Akteozid u kineskoj prirodnoj biljci - Cistanche za ublažavanje bolesti bubrega--I dio
Mar 03, 2022
Kontakt: emily.li@wecistanche.com
Prirodni proizvod akteozida ublažava ozljedu bubrega kod dijabetesa db/db miševa i HK-2 ćelija putem regulacije NADPH/oksidaze-TGF-/Smad signalnog puta
Qinwen Wang|Xinxin Dai et.al
Ova studija je osmišljena da istraži zaštitne efekte i mehanizmeacteosidena DKD kod dijabetesnih muških db/db miševa i HK-2 ćelija indukovanih visokim nivoom glukoze. Dijabetes db/db miševi su nasumično podijeljeni u modelsku grupu, grupu metformina, grupu irbesartana iacteosidegrupa. Promatrali smo prirodni proizvod odacteosidepokazujući značajan efekat uzaštita bubregakroz analizu biohemijskih indikatora i endogenih metabolita, histopatološka zapažanja i western bloting. HK-2 ćelije podvrgnute visokoj glukozi korištene su u in vitro eksperimentima. Molekularni mehanizmi su ispitivani RT-PCR i Western blot-om.Acteosidesprječava visoke razine glukoze inducirane HK-2 ćelije i dijabetes db/db miševa inhibiranjem NADPH/oksidaze-TGF-/Smad signalnog puta.Acteosidereguliše poremećeni metabolički put metabolizma lipida, metabolizam glioksilata i dikarboksilata i metabolizam arahidonske kiseline. Otkrili smo prirodni proizvod odacteosidepokazuje značajan uticaj nazaštita bubrega.Ova studija utrla je put za dalje istraživanje patogeneze, ranu dijagnozu i razvoj novog terapeutskog agensa za DKD.
KLJUČNE RIJEČI acteoside, dijabetičarbolest bubrega, metaboličko profiliranje, NADPH/oksidaza-TGF-/Smad signalni put, ROS
dio I
Acteoside liječi bolest bubrega
1|UVOD
Acteosideje reprezentativna komponenta feniletanoidnih glikozida, široko rasprostranjenih u 79 rodova biljaka, kao što je Rehmannia glutinosa,Cistanche deserticola, i druge ljekovite biljke.Acteosidekarakterizira ga kafeinska kiselina i hidroksitirosol vezani za dio glukoze putem esterskih i glikozidnih veza, s ramnoznom jedinicom koja je povezana s molekulom glukoze (Zhao et al., 2015.). Izvještava se daacteosideposjeduje široke farmakološke aktivnosti, kao nprbubregzaštita (Gan et al., 2018), antioksidacija (He et al., 2011), neuroprotekcija (Li, Zhou, Xu, Song i Lu, 2018), zaštita jetre (Lee et al., 2004), antikancerogena (Ohno , Inoue, Ogihara, & Saracoglu, 2002) i tako dalje. Međutim, zaštitni efektiacteosidekod dijabetičarapovreda bubregasu nejasne.
