Abstract

Cilj:
Istražiti učinke akteozida na aktivnost osteoblasta i osteoklasta kod miševa s ovariektomijom (OVX).

Metode:
Mišji model osteoporoze u postmenopauzi uspostavljen je ovariektomijom (OVX). Pedeset miševa C57BL/6 nasumično je podeljeno u pet grupa: lažno operisana grupa, grupa modela, grupa estrogena, grupa sa niskim dozama akteozida i grupa sa visokim dozama akteozida, sa 10 miševa u svakoj grupi.

Zabilježena je tjelesna težina. Histomorfometrijska analiza kosti urađena je mikro-kompjuterskom tomografijom (mikro-CT). Nivoi estradiola (E2), CTX-1, PINP i ALP u serumu su mjereni korištenjem odgovarajućih kompleta za analizu. Zabilježena je težina materice. TRAP bojenje je korišteno za promatranje broja osteoklasta. Imunohistohemija je korištena za otkrivanje ekspresije Runx2 proteina. Kvantitativna RT-PCR (qRT-PCR) i Western blot analiza u realnom vremenu korišteni su za procjenu ekspresije markera vezanih za formiranje kosti i resorpciju kosti.

Rezultati:
U poređenju sa lažno operiranom grupom, miševi u grupi modela pokazali su značajno povećanu tjelesnu težinu, značajno smanjenu težinu materice i nivoe E2, PINP i ALP u serumu, te značajno povećane nivoe CTX-1 u serumu. Koštani parametri uključujući BMD, BV/TV, Tb.N, Tb.Th, PINP, ALP, Runx2, OCN i Col1 su značajno smanjeni, dok je Tb.Sp značajno povećan. U femoralnom tkivu ekspresija mRNA ALP, OCN i Col1 je značajno smanjena, dok je ekspresija mRNA NFATc1 i c-fos, kao i ekspresija Runx2, p-IκB i p-Akt proteina značajno povećana (P<0.05P < 0.05P<0.05). The number of osteoclasts was also increased.

U poređenju sa modelnom grupom, sve grupe na tretmanu su pokazale značajno smanjenu tjelesnu težinu, značajno povećane serumske nivoe PINP i ALP i značajno smanjene nivoe CTX-1 u serumu. BMD, BV/TV, Tb.N, Tb.Th, PINP, ALP, Runx2, OCN i Col1 su značajno povećani, dok je Tb.Sp značajno smanjen. U femoralnom tkivu ekspresija mRNA ALP, OCN i Col1 je značajno povećana, dok je ekspresija mRNA NFATc1 i c-fos, kao i ekspresija Runx2, p-IκB i p-Akt proteina značajno smanjena (P<0.05P < 0.05P<0.05). The number of osteoclasts was reduced.

zaključak:
Acteoside ima dvostruki regulatorni efekat na remodeliranje kosti kod OVX miševa. Može poboljšati gubitak kosti izazvan OVX inhibiranjem resorpcije kosti posredovane osteoklastima kroz supresiju NF-κB/Akt/NFATc1/c-fos puta, dok promoviše formiranje kosti vođeno osteoblastom kroz aktivaciju Runx2/OCN/Col1 ose.

Ključne riječi:
Acteoside; postmenopauzalna osteoporoza; osteoblasti; osteoklasti

Šta je osteoporoza?

Osteoporoza (OP) je uobičajena i često tiha bolest skeleta koju karakterizira smanjena mineralna gustoća kostiju, propadanje mikrostrukture kostiju, povećana krhkost kostiju i veći rizik od prijeloma. Globalno, približno 18,3% stanovništva je pogođeno, a posebno su ranjive žene u postmenopauzi. Ovo stanje je poznato kao postmenopauzalna osteoporoza (PMOP) [1].

Estrogen igra ključnu regulatornu ulogu u remodeliranju kosti kroz više mehanizama. Tokom remodeliranja kostiju, osteoklasti i osteoblasti održavaju dinamičku ravnotežu između resorpcije kosti i formiranja kosti. Kada aktivnost osteoblasta opadne i/ili aktivnost osteoklasta postane pretjerana, ova ravnoteža se poremeti, što dovodi do ozbiljnog gubitka koštanog matriksa [2].

Stoga, regulacija funkcije i formiranja osteoblasta i osteoklasta može biti efikasna strategija za liječenje osteoporoze povezane s nedostatkom estrogena.

Zašto tražiti biljne spojeve za osteoporozu?

