Akutni neuroprotektivni efekti poli(pro-17 estradiola) ovisni o dozi u mišjem modelu povrede kontuzije kičme

Abstract

17 -Estradiol (E2) daje neuroprotekciju u pretkliničkim modelima ozljede kičmene moždine kada se primjenjuje sistemski. Cilj ove studije bio je da se E2 nanese lokalno na ozlijeđenu kičmenu moždinu kroz dugotrajno trajanje korištenjem poli(pro-E2) filmskih biomaterijala.

Kako ljudi saznaju više o ozljedama kičmene moždine, počinjemo shvaćati njihov utjecaj na fizičko i mentalno zdravlje ljudi. Iako ozljede kičmene moždine mogu uzrokovati mnoge štetne posljedice, na sreću, njihov utjecaj na pamćenje može se kontrolisati.

Prvo treba da razjasnimo šta je povreda kičmene moždine. Kičmena moždina je živac zaštićen u kralježnici koji je odgovoran za prijenos instrukcija iz mozga u različite dijelove tijela. Ako je kičmena moždina ozlijeđena, neki dijelovi tijela će izgubiti dobru vezu s mozgom, što će rezultirati oštećenim pokretima udova, osjetom i autonomnom kontrolom.

Povrede kičmene moždine mogu imati određeni uticaj na pamćenje ljudi, posebno u ranim fazama rehabilitacije pacijenata sa povredama kičmene moždine. Ozljede kičmene moždine mogu uzrokovati pogoršanje pažnje, radne memorije i emocionalne obrade, što će utjecati na sposobnost pamćenja osobe.

Međutim, ovi negativni učinci će se postepeno smanjivati ​​kako pacijenti budu podvrgnuti rehabilitacijskom tretmanu. Pacijenti mogu poboljšati svoje pamćenje sudjelovanjem u igrama pamćenja i drugim kognitivnim treninzima. Istovremeno, fizička rehabilitacija je također pogodna za obnavljanje motoričkih i senzornih funkcija tijela, čime se poboljšavaju emocionalne i kognitivne funkcije.

Trebali bismo potaknuti pacijente s ozljedama kičmene moždine da aktivno učestvuju u rehabilitacijskom liječenju i ustraju na rehabilitacijskim obukama kako bi poboljšali fizičko i mentalno zdravlje. Vjerujte da uz pomoć ispravne spoznaje i postoperativnog liječenja pacijenti mogu prevladati utjecaj ozljede kičmene moždine na pamćenje i nastaviti živjeti aktivnim životom. Vidi se da moramo poboljšati pamćenje, a Cistanche može značajno poboljšati pamćenje jer Cistanche može regulisati i ravnotežu neurotransmitera, kao što je povećanje nivoa acetilholina i faktora rasta, koji su veoma važni za pamćenje i učenje. Osim toga, Cistanche također može poboljšati protok krvi i promovirati isporuku kisika, što može osigurati da mozak dobije dovoljnu ishranu i energiju, čime se poboljšava vitalnost i izdržljivost mozga.

Kliknite znati suplemente za poboljšanje pamćenja

Nakon kontuzivne ozljede kičmene moždine kod odraslih mužjaka miševa, poli(pro-E2) filmovi su implantirani subduralno, a neuroprotekcija je procijenjena imunohistohemijom 7 dana nakon ozljede i implantacije. U ovim studijama, poli(pro-E2) filmovi su umjereno poboljšali neuroprotekciju bez utjecaja na upalu u poređenju sa povređenim kontrolama.

Da bi se povećala oslobođena doza E2, poli(pro-E2) filmovi koji otpuštaju bolus su proizvedeni ugrađivanjem nevezanog E2 u poli(proE2) filmove.

Međutim, u poređenju sa povrijeđenim kontrolama, poli(pro-E2) filmovi koji oslobađaju bolus nisu značajno poboljšali neuroprotekciju niti ograničili upalu 7 ili 21 dan nakon ozljede. Budući rad će se fokusirati na razvoj poli(pro-E2) biomaterijala sposobnih za tačnije oslobađanje terapijskih doza E2.

