Napredak u molekularnoj identifikaciji Cistanchea

sažetak:CistanchesHerba, rijedak i vrijedan ljekoviti materijal u Kini, ima visoku medicinsku i ekološku vrijednost. Usred napretka tehnika molekularne biologije, različite tehnike molekularne identifikacije zasnovane na DNK postepeno su unapređivane i veliki napredak je napravljen u istraživanjuCistanchesHerba. Ovaj rad daje pregled tehnikama molekularne identifikacije zasnovane na DNKCistanchei raspravlja o ograničenjima i izgledima za primjenu, za koje se očekuje da će poslužiti kao referenca za tačnu identifikaciju i procjenu kvaliteta Cistanches Herba, zaštitu i racionalno korištenje resursa i raznolikost uzgoja.

Ključne riječi:Cistanche; molekularna identifikacija; tehnika molekularnog markera; identifikacija i kvalitet; očuvanje resursa

Kliknite ovdje da saznate više detalja o komponentama Cistanchea

Cistanche je suha mesnata stabljika Cistanche deserticola YC Ma iCistanche tubulosa(Schenk) Wight, biljka iz rodaCistancheu porodici Cistanche. Jiangyun, Cunyun, Cistanche i Chagangaoya (mongolski jezik) su poznati kao "pustinjski ginseng" [2]. Posljednjih godina, kako su resursi divljeg cistanchea na rubu iscrpljivanja, a domaća potražnja raste iz dana u dan, veliki broj krivotvorenih proizvoda Cistanchea se slio na tržište kineskih biljnih lijekova, što je izazvalo velike oscilacije u tržišnim cijenama. , a kvalitet medicinskih materijala se ne može garantovati, što ozbiljno ugrožava sigurnost kliničkih lijekova. seks [3]. Stoga su očuvanje, istraživanje i racionalni razvoj i korištenje resursa germplazme biljke Cistanche neizbježni, a precizna identifikacija resursa germplazme biljke Cistanche je posebno važna.

kao važno. U izdanju "Farmakopeje Narodne Republike Kine" iz 2020. (u daljnjem tekstu "Kineska farmakopeja") bilježi se samo da se osušene ljuskave mesnate stabljike Cistanche deserticola koriste kao pravi lijekovi. Iz perspektive situacije, pored biljaka Cistanche i Cistanche tubehua zabilježenih u izdanju "Kineske farmakopeje" iz 2020. godine, tu su i Cistanche sinensis G. Beck, C. salsa (CA Mey.) G. Beck, Lanzhou Cistanche C. lanzhouensis ZY Zhang, itd. [4], postoji i veliki broj lažnih doping fenomena. Uz razvoj i kontinuirano poboljšanje tehnologije molekularne biologije, tehnologija molekularne identifikacije ima prednosti manje potrošnje uzoraka, velike brzine i visoke preciznosti, te se široko koristi u identifikaciji vrsta životinja i biljaka. Razvoj istraživanja rudarstva resursa je također relativno brz [5]. Trenutno je postignut određeni napredak u identifikaciji Cistanche medicinskih materijala tehnologijom molekularne identifikacije. Prema klasifikaciji tehnologije molekularnih markera koja je potrebna za molekularnu identifikaciju [6], ovaj rad razmatra identifikaciju germplazme Cistanche deserticola i druge aspekte, te razmatra postojanje identifikacije germplazme Cistanche deserticola. Analizirati probleme i iznijeti odgovarajuća rješenja, u cilju pružanja referenci za zaštitu, racionalno korištenje i uzgoj novih sorti biljaka Cistanche.

1 Primjena tehnologije DNK barkodiranja u identifikaciji biljaka Cistanche

1.1 Tehnologija DNK barkodiranja

Godine 2003., profesor Paul Hebert sa Univerziteta Guelph u Kanadi uveo je tehnologiju bar kodova u biološki svijet i prvi predložio koncept "DNK barkoda" [7]. Tehnologija DNK bar koda je efikasna metoda za identifikaciju tradicionalne kineske medicine i višestrukih sirovina. Za odgovarajuću DNK, fragmenti kandidata su amplificirani pomoću opšte lančane reakcije polimeraze (PCR), proizvodi PCR amplifikacije su pročišćeni, sekvencionirani i analizirani, tražena je ciljna DNK barkod sekvenca i konstruiran je sistem za prepoznavanje DNK barkoda [8 ]. Zaključno, identifikacija DNK bar kodom je metoda biomolekularne identifikacije koja koristi jedan ili nekoliko relativno kratkih, standardnih fragmenata DNK za identifikaciju vrste [9].