Dijabetes je jedan od najbrže rastućih globalnih zdravstvenih hitnih situacija u 21. vijeku. U 2019. godini procjenjuje se da 463 miliona ljudi ima dijabetes, a predviđa se da će taj broj dostići 578 miliona do 2030. godine i 700 miliona do 2045. godine. Globalna prevalencija dijabetesa brzo raste, posebno u zemljama u razvoju, a prevalencija dijabetičarabolest bubrega(DKD) i krajnja fazabubrežna bolest(ESRD) nastavlja da raste (Hu, 2011). DKD je jedna od najstrašnijih dijabetičkih kroničnih mikrovaskularnih komplikacija i glavni uzrok ESRD-a. Smrtnost od svih uzroka kod osoba sa DKD je približno 30 puta veća nego kod dijabetičara bez nefropatije. Nedavne studije ukazuju na tobubrežniakumulacija tubularne epitelno-mezenhimalne tranzicije (EMT) i ekstracitoplazmatskog matriksa (ECM) ububrežniintersticij igra ključne faktore u patogenezi DKD (He et al., 2015; Yao et al., 2014). Sve veći broj studija je izvijestio da je progresijabubrežnifibroza kod dijabetičke nefropatije bila je posredovana mnogim signalnim putevima. TGF- je impliciran kao ključni patogeni faktor u većini tipova CKD povezanih s fibrozom, uključujući DKD (Lv & Zhang, 2019). Heteromerni signalni kompleks, koji je rezultat vezivanja TGF- 1 za receptor tipa II i zauzvrat tipa I receptor, prenosi signale preko receptora reguliranih Smad-a (Smad2/3) i Smad-a zajedničkog partnera (Smad4), što dovodi do regulacija transkripcije ciljnih gena (Sierra et al., 2015). Akumulacija ROS može dovesti do oksidativnog stresa u ćeliji, što dovodi do oštećenja ćelijskih komponenti uključujući proteine i DNK. Na kraju, oksidativni stres dovodi dobubrežnifibroze i opadanjabubrežna funkcija. NADPH oksidaze (NOX) su prihvaćene kao glavni izvori stvaranja ROS kod dijabetičke nefropatije i kroničnebolest bubrega. Povećana regulacija i hiperaktivacija NOX-a također vjerovatno doprinose oksidativnom stresu u patofiziološkim fazama. Elevation of thebubrežniNivo ROS kroz aktivaciju NOX posredovanu hiperglikemijom dovodi do oksidativnog stresa, koji uzrokuje oštećenjetkiva bubrega, uzrokujući DKD (Lee, An, Kim, & Bae, 2020).
Metabolomics je nova i važna omika tehnologija za kvalitativnu i kvantitativnu analizu svih malih molekularnih metabolita u živim ćelijama, tkivima i tjelesnim tekućinama. Kao nova disciplina za identifikaciju ukupnih metaboličkih promjena živih organizama, metabolomika pruža nove uvide u proučavanje dijabetesa i dijabetičkih komplikacija (Lu, Xie, Jia, & Jia, 2013).
Svrha ovog istraživanja bila je istražiti zaštitni učinak prirodnog proizvodaacteosidena DKD muških db/db miševa dijabetičara i HK-2 ćelija induciranih visokom glukozom in vitro i njegovom mehanizmu. Dakle, u ovoj studiji, db/db miševi su usvojeni za procjenububrežnizaštitni efektiacteoside, a analizirana je regulacija različitih metabolita u serumu kako bi se rasvijetlili mehanizmiacteoside. Štaviše, HK-2 in vitro model indukovanog visokom glukozom procjenjuje efikasnostacteosidena db/db miševima određivanjem nivoa ekspresije NADPH/oksidaze-TGF-/Smad signalnog puta.
2|MATERIJALI I METODE
2.1|Hemikalije i instrumenti
UPLC acetonitril je nabavljen od Mercka (Darmstadt, Njemačka); mravlja kiselina je kupljena od Sigma-Aldrich (Sigma, St. Louis, Missouri).Acteoside(Čistoća veća ili jednaka 98 posto) kupljena je od Nacionalnog instituta za kontrolu hrane i lijekova (Peking, Kina). Strukturaacteosideje prikazano na slici 1A. Komplet reagensa za serum uree (BUN), komplet reagensa aspartat aminotransferaze (GOT), komplet reagensa alanin aminotransferaze (GPT), komplet reagensa za ukupni holesterol (TCHO), komplet reagensa za trigliceride (TG), mikroaltbum reagens u serumu kreatinin (Scr), mikroaltbu reagens kit (mALB) komplet reagensa i inzulin (INS) komplet reagensa kupljeni su od Nanjing Jiancheng Bioinženjering Instituta (Nanjing, Kina). Metformin hidrohlorid tablete su kupljene od Sino American Shanghai Squib Pharmaceutical Ltd; Irbesartan je kupljen od Shenzhen Haibin Pharmaceutical Co., Ltd. DMEM i F12 su kupljeni od GIBCO, Amerika; NOX1 (kataloški broj: ab121009), NOX2 (kataloški broj: ab129068), NOX4 (kataloški broj: ab154244) i Smad7 (kataloški broj: ab216428) prvo antitijelo kupljeno je od Abcam-a (Kembridž, Ujedinjeno Kraljevstvo). -SMA (kataloški broj: 19245), E-cadherin (kataloški broj:3195), NF-κB p65 (kataloški broj: 8242), TGF- 1 (kataloški broj: 3711), Smad2 (kataloški broj: 5339) , Smad3 (kataloški broj: 9523), Smad4 (kataloški broj: 46535) i PSmad2/3 (kataloški broj: 8828) prvo antitijelo kupljeno je od CST-a. Sve ostale hemikalije i reagensi korišćeni u ovoj studiji bili su analitičkog kvaliteta i proizvedeni u Kini.