Trenutni glavni lijekovi za osteoporozu uključuju bisfosfonate, teriparatid, raloksifen i selektivne modulatore estrogenskih receptora. Ovi lijekovi mogu biti efikasni, ali također mogu uzrokovati štetne efekte kao što su gastrointestinalna nelagoda i, u rijetkim slučajevima, osteonekroza vilice. Ove zabrinutosti mogu ograničiti dugotrajnu upotrebu.

Posljednjih godina sve se više pažnje usmjerava na tradicionalnu biljnu medicinu za podršku zdravlju kostiju, posebno kod postmenopauzalne osteoporoze.

Korijen remanije, tradicionalna kineska biljka, poznata je po tome što hrani bubrege i potiče cirkulaciju krvi. Često se koristi u biljnim formulama za osteoporozu [3]. Nekoliko kliničkih studija izvijestilo je da kineske biljne formule koje sadrže Rehmannia mogu pomoći u poboljšanju mineralne gustoće kostiju, ublažavanju bolova i poboljšanju kliničkih simptoma kod pacijenata s osteoporozom [4].

Acteoside je feniletanoidni glikozid rastvorljiv u vodi koji se nalazi u Rehmannia, Cistanche, Plantago sjemenu i drugim ljekovitim biljkama. Prijavljeno je da posjeduje antioksidativno, protuupalno, antidijabetičko djelovanje i djelovanje koje potiče stvaranje kosti [5].

Studija zasnovana na sistematskom pregledu i prikupljanju podataka iz više baza podataka sugerira da akteozid može biti jedna od ključnih aktivnih komponenti u kineskim biljnim formulama za postmenopauzalnu osteoporozu [6]. Mrežne farmakološke studije su također pokazale da akteozid može biti ključni aktivni sastojak u biljnim formulama kao što su Qigu kapsule i Zuogui/Yougui pilule za liječenje postmenopauzalne osteoporoze [7,8].

Ovi nalazi sugeriraju da akteozid može biti obećavajuće prirodno jedinjenje za zdravlje kostiju. Međutim, njegov precizan mehanizam djelovanja još nije u potpunosti razjašnjen.

Ova studija je osmišljena da istraži efekte akteozida na aktivnost osteoblasta i osteoklasta u mišjem modelu sa ovarijektomijom, s ciljem da se pruži naučna osnova za dalji razvoj akteozida u istraživanjima vezanim za osteoporozu.

 

1. Materijali i instrumenti

1.1 Eksperimentalne životinje

Pedeset ženki miševa C57BL/6 stare 6 sedmica SPF klase kupljeno je od Hebei centra za eksperimentalne životinje, broj licence SCXK (Hebei) 2022-001. Miševi su težili 20-23 g.

Svi miševi su održavani u 12-satnom ciklusu svjetlo/mrak, sa sobnom temperaturom kontroliranom na 22±3∘C22 \\pm 3^\\circ C22±3∘C, vlažnošću na 55±5%55 \\pm 5\\%55±5%, i obezbijeđenom odgovarajućom hranom i vodom. Nakon jedne sedmice adaptivnog hranjenja, eksperiment je sproveden.

1.2 Lijekovi i reagensi

Acteoside, sa čistoćom od 98% i brojem serije CFN97048, kupljen je od Wuhan ChemFaces.

Tablete estradiol valerata, specifikacija 1 mg × 21 tableta, kupljene su od Bayer Healthcare Co., Ltd., Guangzhou.

Kompleti za analizu estradiola u serumu miša (E2), alkalne fosfataze (ALP), kolagena umreženi C-terminalni telopeptid (CTX-1) i prokolagen tipa I N-terminalnog propeptida (PINP) kupljeni su od Beyotime Biotechnology, Šangaj.

RIPA pufer za lizu je nabavljen od Sigme, SAD. Bio-Rad DC Protein Assay Kit je nabavljen od Bio-Rad Laboratories, SAD. Anti-fosfo-Akt, anti-Akt, anti-fosfo-IκB i anti-IκB antitela su kupljena od Cell Signaling Technology, SAD. Anti-Runt-related transkripcioni faktor 2 (Runx2) antitijelo je kupljeno od Santa Cruz Biotechnology, SAD. Komplet za bojenje TRAP kupljen je od Sigme, SAD. TRIzol reagens i RevertAid First Strand cDNA Synthesis Kit kupljeni su od Thermo Fisher Scientific-a, SAD.