UVOD

Traumatska ozljeda kičmene moždine (SCI) je iscrpljujuće stanje koje pogađa više od 18,000 ljudi svake godine u Sjedinjenim Državama,1 dok se globalna prevalencija SCI procjenjuje na između 236 i 1009 na milion.2

Pacijenti zahvaćeni SCI imaju ozbiljne neurološke nedostatke uključujući gubitak osjeta, oštećenu funkciju crijeva/mokraćnog mjehura i paralizu.3,4 Primarni utjecaj na kičmenu moždinu dovodi do smrti neurona na mjestu ozljede što je dodatno pogoršano nekoliko kaskada sekundarnih ozljeda koje uključuju astrocite i makrofage .

Vremenom, ovi astrociti formiraju glijalni ožiljak koji sprečava proširenje aksona izvan ivice lezije.5 Do danas ne postoje neuroprotektivni lekovi odobreni od strane FDA za lečenje SCI.

Istraživanja koja su se protegla nekoliko decenija fokusirala su se na sistemsko davanje biomolekula da bi se sprečio gubitak neurona usled sekundarne povrede i/ili da se promoviše regeneracija aksona, što na kraju dovodi do obnavljanja izgubljene funkcije.6 Jedna biomolekula koja je pokazala značajno obećanje u pretkliničkim modelima SCI je ženka. polni hormon, 17 -estradiol (E2).

Primena E2 je široko korisna za centralni nervni sistem smanjenjem upale,7-9 ublažavanjem reaktivnosti glijalnih ćelija,10 ograničavanjem oksidativnog stresa,11-14 i ublažavanjem ekscitotoksične neuronske smrti izazvane glutamatom.15 E2 poboljšava funkcionalni oporavak u različitim modelima glodara, SCI. 16,17 Zanimljivo je da sistemska primjena višestrukih doza E2 brže izaziva funkcionalni oporavak18,19 u poređenju sa životinjama koje su primale samo jednu dozu.17

Budući da E2 efikasnije promoviše funkcionalni oporavak kroz režime višestrukih doza, naš cilj je bio stabilno oslobađanje E2 lokalno na mjestu ozljede (kako bi se spriječili efekti izvan cilja) kako bi se zaobišli problemi koji proizlaze iz višestrukih doza/sistemskih injekcija E2.

U tu svrhu koristili smo poli(prolijekove) biomaterijalnu strategiju u kojoj je nativni lijek (E2) prvo funkcionaliziran reaktivnim alilnim grupama, a zatim polimeriziran fotoiniciranim tiol-enskim radikalnim adicijom sa fleksibilnim oligo-(etilen glikol) ditiolom, kao što je prethodno opisano. .20 Dobili smo polimerne lance visoke molekularne težine, koji se sastoje od E2prolijeka kao ponavljajuće jedinice unutar polimera.

Nakon hidrolitičke degradacije, polimer postepeno oslobađa E2 u okolni medij. Jedini drugi nusproizvodi iz tog oslobađanja su ugljični dioksid i oligo(etilen glikol) (oEG) (Slika 1). Poli(pro-E2) lanci proizvedeni u filmove ili mikrovlakana mogu oslobađati E2 u nanomolarnim koncentracijama in vitro na vremenskoj skali od mjeseci do godina .20

E2 oslobođen iz ovih poli(pro-E2) skela je bioaktivan, a ove skele promovišu neurotrofizam i neuroprotekciju in vitro štiteći neurone od oksidativnog stresa izazvanog vodikovim peroksidom. Ovdje smo primijenili poli(pro-E2) filmove u mišjem modelu kontuzije SCI, neposredno nakon ozljede, i procijenili njihovu neuroprotektivnu sposobnost in vivo.