Waters Acquity™ Ultra Performance LC sistem (Waters) opremljen Quattro Micro MS spektrometrom i Waters Xevo TM G2 QTof MS (Waters MS Technologies, Manchester, New Hampshire). Dejonizovana voda je pročišćena na Milli-Q sistemu (Millipore, Bedford, Massachusetts). Za analizu podataka usvojena je radna stanica Mass Lynx v4.1, a korištena je ultra-brza centrifuga na niskoj temperaturi (Thermo Scientific, Velika Britanija) i mikroskop DMI3000M (Leica, Njemačka).
2.2|Eksperimentalni uslovi na životinjama
Sve eksperimentalne procedure i protokoli korišteni u ovoj studiji pregledani su i odobreni od strane Institucionalnog odbora za etiku životinja na Univerzitetu kineske medicine u Nanjingu (Nanjing, Kina). Protokoli opisani u ovoj studiji bili su u skladu sa institucionalnim smjernicama za njegu i korištenje laboratorijskih životinja. Miševi su kupljeni od Centra za istraživanje životinjskih modela Univerziteta Nanjing (Sertifikat br. Su 2015–0001). Svi eksperimenti su izvedeni sa 8-sedmično starim mužjacima db/db miševa i miševima divljeg tipa db/m legla odgovarajućeg uzrasta sa početnom tjelesnom težinom od 30 40 g. Db/db dijabetički mišji model je međunarodno priznati životinjski model dijabetesa. Studije su pokazale da je mehanizam DKD kod db/db miševa sličan onom kod ljudi. Životinje su bile smještene u kavezima sa konstantnom vlažnošću (oko 60 posto ± 2 posto) i temperaturom (ca. 23 ± 2 stepena) i ciklusom svjetlo/mrak od 12 sati. Životinje su prolazile kroz period adaptacije od 3 sedmice, tokom kojeg im je bio dozvoljen neograničen pristup hrani i vodi iz slavine. Nakon perioda aklimatizacije, db/db miševi su nasumično podijeljeni u četiri grupe po šest u svakoj grupi: grupa modela (normalna fiziološka otopina, M), grupa metformina (250 mg kg).-1 d-1, EJSG), irbesartan grupa (50 mg kg-1 d-1, EBST),acteosidegrupa (70 mg kg-1 d-1, MRHTG), jednom dnevno (Gao, Peng, Huo, Liu i Yan, 2015.). Štaviše, u ovoj studiji, metformin i irbesartan su odabrani kao pozitivni kontrolni lijekovi. Prijavljeno je da irbesartan može smanjiti krvni tlak, lipide u krvi ilipida bubrega.Nema uticaja na glukozu u krvi i lipide u jetri. Može poboljšati funkciju i patološku promjenububrezidb/db miševa. Zaštitni efekat metformina nabubregse ogleda u smanjenju proteinurije kod dijabetičkih štakora i pacijenata sa dijabetesom tipa 2. Životinjske doze metformina i irbesartana ekstrapolirane su iz dnevne doze ljudi, korištenjem metode normalizacije tjelesne površine. Zatim je miševima davan odgovarajući lek jednom dnevno ispiranjem želuca tokom 6 nedelja, a db/m miševi su korišćeni kao kontrolna grupa, kojima je davana ista količina fiziološkog rastvora u isto vreme.