1.3 Glavni instrumenti

Glavni korišteni instrumenti su:

SKYSCAN 1276 mikro-kompjuterski tomografski skener, Bruker Technology, Peking

SpectraMax M čitač mikroploča, Molecular Devices, Šangaj

FA2004N elektronska analitička vaga, Sailun Instruments, Peking

WMP-6105 optički mikroskop, Wumo Optical Instruments, Šangaj

VeritiPro kvantitativni PCR sistem u realnom vremenu i aparat za elektroforezu PowerEase, Thermo Fisher Scientific, Šangaj

 

2. Metode

2.1 Uspostavljanje modela i grupisanje

C57BL/6 miševi su nasumično podijeljeni u pet grupa:

Lažno upravljana grupa

Grupa modela

Estrogenska grupa, 1 mg/kg1 \\text{ mg/kg}1 mg/kg

Grupa sa niskim dozama akteozida, 50 mg/kg50 \\text{ mg/kg}50 mg/kg

Grupa sa visokim dozama akteozida, 150 mg/kg150 \\text{ mg/kg}150 mg/kg

Svaka grupa je sadržavala 10 miševa.

Sve životinje su anestezirane sa 2% natrijum pentobarbitala. Napravljen je mali rez kako bi se otkrili jajnici. Jajnici su nježno locirani i uklonjeni kako bi se uspostavio OVX model. U grupi koja je lažno operisana, uklonjeno je samo masno tkivo u blizini jajnika.

Nakon operacije, svi miševi su primali intramuskularni penicilin u dozi od 50.000 U/dan 3 uzastopna dana.

nakon operacije:

Grupa estrogena primala je estradiol valerat u dozi od 1 mg/kg1 \\text{ mg/kg}1 mg/kg putem sonde jednom dnevno.

Grupe sa niskim i visokim dozama akteozida primale su akteozid putem sonde jednom dnevno.

Grupe koje su bile lažno upravljane i modelirane su dobile prečišćenu vodu u količini od 10 mg/kg10 \\text{ mg/kg}10 mg/kg putem sonde.

Miševi su žrtvovani 4 nedelje nakon operacije. Prikupljeni su uzorci femoralnog tkiva i krvi. Femuri su fiksirani u 4% paraformaldehidu 48 sati i procijenjeni mikro-CT.

2.2 Micro-CT detekcija

Lijeva butna kost svakog miša je skenirana mikro-CT-om visoke rezolucije. Parametri skeniranja su bili:

Napon: 50 kV

Struja: 55 μA

Izotropna rezolucija: 6 μm

Skeniranje femura izvedeno je na 2 mm proksimalno od ploče rasta, sa 720 sekcija skeniranih svaki put.

Mikro-CT podaci su analizirani pomoću softvera INFINITT-Xelis. Procijenjeni strukturni parametri uključivali su:

Mineralna gustina kostiju (BMD)

Volumen kosti/ukupni volumen (BV/TV)

Trabekularna debljina (Tb.Th)

Trabekularna separacija (Tb.Sp)

Trabekularni broj (Tb.N)

2.3 Biohemijski pokazatelji u krvi

Uzorci krvi su sakupljeni i centrifugirani na 1300 r/min 15 minuta na 4∘C4^\\circ C4∘C. ELISA setovi su korišteni za mjerenje nivoa u serumu:

CTX-1, marker resorpcije kosti

PINP, marker formiranja kostiju

ALP, marker formiranja kostiju

2.4 TRAP bojenje

Nakon fiksacije, bedrene kosti miša su dekalcificirane u EDTA 10 dana. Zatim su dehidrirani, ugrađeni u parafin i pripremljeni u sekcije od 6 μm.

Sekcije su podvrgnute ksilenskom deparavanju, rehidrataciji etanolom i TRAP bojenju. Nakon toga, sekcije su dehidrirane, očišćene i montirane.

2.5 Imunohistohemijsko (IHC) bojenje

Za Runx2 imunohistohemiju, preseci od 5 μm su izrezani pomoću mikrotoma, zatim devoskani i hidrirani.

Endogena peroksidaza je blokirana sa 0,3% vodikovog peroksida u PBS-u 30 minuta.

Da bi se smanjilo nespecifično bojenje, sekcije su inkubirane 1 sat u PBS-u koji sadrži 10% normalnog konjskog seruma i 0,1% Tritona X-100.

Sekcije su inkubirane preko noći na 4∘C4^\\circ C4∘C sa anti-Runx2 primarnim antitelom u razblaženju od 1:1,000.