Posljednjih godina, kroz kombinaciju tehnologije sekvenciranja visoke propusnosti i tehnologije identifikacije DNK barkodova, razvijena je nova tehnologija koja može detektirati sekvence barkodova više vrsta u mješovitim uzorcima u isto vrijeme——DNK metabarkod, čiji je osnovni princip je primjena sekvenciranja visoke propusnosti. Tehnologija dobija pojačanu sekvencu miješanog barkoda i identifikuje sastav vrsta u miješanom uzorku pomoću bioinformatičke analize[10].

1.2 Izbor sekvenci DNK bar kodova

Barkod sekvence koje se mogu koristiti u tehnologiji DNK barkodiranja uključuju mitohondrijalni koenzim Ⅰ (CO Ⅰ) DNK, 12S rRNA, 16S rRNA sekvence i ribosomalnu 18S rDNK za identifikaciju životinjskih vrsta[11]; ribosomalna 16S rDNK za identifikaciju bakterija[12] ], fragmenti gena specifičnih za ribosomalni interni transkribovani razmak (ITS) i sekvence CO I za identifikaciju gljivica[13]; zbog spore evolucije mitohondrijskih genoma u biljkama, fragmenti bar koda se uglavnom odabiru na genomu hloroplasta. Predloženi fragmenti gena uglavnom uključuju rpoB, rpoC1, matK, rbcL i UPA, a fragmenti nekodirajuće regije uključuju atpF-atpH, trnH-psbA, psbK-psbI i

Nukleirani gen ITS[14]. Godine 2006, istraživačka grupa Chen Shilina testirala je sposobnost diskriminacije ITS2 na više od 6.600 biljnih uzoraka i otkrila da je efikasnost identifikacije ITS2 na nivou vrste čak 92,7 posto, što ukazuje da ITS2 sekvenca može identificirati standardne DNK barkodove ljekovite biljke i srodne vrste. ITS2 je korišten kao nova vrsta univerzalnog DNK barkoda za ljekovito bilje [15], a prepoznali su ga međunarodni stručnjaci [16].

Godine 2013., Nacionalni komitet za farmakopeju raspravljao je i odobrio uključivanje smjernica za molekularnu identifikaciju DNK bar kodova za kineske medicinske materijale u dodatno izdanje "Kineske farmakopeje". ITS2 je osnovni DNK barkod identifikacioni sistem za biljne medicinske materijale [17].

Trenutno su mnogi naučnici sproveli istraživanja molekularne identifikacije na biljkama Cistanche. Prema istraživanju Chen Shilina i dr. [18], ITS2 je pogodan kao standardna sekvenca bar koda za identifikaciju ljekovitog bilja. Sun Zhiying i saradnici [19] su otkrili da se ITS2 sekvenca može koristiti kao osnova za efikasnu identifikaciju kineskog biljnog lijeka Cistanche deserticola i njegovih krivotvorenih proizvoda u DNK bar kodovima. Wang Xiaoyue i ostali[20] koristili su ITS2 barkodove da identifikuju 4 uobičajena zamućena proizvoda Cynomorium, Cistanche, Liedang i Cistanche i uspješno su uspostavili "molekularnu identifikacionu kartu" Cistancheovih zamućenih proizvoda. Metoda identifikacije ljekovitih biljaka kroz ITS2 sekvence je relativno zrela i ima prednosti u pogledu brzine, tačnosti i efikasnosti. Stoga je korištenje ITS2 sekvence za identifikaciju biljaka Cistanche postala najčešće korištena metoda.

