoljno i nepovoljno.

4. Materijali i metode

4.1. Materijali

Sastav modela lipidnog dijela membrane ćelija neuroblastoma utvrđen je na osnovu rada autora [39-41]. Fosfolipidi: 1-oleoil-2-palmitoil-sn-glicerol-3-fosfoholin;1-heksakosanoil-d4-2-hidroksi-sn-glicerol-3-fosfoholin; 1,2-dioleoil-sn-glicerol-3-fosfoholin; L- -fosfatidiletanolamin (mozak); sfingomijelin (mozak) (Avanti Polar Lipids Inc., Alabaster, AL, SAD). Holesterol je kupljen (Sigma-Aldrich, Darmstadt, Njemačka). Odnos fosfolipida i holesterola bio je 79 posto prema 21 posto. Odnos zasićenih i nezasićenih masnih kiselina bio je 48 posto prema 52 posto.

Rastvarači (hloroform, etanol) hemijske čistoće-Poch (Gliwice, Poljska); svježe dejonizirane vode proizvedene od strane HLP 5 Hydrolab (Straszyn, Poljska). Podloga za kulturu, serum i antibiotici su kupljeni od CytoGen GmbH. Hemijski reagensi korišteni u eksperimentima dobiveni su od Sigma Aldrich.

4.2. Ćelijska kultura

Ćelijska linija humanog neuroblastoma SK-N-SH (Evropska kolekcija provjerenih ćelijskih kultura (ECACC) uzgajana je u 10 posto fetalnog goveđeg seruma (FBS) u Dulbeccovom modificiranom mediju orla (DMEM), dopunjenom sa 0,01 posto penicilina -streptomicin na 37 stepeni u vlažnoj atmosferi, koji sadrži 5 posto CO2.

4.3. Mjerenje vitalnosti ćelije (MTT test)

Ćelije su posađene u {{0}} ploču sa gustinom od 1×104 ćelija po jažici u zapremini od 0,1 mL. Ćelije su tretirane 24 h različitim koncentracijama kvercetina (3.75-200 μM）. Nakon ovog vremena dodato je 3 mM i 5 mM vodikov peroksid 3 h. Zbog nedostatka razlika između efekata Koncentracije HO2 at3 i 5 μM, za statističke studije, tretirani su kao isti tretmani i opisani kao 3-5 uM H2O2 tretman.

Nakon toga 50μL MTT (3-【4,5-dimetiltiazol-2-il】-2,5 difenil tetrazolijum bromida) rastvora (sterilni osnovni rastvor od 5 mg/mL) je dodan ćelijama i inkubiran 2 h na 37 stepeni u vlažnoj atmosferi sa 5% CO. Zatim je u svaku jažicu dodano 0,4 mL dimetil sulfoksida (DMSO) i držano 10 minuta. Nakon centrifugiranja, optička gustina supernatanta je izmjerena na 570 nm pomoću čitača mikrolitarskih ploča (BioTek Instruments, VT, SAD).

4.4. Ispitivanje oštećenja membrane (LDH test)

Test laktat dehidrogenaze (LDH) korišten je kao marker cjelokupne ćelijske membrane.

Ćelije u količini od 1× 1{{10}}* ćelije po jažici su zasijane u 96-ploču sa jažicom i inkubirane u prisustvu kvercetina (3.75-200 μM) za 24 h; Zatim su dodani 3 mM i 5 mM H2O 3 h. U epruvete koje sadrže 0.5 mL 0,75 mM natrijum piruvata i 10 uL NADH (140 μM) (zagrijane na 37C tokom 10 min), dodano je 150 μL supernatanta i inkubirano 30 stepeni na 30 minuta. Zatim je uzorku dodato 0,5 mL 2,4-dinitrofenilhidrazina, a nakon 1 h mjerena je apsorpcija na 450 nm.

4.5. Određivanje lipidne peroksidacije (koncentracija MDA)

Membranska lipidna peroksidacija procijenjena je reakcijom tiobarbiturne kiseline (TBA) sa malondialdehidom (MDA). Ćelije su zasijane u {{0}}jažice koje sadrže kvercetin i H, O2 (u koncentracijama i vremenima opisanim gore) u količini od 1×104 ćelije po jažici u zapremini od { {10}}.25 mL. Nakon tretmana, uzorci su sakupljeni i centrifugirani (1000×&,5min). U pelete je dodano 0.5 mL 0,5 posto TCA, vorteksirano 1 min i lizirano ultrazvukom 5 min. Nakon centrifugiranja na 10,000×g tokom 10 minuta, 0,4 mL supernatanta je dodano u 1,25 mL 20% TCA sa 0,5% TBA i zagrevano u suvom termobloku (100 stepeni) tokom 30 minuta. Nakon hlađenja, apsorbancija je izmjerena na 532 nm koristeći koeficijent molarne ekstinkcije MDA jednak 155 M-1 cm-1.

4.6. Model membrane

Buffer ozonation. Fosfatni pufer (0.01 M, pH 7,4) bio je zasićen ozonom koji proizvodi ozonski generator FM 500 (Grekos, Poljska). Koncentracija ozona u puferu određena je prema Baderu i Hoigneu [42].

Izoterme površinskog pritiska.cistanche rast penisaLangmuir korito (KSV, Finska) korišteno je za registraciju izoterme površinskog tlaka pri konstantnoj kompresiji koja odgovara brzini barijere od 5 mm/min. Lipidni monosloj je formiran nanošenjem određene količine rastvora lipidnog hloroforma u koncentraciji od 1 mg/mL na podfazu sastavljenu od vodenog 0.01 M fosfatnog pufera, pH 7,4 sa ili bez kvercetina, sa ili bez ozona. Površinske napetosti su mjerene Pt-Wilhelmy pločom. Eksperimenti su izvedeni na 25 stepeni ±1 stepen.

4.7. Statistička analiza

Urađeno je tri do šest nezavisnih analiza za svaku testiranu varijantu i prosječno (±SD). Značajne razlike u odnosu na kontrole procijenjene su korištenjem SAS ANOVA procedure. Statistička analiza je izvršena Duncan-ovim testom višestrukog opsega, uzimajući str<0.05. statistical="" tests="" were="" carried="" out="" using="" statistica="" 13.3(cracow,="">

Doprinosi autora: Konceptualizacija, BK, BD i ER-S.metodologija, BKBD; softver, BK, BDvalidacija, BK, BD, ER-S., ABwriting—priprema originalnog nacrta BK, BD, ER-S., pisanje—pregled i uređivanje, BK, BD, ER-S., ABvisualization, BK, BDsupervision, BK, BD, ER-S., ABA Svi autori su pročitali i pristali na objavljenu verziju rukopisa.

finansiranje:Ovo istraživanje nije dobilo vanjsko finansiranje.

Izjava institucionalnog odbora za reviziju: Nije primjenjivo.

Izjava o informiranoj saglasnosti: Nije primjenjivo.

Izjava o dostupnosti podataka: Podaci su sadržani u članku. Sukob interesa: Autori izjavljuju da nema sukoba interesa.

Ovaj članak je preuzet iz Molecules 2021, 26, 4945. https://doi.org/10.3390/molecules26164945 https://www.mdpi.com/journal/molecules