Zatim su sekcije isprane PBS-om i inkubirane sa biotiniliranim zečjim anti-kozjim IgG u razrjeđenju 1:200 tokom 2 sata, nakon čega je uslijedila inkubacija sa kompleksom avidin-biotin-peroksidaza 1 sat.

Razvijanje boje antigena izvedeno je korištenjem otopine 3,3′-diaminobenzidin tetrahidroklorida koja sadrži 0,003% vodonik peroksida. Za bojenje je korišten rastvor hematoksilina.

2.6 Kvantitativni RT-PCR u realnom vremenu (qRT-PCR)

RNA je ekstrahirana upotrebom TRIzol reagensa. Količina RNK u svakom uzorku je normalizirana na 1 ug za sintezu cDNK.

cDNA je sintetizirana korištenjem RevertAid First Strand cDNA Synthesis Kit.

qRT-PCR je izveden korišćenjem Exicycler-96 kvantitativnog termalnog ciklusa u realnom vremenu.

Parametri pojačanja su bili:

Početna denaturacija na 95∘C95^\\circ C95∘C 5 minuta

40 ciklusa PCR u tri koraka:

Denaturacija na 95∘C95^\\circ C95∘C 1 minut

Žarenje na 60∘C60^\\circ C60∘C 30 sekundi

Završno produženje na 72∘C72^\\circ C72∘C 1 minut

Podaci su normalizirani korištenjem GAPDH i procijenjeni kao prosječne promjene puta. Relativna ekspresija gena izračunata je metodom 2−ΔΔCt2^{-\\Delta\\Delta Ct}2−ΔΔCt.

2.7 Western blot analiza

Ćelije su lizirane korištenjem RIPA pufera za lizu koji sadrži inhibitore proteaze i inhibitore fosfataze I i II.

Koncentracija proteina je određena korištenjem Bio-Rad DC Protein Assay Kit.

Jednake količine proteina, 20ug20 \\mug20ug po traci, nanesene su na 10% natrijum dodecil sulfat-poliakrilamid gel elektroforeze (SDS-PAGE) gelove i prebačene na Immobilon-P poliviniliden fluoridne membrane.

Membrane su blokirane sa 5% obranog mlijeka 1 sat, a zatim inkubirane preko noći na 4∘C4^\\circ C4∘C sa primarnim antitelima.

Nakon tri puta ispiranja sa Tris puferiranim fiziološkim rastvorom koji sadrži 0,1% Tween-20 (TBST), membrane su inkubirane sa sekundarnim antitelom konjugovanim protiv mišjeg ili anti-zečjeg IgG peroksidaze rena u razblaženju 1:3000 tokom 1 sata.

Proteini su vizualizirani hemiluminiscencijom korištenjem ECL kompleta.

2.8 Statistička analiza

Sva eksperimentalna ispitivanja obavljena su najmanje tri puta.

Poređenja među više grupa vršena su jednosmjernom analizom varijanse. Poređenja u paru između grupa vršena su korištenjem Tukeyjevog testa višestrukog poređenja.

Za statističku analizu korišten je softver SPSS 14.0. Vrijednost P<0.05P < 0.05P<0.05 was considered statistically significant.

 

3. Rezultati

3.1 Učinci akteozida na nivo E2 u serumu, težinu materice, tjelesnu težinu i indeks materice kod OVX osteoporotičnih miševa

Kao što je prikazano na slici 1, u poređenju sa lažno operisanom grupom, miševi u grupi modela imali su značajno niže nivoe E2 u serumu, težinu materice i indeks materice, dok je tjelesna težina bila značajno povećana (P<0.05P < 0.05P<0.05).

U poređenju sa modelnom grupom, miševi u svim tretiranim grupama pokazali su značajno smanjenu tjelesnu težinu (P<0.05P < 0.05P<0.05).

Slika 1. Učinci akteozida na nivo E₂ u serumu, težinu materice, tjelesnu težinu i indeks materice kod OVX osteoporotičnih miševa

A. Lažno upravljana grupa
B. Grupa modela
C. Estrogenska grupa
D. Grupa niskih doza akteozida
E. Grupa visokih doza akteozida

Napomena:
∗P<0.05*P < 0.05∗P<0.05 vs. sham-operated group;
#P < 0,05 u odnosu na grupu modela;
△P<0.05\triangle P < 0.05△P<0.05 vs. estrogen group;
▲P<0.05\blacktriangle P < 0.05▲P<0.05 vs. low-dose acteoside group.