1.3 Tok rada DNK barkodiranja

Tok rada DNK barkodiranja sličan je operaciji molekularnog filogenetskog istraživanja, a glavni koraci su prikazani na slici 1. Gu Xiuyan [21] je dobio osnovnu sekvencu ITS-a i analizirao razlike između vrsta i otkrio da je Cistanche blisko srodan sa Cistanche slanom otopinom, a Cistanche u Lanzhouu je usko povezan sa Cistancheom, što također pruža osnovu za razvoj novih izvora lijeka Cistanche. osnovu. Li Zhenhua et al[22] sproveli su istraživanje molekularne identifikacije DNK na Cynomoriumu, Cistancheu i Huanghua Liedangu i ostvarili brzu i tačnu identifikaciju Cistanchea i krivotvorenog Cynomoriuma, Cistanchea i Huanghualiedanga putem PCR specifične za lokaciju.

Ukratko, već postoji relativno kompletan proces za identifikaciju biljnih vrsta pomoću DNK bar kodova. Identifikacija biljaka Cistanche analizom sekvenci DNK i uspostavljanjem povezane baze podataka može pružiti više osnova za identifikaciju i klasifikaciju biljaka Cistanche u budućnosti.

1.4 Analiza podataka o DNK barkodiranju

Obrada i analiza dobijenih podataka je veoma važan zadatak[18]. Nakon što je sekvenciranje završeno, poređenje sekvenci i ručna korekcija se izvode kako bi se uklonile sekvence niskog kvaliteta i regioni prajmera. Često korišteni softver uključuje Chromas, CExpress[23], itd.; Analiza genetičke udaljenosti završne sekvence općenito se provodi softverom MEGA [24] za analizu genetske udaljenosti između uzoraka različitih biljnih vrsta, a K2P model [25-26] se koristi za izračunavanje intraspecifične udaljenosti između vrsta ; zatim konstruirajte stablo filogenije spajanja susjeda (NJ), koristeći internetsku web stranicu iTol [27] da poboljšate i uljepšate stablo razvoja (https://itol.embl.de/), i provjerite stopu podrške svake grane prema bootstrap (1000 ponavljanja).

BLAST metoda je algoritam pretraživanja zasnovan na BLAST-u. Neophodno je uspostaviti ili preuzeti referentnu bazu podataka sekvenci za identifikaciju vrsta u bazi podataka GenBank (https://www.ncbi.nlm.nih.gov/) za naknadnu analizu fragmenata gena i rad na identifikaciji vrsta [28]. Xu Danyun et al[29] koristili su 3 para univerzalnih prajmera DNK bar koda za identifikaciju 22 vrste biljaka Lauraceae i uspješno identificirali 20 vrsta biljaka. Adolfo et al[30] uspješno su identificirali 3 vrste biljaka Pueraria koristeći ITS2 i matK bar kodove. Gore navedene studije pokazuju da se dobijanjem i analizom sekvenci DNK ljekovitih biljaka biljne vrste mogu brzo i efikasno identificirati.

2 Primjena drugih tehnika molekularnih markera u identifikaciji biljaka Cistanche

Za organizme, njihove osobine iznad molekularnog nivoa su konačno određene molekularnim osobinama. U poređenju sa morfološkom analizom [31] i analizom hromozoma [32], molekularni markeri mogu otkriti pravo lice biološke genetske raznolikosti. Sarwat i suradnici [33] koristili su pojačani polimorfizam dužine fragmenata (AFLP), selektivno pojačanu polimorfnu mikrosatelitsku tehnologiju lokusa (SAMPL), jednostavnu intersekvencijsku amplfikaciju ponavljanja (ISSR), nasumično pojačanu polimorfnu DNK (RAPD) i druge tehnike molekularne markerske raznolikosti otkrile su genetičku raznolikost. uzoraka Tribulus terrestris prikupljenih sa različitih mjesta u Indiji, a rezultati su pokazali da ove četiri tehnike molekularnih markera mogu dobiti različite DNK otiske prstiju jedinstvene za svaku geografsku regiju. Međunarodna unija za zaštitu prava biljnih sorti (UPOV) takođe koristi identifikaciju molekularnih markera DNK kao pomoćno sredstvo za DUS (ujednačenost i stabilnost razlikovanja) testiranje sorti useva [34]. Trenutno su tehnologije molekularnih markera kao što su AFLP, RAPD i ISSR relativno zrele i široko se koriste u identifikaciji biljaka Cistanche (Tabela 1).

Podrška:

wallence.suen@wecistanche.com 0015292862950