Naš prvobitni dizajn poli(pro-E2) filma akutno je povećao neuroprotekciju (7 dana nakon ozljede) na mjestu ozljede bez utjecaja na upalni odgovor. Budući da poli(pro-E2) filmovi oslobađaju nanograme E2 dnevno, razvili smo drugu strategiju oslobađanja gdje je nevezani E2 ugrađen u poli(pro-E2) matricu. Pretpostavili smo da bolusno oslobađanje nevezanog E2 može pružiti dodatne neuroprotektivne prednosti.

Poli(pro-E2) filmovi oslobađaju E2 na način praska, nakon čega slijedi kontinuirano oslobađanje E2 iz polimera pri nižim koncentracijama. Imunohistološkim bojenjem procijenjeni su neuroni, astrociti i makrofagi/mikroglije prisutni na mjestu ozljede akutno (7 dana nakon ozljede) i kronično (21 dan nakon ozljede) nakon SCI u prisustvu ovih poli(pro-E2) filmova koji oslobađaju bolus.

REZULTATI I DISKUSIJA

Poli(pro-E2) filmovi oslobađaju E2 u nanomolarnim koncentracijama, potiču rast neurona iz ganglija dorzalnog korijena i štite neurone od oksidativnog stresa izazvanog vodikovim peroksidom in vitro.20 Studija predstavljena ovdje nastoji utvrditi sposobnost poli(pro-E2) filmove za pružanje neuroprotekcije in vivo koristeći mišji model kontuzije SCI.

Umjerena kontuzija SCI je indukovana kod odraslih mužjaka miševa, a odmah nakon ozljede, poli(pro-E2) filmovi su postavljeni direktno iznad ozljede (slika 2A). Kako bi se osiguralo da poli(pro-E2) filmovi ostanu na mjestu nakon implantacije, poli(pro-E2) filmovi napunjeni rodaminom B implantirani su u kičmenu moždinu ozlijeđenih životinja. Sedam dana nakon implantacije, kičmena moždina je sakupljena i snimljena pomoću svjetlosnog mikroskopa (slika 2B). Kod svih životinja, implantirani poli(pro-E2) filmovi napunjeni rodaminom B ostali su na mjestu potvrđujući protokol implantacije.

Da bi se testirala sposobnost poli(pro-E2) filmova da obezbede neuroprotekciju i ublaže upalu, poli(pro-E2) filmovi (bez rodamina B) su implantirani nakon povrede kičmene kontuzije, a kičmena moždina je sakupljena 7 dana nakon povrede i implantacije. Uzdužni presjeci (debljine 10 μm) su izrezani, centrirani oko epicentra ozljede, i imunoobilježeni za vizualizaciju neurona i makrofaga u kičmenoj moždini (Slika 3).

Sekcije su označene za NeuN kako bi se procijenilo prisustvo neurona, a kvantitativna analiza bojenja je otkrila da su poli(pro-E2) filmovi značajno povećali NeuN pozitivno područje oko epicentra ozljede u poređenju sa povrijeđenim kontrolama koje nisu primile filmske implantate (Slika 3A; p=0.0002). Dodatno bojenje aksona korištenjem NFH (teški lanac neurofilamenta) također je otkrilo akutni neuroprotektivni efekat implantiranih poli(pro-E2) filmova (Slika 3B; p=0.0017).

Primijetili smo da ova promjena u neuroprotekciji nije posljedica promjene apoptoze (kapaza 3) na mjestu ozljede (Podržana slika S1; p=0.9966). Bojenje za aktivirane makrofage (CD68) također nije otkrilo nikakve značajne razlike između životinja tretiranih poli(pro-E2) filmom i netretiranih životinja (slika 3C; p= 0.7207).

Uzeti zajedno, poli(pro-E2) filmovi skromno povećavaju neuroprotekciju akutno bez promjene upalnog odgovora. Poli(pro-E2) filmovi akutno su povećali gustinu neurona za skoro 20%, ali filmovi nisu imali očigledne protuupalne efekte (na osnovu kvantifikacije područje koje zauzimaju aktivirani makrofagi) (slika 3).