 

3.2 Učinci akteozida na histomorfometrijske parametre kosti kod OVX osteoporotičnih miševa

Kao što je prikazano na slici 2, u poređenju sa lažno operiranom grupom, miševi u grupi modela pokazali su značajno smanjenu BMD, BV/TV, Tb.N i Tb.Th, dok je Tb.Sp značajno povećan (P<0.05P < 0.05P<0.05).

U poređenju sa modelnom grupom, sve tretirane grupe su pokazale značajno povećan BMD, BV/TV, Tb.N i Tb.Th, dok je Tb.Sp značajno smanjen (P<0.05P < 0.05P<0.05).

Slika 2. Učinci akteozida na histomorfometrijske parametre kosti kod OVX osteoporotičnih miševa

A. Lažno upravljana grupa
B. Grupa modela
C. Estrogenska grupa
D. Grupa niskih doza akteozida
E. Grupa visokih doza akteozida

Napomena:
∗P<0.05*P < 0.05∗P<0.05 vs. sham-operated group;
#P < 0,05 u odnosu na grupu modela;
△P<0.05\triangle P < 0.05△P<0.05 vs. estrogen group;
▲P<0.05\blacktriangle P < 0.05▲P<0.05 vs. low-dose acteoside group.

 

3.3 Učinci akteozida na pokazatelje povezane s metabolizmom kostiju u serumu kod OVX osteoporotičnih miševa

Kao što je prikazano na slici 3, u poređenju sa lažno operiranom grupom, miševi u grupi modela pokazali su značajno smanjene nivoe PINP i ALP u serumu, dok su nivoi CTX-1 značajno povećani (P<0.05P < 0.05P<0.05).

U poređenju sa modelnom grupom, sve grupe tretmana su pokazale značajno povećane nivoe PINP i ALP u serumu, dok su nivoi CTX-1 značajno smanjeni (P<0.05P < 0.05P<0.05).

Slika 3. Učinci akteozida na indikatore vezane za metabolizam kostiju u serumu kod OVX osteoporotičnih miševa

A. Lažno upravljana grupa
B. Grupa modela
C. Estrogenska grupa
D. Grupa niskih doza akteozida
E. Grupa visokih doza akteozida

Napomena:
∗P<0.05*P < 0.05∗P<0.05 vs. sham-operated group;
#P < 0,05 u odnosu na grupu modela;
△P<0.05\triangle P < 0.05△P<0.05 vs. estrogen group;
▲P<0.05\blacktriangle P < 0.05▲P<0.05 vs. low-dose acteoside group.

Slika 4. Učinci akteozida na broj osteoklasta u femuru OVX osteoporotičnih miševa (TRAP bojenje)

A. Lažno upravljana grupa
B. Grupa modela
C. Estrogenska grupa
D. Grupa niskih doza akteozida
E. Grupa visokih doza akteozida

Slika 5. Učinci akteozida na ekspresiju Runx2 proteina u femoralnom tkivu OVX osteoporotičnih miševa (IHC, ×400)

A. Lažno upravljana grupa
B. Grupa modela
C. Estrogenska grupa
D. Grupa niskih doza akteozida
E. Grupa visokih doza akteozida

Slika 6. Efekti akteozida na ekspresiju mRNA ALP, OCN, Col1, NFATc1 i c-fos u femoralnom tkivu OVX osteoporotičnih miševa

A. Lažno upravljana grupa
B. Grupa modela
C. Estrogenska grupa
D. Grupa niskih doza akteozida
E. Grupa visokih doza akteozida

Napomena:
∗P<0.05*P < 0.05∗P<0.05 vs. sham-operated group;
#P < 0,05 u odnosu na grupu modela;
△P<0.05\triangle P < 0.05△P<0.05 vs. estrogen group;
▲P<0.05\blacktriangle P < 0.05▲P<0.05 vs. low-dose acteoside group.

3.4 Učinci akteozida na broj osteoklasta u femoralnom tkivu OVX osteoporotičnih miševa

Kao što je prikazano na slici 4, u poređenju sa lažno operisanom grupom, broj TRAP-pozitivnih osteoklasta u grupi modela je povećan.

U poređenju sa modelnom grupom, broj TRAP-pozitivnih osteoklasta je smanjen u svim tretiranim grupama.

3.5 Učinci akteozida na ekspresiju Runx2 proteina u femoralnom tkivu OVX osteoporotičnih miševa

Kao što je prikazano na slici 5, u poređenju sa lažno operisanom grupom, pozitivna ekspresija Runx2 proteina u femoralnom tkivu smanjena je u modelnoj grupi.