2.3|Sakupljanje uzoraka
Tokom eksperimentalnog perioda, tjelesna težina i nivoi glukoze u krvi natašte (FBG) su se bilježili sedmično, nivoi FBG su mjereni One Touch Ultra II sistemom za praćenje glukoze u krvi (Life Scan, Milpitas, Kalifornija) repnom venom svakog ponedjeljka (u 8 ujutro ). Nakon 6 sedmica primjene, miševi su držani u metaboličkim kavezima sa slobodnim pristupom vodi za prikupljanje 24 sata urina. Svi uzorci urina su odmah centrifugirani na 3000 rpm tokom 10 minuta nakon sakupljanja, a supernatanti su odvojeni i pohranjeni na -80 stepeni do analize. Na kraju studije, miševi su žrtvovani pod anestezijom sa 10 posto hloral hidrata (3 mg/kg), a krv je sakupljena za koncentraciju biohemijskih parametara i metabolomsku studiju. Zatim su uzorci krvi centrifugirani na 3000 rpm tokom 10 minuta, a uzorci seruma su odvojeni i pohranjeni na -80 stepeni do analize. Desni bubreg je uklonjen jednim komadom fiksiranim sa 10 posto neutralnog puferovanog formalina za histološki pregled. Thebubrežnikorteks je izolovan od drugog dela i zamrznut u tečnom azotu za Western blotting.
Cistanche za liječenje zatajenja bubrega
2.4|Ćelijska kultura i tretman
Ljudska RTEC linija HK{{0}} je dobijena od Nanjing Keygen Biotechnology Development Co., Ltd. Kompletan medij je bio DMEM sa niskim sadržajem glukoze sa 10 posto FBS i 1 posto otopinom penicilin-streptomicina. HK-2 ćelije su uzgajane na 37 stepeni, 5 posto CO2 i zasićenoj vlažnosti. Ćelije su subkulturirane na 80 posto konfluencije, koje je uklonjeno iz inkubatora, a originalni medij u posudi je odbačen. Ćelije su isprane upotrebom 0,5 ml fiziološkog rastvora fosfatnog pufera (PBS) i digestirane tretmanom sa 0,5 ml tripsina tokom 1-2 minuta na 37 stepeni. Digestija je prekinuta upotrebom 2 ml DMEM medijuma, a ćelijska suspenzija je zatim centrifugirana na 450g 5 minuta na 4C. Supernatant je odbačen i ćelije su resuspendovane u 2 ml odgovarajućeg DMEM medijuma da bi se dobila jednoćelijska suspenzija. Ćelije su posađene u različite posude/mikroploče na različitim gustinama za naknadno eksperimentisanje, kao što je opisano u nastavku. HK-2 ćelije su postavljene na 96-jažice i posude, prethodno tretirane sa DMEM niske glukoze (5 mmol/L), inkubirane na 37C i 5% CO26 sati, a zatim su sinhronizovani. Eksperimentalne grupe su podijeljene na sljedeći način: kontrolna grupa (C), bez faktora intervencije; model grupa (M), u kojoj su ćelije uzgajane u rastvoru DMEM sa visokim sadržajem glukoze (30 mmol/L); grupa za kontrolu osmotskog pritiska (DMEM plus 24,5 mmol/L manitola, GLC); irbesartan grupa (25 mmol/L) iacteoside(MRHTG) grupa sa pet doza (5, 10, 25, 50 i 100 μmol/L), respektivno.
2.5|Morfologija ćelije
HK-2 ćelije su dva puta isprane sa PBS i pregledane pod invertovanim mikroskopom (OLYMPUS IX51). Morfologija ćelija je posmatrana pod 100 uvećanja.
2.6|Mjerenje biohemijskih indikatora
Terapijska efikasnostacteosidena db/db miševima je procenjen nivo mALB u urinu i FBG, INS, T-CHO, TG, Scr, GOT, GPT i BUN u serumu, koji su detektovani praćeni opisom koji je dao proizvođač kompleta.
2.7|Patološka analiza
Diobubrežnikorteksa je rađeno za bojenje hematoksilin-eozinom (HE) i periodičnom kiselinom-Schiffom (PAS) kako bi se uočile patološke promjene ububrežnog tkiva, stupnjevi hiperplazije tkiva fibroze, strukture glomerula i tubula kroz elektronski mikroskop (400). Kada snimate fotografiju, pokušajte da ispunite cijelo vidno poljebubrežnog tkivakako biste osigurali da je pozadinsko svjetlo na svakoj fotografiji isto. Softver Image-Pro Plus 6.0 je korišten za odabir iste crveno-ljubičaste boje kao jedinstvenog kriterija za procjenu pozitivnosti svih fotografija. Akumulirana optička gustina (IOD) pozitivne ekspresije bazalne membrane i površina piksela glomerularnog vaskularnog pleksusa (AREA) dobijeni su analizom svake fotografije, a izračunata je prosečna optička gustina (IOD/AREA).