Ovaj nedostatak smanjenja upale može ukazivati ​​na to da su protuupalne i neuroprotektivne doze E2 različite i da obje nisu postignute s trenutnom formulacijom filma.20 Pretpostavili smo da povećanje oslobađanja E2 iz poli(pro-E2) filmova može akutno smanjiti upalu. i omogućavaju snažniji neuroprotektivni odgovor.

Da bi se povećala doza akutno otpuštenog E2, poli(pro-E2) filmovi su modificirani tako da se bolus E2 oslobađa odmah nakon implantacije. Nakon bolusnog otpuštanja E2, uslijedila bi degradacija polimera do oslobađanja E2 u istoj koncentraciji kao prije. Gore opisani eksperiment je ponovljen korištenjem ovih poli(pro-E2) filmova koji oslobađaju bolus, a neuroprotekcija i upala su procijenjeni 7 dana nakon ozljede (dpi).

Međutim, umjesto dodatne koristi, poli(pro-E2) filmovi koji oslobađaju bolus nisu značajno povećali NeuN pozitivnu površinu u poređenju sa povrijeđenim, neliječenim kontrolama (Slika 4A; p=0.6770). Poli(proE2) filmovi koji oslobađaju bolus povećali su ekspresiju CD68, ali povećanje nije bilo statistički drugačije (p= 0.1780).

Povećani trendovi glijalne reaktivnosti i mikroglijalne upale su također uočeni u prisustvu poli(pro-E2) filmova koji oslobađaju bolus zbog povećanja ekspresije GFAP (astrocita) i Iba1 (mikroglije); međutim, ova povećanja nisu bila statistički veća od onoga što je uočeno kod povrijeđenih, neliječenih kontrola (p=0.3233 i p=0.3053, respektivno). Uzeti zajedno, poli(pro-E2) filmovi koji oslobađaju bolus nisu pojačali neuroprotekciju, a reaktivnost astrocita i prisustvo makrofaga/mikroglije nisu smanjeni kao što je prvobitno pretpostavljeno.

Budući da razlike između ozlijeđenih, neliječenih životinja i ozlijeđenih životinja tretiranih poli(proE2) filmom s bolusnim oslobađanjem nisu primijećene u akutnoj vremenskoj tački od 7 dpi, odabrana je kronična vremenska tačka za daljnje istraživanje jer su poli(pro-E2) filmovi može dugoročno oslobađati E2.20 Eksperiment opisan gore je ponovljen sa bolus-oslobađajućim poli(pro-E2) filmovima, ali su životinje procjenjivane kronično na 21 dpi (Slika 5).

Kičmena moždina su označene za iste tipove ćelija koje su ranije navedene. Nakon analize, uočen je trend povećanja udjela površine NeuN u životinjama implantiranim poli(pro-E2)filmom koji otpušta bolus u poređenju sa ozlijeđenim, neliječenim životinjama (Slika 5A; p=0.0897) Osim toga, uočeni su trendovi gdje su poli(pro-E2) filmovi koji otpuštaju bolus smanjivali udio površine ekspresije CD68 i GFAP u poređenju s podacima iz neliječenih, ozlijeđenih kontrolnih životinja (Slika 5B, C; p=0.0859 i p=0.2780).

Međutim, nijedan od trendova nije bio statistički različit. S druge strane, Iba1 označeni dijelovi tkiva životinja tretiranih poli(pro-E2) s bolusnim oslobađanjem pokazali su povećanu ekspresiju u poređenju sa podacima iz neliječenih, ozlijeđenih kontrola (p < 0.0001). Naš prethodni rad pokazuje da poli(pro-E2) -E2) filmovi izliveni na pokrovnim stakalcima 15 mm × 15 mm oslobađaju oko 266 ng E2 dnevno,20 što znači oko 2 ng E2 dnevno iz filmova (1 mm × 1,8 mm) koji se ovdje koriste. Poli(pro-E2) filmovi koji oslobađaju bolus oslobađaju dodatnih 40 ug nevezanog E2 akutno nakon implantacije.