U poređenju sa modelnom grupom, ekspresija Runx2 proteina u femoralnom tkivu povećana je u svim tretiranim grupama.

3.6 Efekti akteozida na ekspresiju mRNA ALP, OCN, Col1, NFATc1 i c-fos u femoralnom tkivu OVX osteoporotičnih miševa

Kao što je prikazano na slici 6, u poređenju sa lažno operiranom grupom, ekspresija mRNA femura ALP, OCN i Col1 je značajno smanjena u modelnoj grupi, dok je ekspresija NFATc1 i c-fos mRNA značajno povećana (P<0.05P < 0.05P<0.05).

U poređenju sa modelnom grupom, sve tretirane grupe pokazale su značajno povećanu ekspresiju mRNA ALP, OCN i Col1, dok je ekspresija mRNA NFATc1 i c-fos značajno smanjena (P<0.05P < 0.05P<0.05).

 

Slika 7. Učinci akteozida na ekspresiju p-IκB i p-Akt proteina u femoralnom tkivu OVX osteoporotičnih miševa

A. Lažno upravljana grupa
B. Grupa modela
C. Estrogenska grupa
D. Grupa niskih doza akteozida
E. Grupa visokih doza akteozida

Napomena:
∗P<0.05*P < 0.05∗P<0.05 vs. sham-operated group;
#P < 0,05 u odnosu na grupu modela;
△P<0.05\triangle P < 0.05△P<0.05 vs. estrogen group;
▲P<0.05\blacktriangle P < 0.05▲P<0.05 vs. low-dose acteoside group.

 

4. Diskusija

Osteoporoza je uobičajena metabolička bolest kostiju koju karakterizira smanjena mineralna gustoća kostiju, uništavanje mikrostrukture kostiju, povećana krhkost kostiju i povećan rizik od prijeloma.

Otprilike 200 miliona ljudi širom svijeta boluje od osteoporoze. Sa starenjem stanovništva, njegova visoka učestalost i smrtnost predstavljaju težak teret za društvo.

Postmenopauzalna osteoporoza je uglavnom uzrokovana nedostatkom estrogena i najčešći je tip osteoporoze. Njegove tipične karakteristike uključuju smanjenje nivoa estrogena i kontinuirani gubitak kalcijuma sa starenjem.

Patološki mehanizam osteoporoze karakterizira smanjena koštana masa i destrukcija trabekularne mikrostrukture. Ovo je direktno rezultat neravnoteže između formiranja osteoklasta i formiranja osteoblasta [9].

S obzirom na važan utjecaj nedostatka estrogena na osteoporozu, ova studija je koristila mišji model izazvan ovariektomijom za procjenu anti-osteoporotskih efekata akteozida.

Prvo, ova studija je potvrdila da je OVX uzrokovao nedostatak estrogena, atrofiju materice i gubitak koštane mase kod miševa, dok je egzogena suplementacija E2 poboljšala atrofiju materice i gubitak kosti kod OVX miševa.

Osim toga, ova studija je otkrila da akteozid nije promijenio nivoe E2 u serumu ili težinu materice kod OVX miševa, ali je značajno poboljšao mineralnu gustinu kostiju i mikrostrukturu kostiju, čime je poboljšao gubitak koštane mase.

Ovo se odrazilo na povećanu BMD femura, BV/TV, Tb.N i Tb.Th, kao i na smanjenje Tb.Sp.

Među ovim parametrima:

BMD efikasno procenjuje stepen gubitka koštane mase.

BV/TV odražava spužvastu koštanu masu.

Tb.N, Tb.Sp i Tb.Th se uglavnom koriste za procjenu prostorne morfologije trabekularne kosti [10].

 

Kako Acteoside može podržati remodeliranje kostiju

Neravnoteža između formiranja kostiju i resorpcije kosti smatra se glavnim mehanizmom osteoporoze.

Trenutne terapije osteoporoze uglavnom uključuju:

Antiresorptivni lijekovi, kao što su bisfosfonati, koji inhibiraju aktivnost osteoklasta

Anabolički agensi, kao što je paratiroidni hormon, koji potiču funkciju osteoblasta

Iako ovi lijekovi imaju jasne prednosti za zdravlje kostiju, oni također mogu biti povezani s nuspojavama, uključujući mučninu, povraćanje, bol u trbuhu i povećane rizike povezane s rakom dojke i endometrijuma [11].