2.8|Western blotting
Bubrežno tkivoa ćelije su ekstrahovane puferom za lizu; lizati su centrifugirani. Nakon potpune pirolize, centrifugirajte 5 minuta na 12000 o/min, uzmite supernatant i supernatant je sakupljen. Za određivanje koncentracije proteina korišten je komplet za koncentraciju proteina bicinhoninske kiseline (BCA). Nakon kvantifikacije, protein je razdvojen sa 10% SDS-PAGE, prebačen na PVDF membrane, zatim blokiran u 5% BSA u TBST, i inkubiran sa primarnim antitelima praćenim odgovarajućim sekundarnim antitelima. Reaktivnost antitijela je zatim otkrivena pomoću ECL-a i kvantificirana pomoću softvera ImageJ.Bubrežna tkivauzorci su analizirani Western blottingom za detekciju nivoa ekspresije -SMA, TGF- 1 (1:1300), Smad2 (1:3000), Smad3 (1:1000), P-Smad2/3 (1:500 ), Smad4 (1:1000) i Smad7 (1:1000) protein.
2.9|ELISA analiza
Izlučivanje proteina hemoatraktanta monocita -1 (MCP-1), interleukina -1 (IL-1), faktora tumorske nekroze- (TNF-) i interleukina-6 (IL -6) u supernatantu svake ćelije izmjereni su ELISA kompletom.
2.10|PCR u realnom vremenu
Štaviše, ove ćelije su pripremljene za PCR u realnom vremenu kako bi se ispitali nivoi ekspresije NOX1, NOX2, NOX4, -SMA, E-kadherina, NF-κB p65, TGF- 1, Smad2, Smad3, Smad4 i Smad7 mRNA. Prikupljene su ćelije u svakoj grupi (oko 1 107 ćelija). Ukupna RNK ekstrahirana je Trizolovom metodom u jednom koraku, te je određena njena čistoća i koncentracija. Sa GAPDH kao internom referencom, sekvenca prajmera je bila sledeća. TGF- 1, čulni početni: 5-ACACATCAGAGCTCCGAGAA-3, antisens početnik: 5-GAGGTATC GCCAGGAATTGT-3; E-kadherin, čulni početnik: 5- ACGCATTGCCA CATACACTC-3, antisense prajmer: 5-GGTGAATTCGGGCTTGTTGT-3; NF-κB p65, čulni prajmer: 5-CTTCCTGCCCTACAGAGGTC-3, antisense prajmer: 5-AGAGCAAGGAAGTCCCAGAC-3;NOX1, čulni prajmer: 5-CCTAGAAGGGCTCCAAACCA{{33} }, antisense prajmer: 5-GGAAGGCATCCACAAAACAGG-3; NOX2, senzorni prajmer: 5-ACCCTTCGCATCCATTCTCA-3, antisens prajmer: 5-TCTGCAAACCACTCAAAGGC-3; NOX4, senzorni prajmer: 5-CAAGCAGGAGAACCAGGAGA-3, antisens prajmer: 5-AGTTGAGGGCATTCACCAGA-3; Smad2, prajmer smisla: 5-TGAGCACGTGAGGTGAGATT-3, antisense prajmer: 5-CTCCATCACAGTGCACCAAG-3; Smad3, prajmer smisla: 5-CAGCCGGTTTGGATTACAGG-3, antisense prajmer: 5-GAGTCAAAGTCCCCTGCTCCT-3; Smad4, prajmer smisla: 5-CACTGCCAACTTTCCCAACA-3, antisense prajmer: 5-ATCCATTCTGCTGCTGTCCT-3; Smad7, prajmer smisla: 5-AAGAGTCAGCTGGTGCAGAA-3, antisense prajmer: 5-GCGGACTTGATGAAGATGGG-3; -SMA, prajmer čula: 5-GGTGCTGTCTCTCTATGCCT-3, antisense prajmer: 5-CAGATCCAGACGCATGATGG-3; GAPDH, prajmer čula: 5-TGGTATCGTGGAAGGACTCA-3, antisense prajmer: 5-CCAGTAGAGGCAGGGATGAT-3.