Istraživanja koja se fokusiraju na upotrebu E2 u SCI modelima glodavaca pokazuju da niske doze estrogena (10 ug/kg) primijenjene intravenozno smanjuju reaktivnu gliozu i osiguravaju neuroprotekciju dok ublažavaju upalne događaje, inhibiraju apoptozu i povećavaju angiogenezu.21 Suprotno tome, visoke, sistemske doze estrogena imaju štetni efekti koji uključuju povećanu stopu duboke venske tromboze i raka22,23 i razvoj ženskih fizičkih osobina kod muškaraca. Ovo je vrijedno pažnje jer se većina istraživanja E2 fokusirala na isporuku E2 sistemsko, bilo intravenozno ili intraperitonealno.

Uzimajući u obzir sigurnosne probleme kod sistemske upotrebe visokih doza E2, važno je optimizirati koncentraciju E2 za lokalnu dostavu u ozlijeđenu kičmenu moždinu kako bi se spriječile nuspojave. Do danas, samo jedna studija je isporučila E2 iz biomaterijala korištenjem nanočestica za fokalno isporuku E2 (2,5 ug ili 25 ug). Oslobađanje od nanočestica je brzo smanjilo upalu u modelu kontuzije SCI kod štakora.9 Nedostatak statistički značajnog odgovora u našim podacima (Slike 4 i 5) može biti posljedica neravnoteže u količini E2 koju isporučujemo lokalno u kičmenu moždinu sa previše E2 (40 ug) se oslobađa akutno, dok se vrlo malo (2 ng) oslobađa kronično.

Iako su ono što opažamo iz ovih podataka skromni trendovi, ova studija naglašava važnost doziranja E2 za promicanje neuroprotekcije in vivo. Smanjenje početne doze E2 i prilagođavanje kinetike razgradnje poli(pro-E2) biomaterijala moglo bi pomoći u ublažavanju ovog problema i potencijalno pružiti bolje neuroprotektivne rezultate.

Iako je ova studija provedena isključivo na muškarcima, ključno je procijeniti učinak ovih poli(pro-E2) filmova na oba spola kako bi se utvrdio valjani translacijski potencijal za ovaj biomaterijal. Istraživanja su pokazala da nakon SCI, povećani nivoi estrogena kod žena mogu biti djelimično odgovorni za njihove poboljšane funkcionalne rezultate u odnosu na muškarce.24 Pošto postoji povećano prisustvo estrogena kod žena, svaka strategija biomaterijala koja koristi estrogen mora uzeti u obzir ovaj povećani nivo i modificirati materijal kinetiku otpuštanja u skladu s tim kako biste osigurali da isporučena doza ostane ista za muškarce i žene.

METODE

Izrada poli(pro-E2) filmova.

Poli(pro-E2) polimer P1 je sintetiziran i okarakteriziran kako je prethodno detaljno opisano.20 Polimer ima prosječnu molekularnu težinu od MW ~ 80 kDa i disperznost Đ ~ 3, prema gel permeacijskoj hromatografiji (GPC). Poli(pro-E2)filmovi su proizvedeni otapanjem polimera u hloroformu (5 tež. %/tež.; polimer/hloroform), ukapavanjem otopine na staklena pokrovna stakala veličine 15 mm × 15 mm (100 μL otopine po pokrovnom staku) i ostavljanjem sušiti preko noći pod vakuumom (<100 mTorr) at room temperature (RT). In a subset of experiments, the polymer solution was supplemented with rhodamine B (0.005 wt %/wt; rhodamine B/chloroform) (Sigma-Aldrich, St. Louis, MO) to verify the presence of the poly(pro-E2) films in animals post-implantation.
Za stvaranje poli(pro-E2) filmova sa nevezanim E2, filmovi su proizvedeni dodavanjem nevezanog E2 (Abcam, Cambridge, MA) u otopinu polimera (0.0625 wt %/wt; E2/kloroform) prije livenja rastvor na pokrovnim stakalcima. Prije implantacije, pokrovni stakalci sa filmovima su sterilizirani ultraljubičastim (UV) zračenjem u trajanju od 30 minuta, a filmovi su oguljeni sa pokrovnih stakala u sterilnom biološkom ormariću. Poli(pro-E2) filmovi su zatim izrezani na komade veličine 1 mm × 1,8 mm, pogodne za implantaciju u odraslog miša kao što je opisano u nastavku.