Idealna strategija za osteoporozu bila bi spoj s dvostrukom regulacijskom aktivnošću i manje nuspojava: onaj koji može inhibirati diferencijaciju osteoklasta dok istovremeno povećava aktivnost osteoblasta.

Ova studija je otkrila da akteozid smanjuje nivoe CTX-1 u serumu i povećava nivoe PINP i ALP u serumu.

Serumski ALP i PINP su markeri formiranja kosti, dok je CTX-I marker resorpcije kosti [12].

Ovi rezultati sugeriraju da akteozid može regulirati metabolizam kostiju kod OVX miševa promicanjem formiranja kosti i inhibiranjem resorpcije kostiju, pokazujući potencijalni dvostruki regulatorni učinak na koštani promet.

 

Acteoside može pomoći u smanjenju resorpcije kostiju posredovane osteoklastima

Histološka analiza je pokazala da tretman akteozidom smanjuje broj TRAP-pozitivnih ćelija, odnosno osteoklasta, u trabekularnoj kosti u blizini femoralne ploče za rast OVX miševa.

Ovo sugerira da akteozid može inhibirati OVX-indukovanu aktivaciju osteoklasta.

U mikrookruženju kostiju, osteoklasti su specijalizirani makrofagi s više jezgri nastali diferencijacijom monocita izazvanom RANKL-om i faktorom koji stimulira kolonije makrofaga.

RANKL-inducirana signalna kaskada igra ključnu ulogu u regulaciji aktivnosti osteoklasta. Nakon što se RANKL veže za svoj receptor RANK, on ​​regrutuje faktor 6 povezan sa TNF receptorom, koji dalje aktivira nizvodni NF-κB put.

U klasičnom NF-κB putu, IκB se vezuje za NF-κB i sprečava njegovu nuklearnu translokaciju. Tokom diferencijacije osteoklasta, IκB se fosforilira i razgrađuje, što rezultira aktivacijom NF-κB puta.

Osim toga, Akt igra važnu ulogu u diferencijaciji osteoklasta [13]. Stimulacija RANKL i M-CSF može aktivirati Akt, koji promovira nuklearnu lokalizaciju NFATc1 kroz fosforilaciju kinaze glikogen sintaze 3, čime se indukuje formiranje osteoklasta.

Aktivacija NF-κB i Akt pokreće ekspresiju ključnih faktora diferencijacije osteoklasta c-fos i NFATc1. Ova dva ključna regulatora utiču na diferencijaciju prekursora osteoklasta u zrele osteoklaste regulacijom ekspresije gena specifičnih za osteoklaste.

Ova studija je otkrila da tretman akteozidom inhibira degradaciju IκB u femoralnom tkivu OVX miševa, čime blokira aktivaciju NF-κB puta. Takođe je specifično smanjio Akt fosforilaciju i inhibirao ekspresiju proteina c-fos i NFATc1.

Ovi rezultati pokazuju da akteozid može inhibirati diferencijaciju osteoklasta i spriječiti resorpciju kosti izazvanu OVX blokiranjem NF-κB i Akt puteva i smanjenjem ekspresije NFATc1 i c-fos.

 

Acteoside može promovirati formiranje kostiju uzrokovano osteoblastom

Runx2 je ključni faktor transkripcije u formiranju kostiju. Ekspresira se samo u osteoblastima i mineraliziranim tkivima i igra važnu ulogu u diferencijaciji osteoblasta indukcijom ključnih markerskih gena specifičnih za osteoblast, uključujući ALP, OCN i Col1 [14].

među ovim:

ALP je rani fenotipski marker diferencijacije osteoblasta. Njegova aktivnost odražava početnu fazu diferencijacije osteoblasta i igra važnu ulogu u mineralizaciji kosti inicirajući i/ili promovirajući formiranje kristala hidroksiapatita u vezikulama matriksa osteoblasta.

OCN i Col1 se eksprimiraju u kasnijim fazama diferencijacije osteoblasta, prateći inicijaciju mineralizacije ekstracelularnog matriksa [15].

Kroz imunohistohemijsku analizu, ova studija je otkrila da akteozid povećava ekspresiju proteina osteogenog markera Runx2 u femoralnom tkivu, sugerirajući da može promovirati formiranje kostiju kod OVX miševa.

Istovremeno, u femoralnom tkivu OVX miševa uočena je niska regulacija markerskih gena specifičnih za osteoblast ALP, OCN i Col1, dok je tretman akteozidom djelomično preokrenuo OVX-indukovanu supresiju transkripcije gena specifičnog za osteoblast.