2.11|Statistička analiza
Podaci i statistička analiza usklađeni su sa preporukama za dizajn i analizu eksperimenata u farmakologiji. Svi eksperimenti su bili randomizirani i zaslijepljeni. Rezultati su izraženi kao M ± SD/SEM naznačenog broja (n) nezavisnih eksperimenata. Podaci u trenutnoj studiji predstavljeni su kao M ± SD/SEM iz najmanje tri nezavisna eksperimenta. Značajnost razlika analizirana je jednosmjernom ANOVA-om praćenom Tukeyjevim testom (više od dvije grupe) ili Studentovim t-testom (dvije grupe). Post hoc testovi se izvode samo kada je F postigao p < .05="" i="" nije="" bilo="" značajne="" nehomogenosti="" varijanse.="" svi="" testovi="" su="" bili="" dvostrani,="" a="" p="">< .05="" se="" smatralo="" statistički="" značajnim.="" statistička="" analiza="" je="" izvršena="" korišćenjem="" softvera="" graphpad="" prism="">
Cistanche acteoside za poboljšanje rada bubrega
2.12|UPLC-QTOF/MS uslovi i analiza podataka
Svi uzorci seruma su odmrznuti na sobnoj temperaturi prije pripreme. 300 ul acetonitrila je dodat u 100 ul uzoraka seruma na istaloženi protein i snažno miješan 60 s. Svi uzorci su centrifugirani na 13000 rpm tokom 10 minuta na 4 stepena. Konačno, supernatant je ubrizgan u UPLC-QTOF/MS analizu. Odvajanje metabolita je izvedeno korišćenjem Waters Acquity™ Ultra Performance LC sistema (Waters) opremljenog Waters Xevo™ G2 Q/TOF-MS (Waters MS Technologies). Alikvot od 2 ul rastvora uzorka je ubrizgan na Acquity UPLC BEH C18 (100 mm 2,1 mm, 1,7 μm, Waters Corporation, Milford, Connecticut) na 35 stepeni i brzina protoka je bila 0,4 ml/min. Optimalna mobilna faza se sastojala od vode (A) (koja sadrži 0,1 posto mravlje kiseline) i acetonitrila (B). Optimizirani UPLC uslovi eluiranja za analizu seruma bili su 0 3 min, 95 posto 55 posto A; 4 13 min, 55 posto 5 posto A; 13 14 min, 5 posto A. Autosampler je održavan na 4 stepena.
Masena spektrometrija je izvedena pomoću Xevo™ G2 QTof (Waters MS Technologies), kvadrupola i ortogonalnog tandemskog masenog trometra za vrijeme leta. Leucin-enkefalin je korišten kao zaporna masa koja stvara [M plus H]plusion (m/z 556.2771) i [MH]-jon (m/z 554.2615) u pozitivnom i negativnom modu, respektivno. Koncentracija leucin-enkefalina bila je 200 pg/ml, a brzina protoka infuzije bila je 100 ul/min kako bi se osigurala tačnost tokom MS analize putem špriceve pumpe. Podaci su prikupljeni u centroid modu od 100 do 1,000 m/z. I za pozitivne i za negativne modove elektrosprej, napon kapilare i konusa je postavljen na 3,0 kV i 30 V, respektivno. Gas za desolvataciju je podešen na 600 L/h na temperaturi od 350 stepeni, konusni gas na 50 L/h, a temperatura izvora je postavljena na 120 stepeni. Brzina prikupljanja podataka postavljena je na 30 ms, sa kašnjenjem između skeniranja od 0,02 s.
Osim toga, 10 uzoraka seruma je nasumično odabrano iz svake grupe i pomiješano kao uzorci za kontrolu kvalitete (QC), respektivno. QC uzorak je korišten za optimizaciju stanja UPLCQTOF/MS, jer je sadržavao većinu informacija o cijelom uzorku. QC uzorci su ubrizgani šest puta na početku rada kako bi se kondicionirao ili uravnotežio sistem, a zatim svakih 10 uzoraka kako bi se dalje pratila stabilnost analize. Svaki dan, nakon kalibracije instrumenta, prvo je analiziran QC uzorak kako bi se testirala stabilnost instrumenta kako bi se osigurala konzistentna performansa sistema.