Kontuzija Povreda kičmene moždine i implantacija poli(pro-E2) filmova.

Sve hirurške i postoperativne procedure za njegu su odobrili Rensselaer PolytechnicInstitute i Institucionalni komiteti za negu i upotrebu životinja Univerziteta Ohajo (IACUC). Da bi se izazvala kontuzija SCI, odrasli mužjaci miševa C57BL/6 (10- do 12-nedjelja), kupljeni od Jackson Laboratory (br. dionice 000664; Bar Harbor, ME), anestezirani su intraperitonealnom injekcijom ketamina (80 mg/kg) i ksilazina (10 mg/kg). Leđa životinja su obrijana i aseptički pripremljena upotrebom 70% etanola i betadina.

Nakon postavljanja životinje na podlogu za grijanje održavanu na 37 stepeni, otvoreni su slojevi kože i mišića kako bi se otkrio kičmeni stub, a dorzalna laminektomija je izvedena na torakalnom devetom (T9) pršljenovi kako bi se otkrila kičmena moždina. Umjerena (75 kdyn) kontuzija SCI je izazvana na ovom nivou korištenjem Infinite Horizons impaktora (Precision Systems andInstrumentation, Lexington, KY).

Nakon postizanja hemostaze, dura je otvorena (Slika 2) i stavljen je poli(pro-E2) film ili poli(pro-E2) film koji oslobađa bolus (1 mm × 1,8 mm) ispod dure i iznad kičmene moždine, pokrivajući mestu povrede. Kod kontrolnih životinja, dura je otvorena, ali poli(pro-E2) filmovi nisu implantirani. Mišićni slojevi su potom zatvoreni sterilnim šavovima, a koža je zatvorena sterilnim metalnim kopčama za rane.

Miševi su primili 2 mL sterilnog fiziološkog rastvora koji je ubrizgan subkutano i vraćeni su u kaveze i stavljeni na grijač stakalca postavljen na 37 stepeni preko noći. Kako bi se osigurala odgovarajuća hidratacija i spriječile infekcije, miševima je supkutano ubrizgano 1-2 mL sterilnog fiziološkog rastvora i gentocina (1 mg/kg) dnevno tokom prvih 5 dana nakon ozljede (dpi). Mjehuri su ručno eksprimirani dva puta dnevno za vrijeme trajanja eksperimenata. Sve životinje su bile smještene u konvencionalnim uvjetima u ciklusu od 12-satnog svjetla i mraka sa ad libitum pristupom hrani i vodi.

Tissue Harvesting.

U naznačenim terminalnim vremenskim tačkama od 7 ili 21 dpi, miševima je ubrizgana smrtonosna doza ketamina/ksilazina (1,5× hirurška doza) i transkardijalno perfuzirana sa 0.1 fiziološkom otopinom puferovanom MPosfatom (PBS; pH 7,4) zatim 4% paraformaldehid (PFA; pH 7,4). Kičmene moždine su uklonjene, naknadno fiksirane 2 h u 4% PFA, a zatim prebačene u 0.2M fosfatni pufer (PB; pH 7,4) preko noći.

Kičmena moždina je krioprotektovana u 30% saharoze tokom 48 h na 4 stepena, a zatim blokirana u segmente od 10 mm centrirane oko mesta povrede sa dorzalnim stubovima okrenutim prema gore. Ove sekcije su ugrađene u medij za optimalnu temperaturu rezanja Tissue-Tek (VWR International, Radnor, PA) i brzo zamrznute na suvom ledu. Sve kičmene moždine su isječene na 10 μm na Microm HM505E kriostatu, postavljene na stakalce ColorFrost Plus (ThermoFisher Scientific Waltham, MA), a zatim se čuva na -20 stepeni dok se ne koristi za imunobojenje.

Imunohistohemija i kvantifikacija.

Stakalca su odmrznuta na grijaču stakalca 1 h, a zatim isprana 3 puta u 0.1 MPBS. Aktivnost endogene peroksidaze je ugašena inkubacijom stakalca u 6% H2O2 razrijeđenoj u metanolu 15 minuta na sobnoj temperaturi. Nakon pranja 3 puta u 0.1 M PBS, sekcije su inkubirane sa 4% BSA i 0.1% Triton X-100 u 0.1 M PBS za 1 h nakon čega slijedi inkubacija primarnih antitijela preko noći na 4 stepena ili sobnoj temperaturi (Tabela 1).

Stakalca su inkubirana sa odgovarajućim biotiniliranim sekundarnim antitelima (1:1000; Vector Laboratories, Burlingame, CA) na sobnoj temperaturi 1 h. Za vizualizaciju vezanog antitijela, pločice su inkubirane sa Vectastain Elite-ABC (Vector Laboratories) 1 h i razvijene sa ImmPACT3,3′-diaminobenzidinom (DAB) ili Vector SG supstratom (Vector Laboratories) 10 minuta.

Ove sekcije su dehidrirane kroz uzastopne inkubacije od 2 × 2 minute u 70% i 90% etanolu, 2 × 3 minute u 100% etanolu, nakon čega su uslijedile 3 × 3 minute u Histoclear-u i na kraju prekrivene Permountom (ThermoFisher Scientific). Za kvantifikacionu analizu korišteno je šest rezova po životinji, razmaknutih 100 μm od ozlijeđene kičmene moždine.

Imunološki označeni dijelovi snimljeni su pomoću mikroskopa za snimanje Axioplan 2 opremljenog AxioCamdigital kamerom i softverom AxioVision verzija 4.8.2 (Carl Zeiss Microscopy GmbH, Jena, Njemačka) i objektivom 5×.

Broj pozitivnih piksela u svakoj sekciji je prebrojan korištenjem MIPAR softvera za analizu slike (MIPAR, Worthington, OH) da bi se izračunao postotak pozitivne površine udjela po sekciji. Prosječni postotak pozitivne površine šest dijelova po životinji izračunat je za svaku od mrlja i prijavljen.

Statistička analiza.

Svi podaci su prikazani kao srednja vrijednost ± standardna devijacija. Statistička analiza je izvršena korišćenjem GraphPad Prism 9 statističkog softvera (GraphPad Software, San Diego, CA). U svim eksperimentima korišćeno je 5-6 životinja po grupi, poreklom iz najmanje dve različite serije životinja. Za testiranje razlika između kontrolne i grupe poli(pro-E2) filmova korišten je Studentov t-test (slike 3, 4 i 5). Značajnost je utvrđena na p manje od ili jednako 0.05.

Dodatni materijal

Pogledajte web verziju na PubMed Centralu za dodatni materijal.

ZAHVALNICA

Autori zahvaljuju Wenmin Lai na pomoći u operacijama na mišu.