Sva prikupljanja i analize podataka kontrolisani su softverom Waters MassLynx v4.1. Multivarijantna matrica podataka je analizirana pomoću EZinfo softvera 2.0 (Waters Corp.). Glavni parametri uključuju raspon vremena zadržavanja 0 14 min; omjer mase m/z 100 1,000, raspon tolerancije mase 0.{{10}}1 Da, prag vršnog intenziteta 50, prozor kvaliteta 0,05 Da, zadržavanje vremenski prozori 0,20 min, i automatska detekcija 5% visine vrha i buke. Intenzitet svakog jona je normalizovan u odnosu na ukupan broj jona da bi se generisala matrica podataka koja se sastojala od vremena zadržavanja, m/z vrednosti i normalizovane površine pika.
Rezultirajuće matrice podataka uvedene su u softver EZinfo 2.0 za analizu glavnih komponenti, parcijalnu diskriminantnu analizu najmanjih kvadrata (PLS-DA) i analizu ortogonalne projekcije na latentne strukture (OPLS-DA). Iz OPLS-DA, različiti metaboliti su mogli biti identificirani kao odgovorni za razdvajanje između kontrolne grupe i grupe modela i stoga su smatrani potencijalnim markerima. Potencijalni markeri od interesa su ekstrahovani iz S-grafikona konstruisanih nakon analize sa OPLS-DA, a varijable koje su imale značajan doprinos diskriminaciji između grupa podvrgnute su daljoj identifikaciji molekularne formule.
Važnost varijable (VIP) u vrijednosti projekcije je ponderisani zbir kvadrata PLS težina, a smatralo se da su varijable sa VIP > 1 uticajne za razdvajanje uzoraka u skorovnim grafikonima generisanim iz OPLS-DA analize. U svim eksperimentima, nivo pouzdanosti je postavljen na 95 posto kako bi se odredila značajnost razlike (p < .05).="" te="" varijable="" su="" na="" kraju="" odabrane="" kao="" potencijalni="" biomarkeri.="" plodovi="" pls-da="" rezultata="" su="" opisani="" parametrom="" unakrsne="" validacije="" r2y="" i="" q2,="" koji="" predstavlja="" ukupnu="" objašnjenu="" varijaciju="" za="" x="" matricu="" i="" predvidljivost="" modela,="" respektivno.="" odlični="" modeli="" se="" dobijaju="" kada="" su="" kumulativne="" vrednosti="" r2y="" i="" q2="" iznad="" 0,8.="" relativna="" rastojanja="" između="" administriranih="" grupa="" i="" kontrolne="" grupe="" iz="" pls-da="" skora="" su="" izračunate="" sa="" prosečnom="" vrednošću="" (x-osa="" i="" y-osa)="" svih="" uzoraka="" kontrolne="" grupe="" kao="" referentnom="">
Odabrani potencijalni metaboliti su identifikovani prema određivanju tačnog m/z, retencionog vremena i tipičnog MS/MS fragmenta i uzorka potencijalnih biomarkera iznad, koji su dobijeni u modovima pozitivnih i negativnih jona. Izgradnja metaboličkog puta izvedena je sa Metabo Analystom, koji je web-bazirani alat za vizualizaciju metabolomike (https://www.metaboanalyst.ca/) zasnovan na izvorima baze podataka uključujući KEGG (HTTP:// www.genome .jp/kegg/) i HMDB (http://www.hmdb. ca/) baze podataka za pretraživanje. Vrijeme zadržavanja i tipični MS/MS fragment i uzorak imali su veliku korist za sužavanje raspona mogućih molekula.
Acteoside u Cistancheu može poboljšati funkciju bubrega
3|REZULTATI
Kliknite ovdje za informacije o dijelu II (rezultati) ovog članka.
Izvod iz: ' Prirodni proizvod odacteosidepoboljšatipovreda bubregakod dijabetesa db/db miševa i HK-2 ćelija putem regulacije NADPH/oksidaze-TGF-/Smad signalnog puta' -----, Qinwen Wang|Xinxin Dai et.al
----Istraživanje o fitoterapiji. 2021;35:5227–5240. wileyonlinelibrary.com/journal/ptr © 2021 John Wiley & Sons Ltd. DOI: 10.1002/ptr.7196