Finansiranje

Ovaj rad je dobio podršku od Craig H. Neilsen Foundation Fellowship (Grant 468116) i Paralyzed Veteransof America Research Foundation Fellowship (Grant 3171) za MKG i od NIH R01 (Grant NS092754) i Državnog instituta za kičmenu moždinu C3GRJ za reviziju povreda kičmene moždine3GRJ5 Odbora za pregled Sav rad na životinjama obavljen je uz pomoć kirurškog jezgra Odjeljenja za neuronauku Državnog univerziteta Ohajo uz podršku NINDS Grant P30NS104177.

REFERENCE

(1). Nacionalni statistički centar za povrede kičmene moždine. (2020) Činjenice i brojke o povredama kičmene moždine na kratko, Univerzitet Alabama u Birminghamu, Birmingham, AL.

(2). Cripps RA, Lee BB, Wing P, Weerts E, MacKay J i Brown D (2011) Globalna karta za epidemiologiju traumatske ozljede kičmene moždine: prema živom spremištu podataka za prevenciju povreda. Kičmena moždina. 49, 493–501. [PubMed: 21102572]

(3). Donovan WH (2007) Povreda kičmene moždine - prošlost, sadašnjost i budućnost. Journal of Spinal CordMedicine 30, 85–100.

(4). Pickelsimer E, Shiroma EJ, i Wilson DA (2010) Državna istraga o štetnim zdravstvenim uslovima kod osoba sa povredom kičmene moždine kod medicinskih radnika. J. Spinal Cord Med. 33 (3), 221–231. [PubMed: 20737795]

(5). Silver J, i Miller JH (2004) Regeneracija izvan glijalnog ožiljka. Nat. Rev. Neurosci. 5 (2), 146–156. [PubMed: 14735117]

(6). Varma AK, Das A, Wallace G, Barry J, Vertegel AA, Ray SK i Banik NL (2013) Povreda kičmene moždine: Pregled trenutne terapije, budućih tretmana i osnovnih naučnih granica. Neurochem. Res. 38, 895–905. [PubMed: 23462880]

(7). Zendel A, Mönnink F, Hassanzadeh G, Zaminy A, Ansar MM, Habib P, Slowik A, Kipp M i Beyer C (2018.) Estrogen ublažava lokalnu ekspresiju inflamasoma i aktivaciju nakon ozljede kičmene moždine. Mol. Neurobiol. 55 (2), 1364–1375. [PubMed: 28127698]

(8). Lee JY, Choi HY, Ju BG i Yune TY (2018) Estrogen ublažava neuropatski bol izazvan nakon ozljede kičmene moždine inhibiranjem mikroglije i aktivacije astrocita. Biochim. Biophys. Acta, Mol. Basis Dis. 1864 (7), 2472–2480. [PubMed: 29653184]

(9). Cox A, Varma A, Barry J, Vertegel A i Banik N (2015) Nanočestica estrogena u ozljedi kičmene moždine pacova izaziva brze antiinflamatorne efekte u plazmi, cerebrospinalnoj tekućini i tkivu.J. Neurotrauma 32 (18), 1413–1421. [PubMed: 25845398]

(10). Sribnick EA, Samantaray S, Das A, Smith J, Matzelle DD, Ray SK, i Banik NL (2010) Estrogensko liječenje kronične ozljede kičmene moždine nakon ozljede poboljšava lokomotornu funkciju kod pacova. J. Neurosci. Res. 88 (8), 1738–1750. [PubMed: 20091771]

(11). Honda K, Shimohama S, Sawada H, Kihara T, Nakamizo T, Shibasaki H i Akaike A (2001) Nongenomska antiapoptotička transdukcija signala estrogenom u kultiviranim kortikalnim neuronima. J.Neurosci. Res. 64 (5), 466–475. [PubMed: 11391701]

(12). Sribnick EA, Wingrave JM, Matzelle DD, Ray SK i Banik NL (2003) Estrogen kao neuroprotektivni agens u liječenju ozljede kičmene moždine. Ann. NY Acad. Sci. 993,125–133. [PubMed: 12853305]

For more information:1950477648nn@gmail.com