Ovi rezultati sugeriraju da akteozid može promovirati osteogenezu poboljšavajući i ranu i kasnu fazu diferencijacije osteoblasta, čime podržava diferencijaciju osteoblasta i taloženje minerala.

 

Šta ovo znači za ljude zainteresovane za biljnu podršku za osteoporozu

Za ljude koji traže biljne ili prirodne pristupe za podršku zdravlju kostiju, ova studija nudi značajan naučni smjer.

Acteoside nije samo "dodatak kalcijuma". Umjesto toga, ovo istraživanje sugerira da može djelovati dublje pomažući u regulaciji ravnoteže između dvije važne vrste koštanih stanica:

Osteoblasti, koji grade kost

Osteoklasti, koji razgrađuju kost

Zdrave kosti zavise od ravnoteže između ova dva procesa. Kod postmenopauzalne osteoporoze, resorpcija kosti često postaje jača od formiranja kostiju, što dovodi do postepenog gubitka koštane mase.

Prema ovoj studiji na miševima, akteozid može pomoći u obnavljanju ove ravnoteže:

Podržava formiranje kostiju povezano sa osteoblastom

Smanjenje resorpcije kostiju povezane s osteoklastima

Poboljšanje mineralne gustine kostiju i trabekularne strukture kostiju

Reguliranje ključnih molekularnih puteva povezanih s remodeliranjem kostiju

Za kupce zainteresovane za biljne proizvode za zdravlje kostiju, ovo pruža obećavajuću osnovu za istraživanje biljaka bogatih akteozidima kao što su Rehmannia i Cistanche.

Međutim, važno je biti odgovoran i realan: ova studija je provedena na miševima, a ne na ljudima. Stoga se akteozid ne smije predstavljati kao dokazani lijek za ljudsku osteoporozu. Osobe s dijagnozom osteoporoze trebale bi se obratiti kvalificiranom zdravstvenom radniku, posebno ako već koriste lijekove na recept ili hormonsku terapiju.

Still, for those seeking a natural bone-support strategy, acteoside is a compound worth paying attention to because it is supported by emerging mechanistic research.

 

Zaključak

Ukratko, čini se da akteozid ima dvostruki regulatorni učinak na remodeliranje kostiju kod OVX miševa.

Može inhibirati resorpciju kostiju posredovanu osteoklastima potiskivanjem aktivacije NF-κB/Akt/NFATc1/c-fos puta.

U isto vrijeme, može promovirati formiranje kosti vođeno osteoblastom aktiviranjem ose Runx2/OCN/Col1.

Kroz ove mehanizme, akteozid je poboljšao povećanje resorpcije kostiju izazvano OVX i smanjenje formiranja kostiju, u konačnici pomažući u smanjenju gubitka kosti kod miševa.

Međutim, ovo istraživanje je provedeno samo na životinjskom modelu. Buduće studije bi trebale uspostaviti odgovarajuće modele ćelija kako bi se dalje istražilo kako akteozid reguliše funkciju osteoblasta i osteoklasta in vitro. Također je potrebno više kliničkih studija na ljudima prije nego što se akteozid može preporučiti kao terapijska opcija za osteoporozu.

Za sada, akteozid predstavlja obećavajuće prirodno jedinjenje za dalji razvoj u oblasti zdravlja kostiju i istraživanja vezanih za osteoporozu.

---

Reference

[1] Brown JP. Dugotrajno liječenje postmenopauzalne osteoporoze.Endocrinol Metab (Seul), 2021, 36(3): 544–552.

[2] Fischer V, Haffner-Luntzer M. Interakcija između koštanih i imunoloških ćelija: Implikacije za postmenopauzalnu osteoporozu.Semin Cell Dev Biol, 2022, 123: 14–21.

[3] He Yuchi, Liu Ya. Exploration of the molecular mechanism of Liuwei Dihuang Pill in the treatment of diabetes-related osteoporosis based on network pharmacology and molecular docking. Tradicionalna kineska medicina, 2025, 14(7): 6.

[4] Tan Xiaoyan, Li Xinhua, Chen Guanghua, et al. Klinička efikasnost Liuwei Dihuang pilule u kombinaciji sa zoledronskom kiselinom u liječenju postmenopauzalne osteoporoze.China Journal of Pharmaceutical Economics, 2024, 19(10): 47–51.

[5] Xiao Y, Ren Q, Wu L. Farmakokinetička svojstva i farmakološka aktivnost akteozida: Pregled.Biomed Pharmacother, 2022, 153: 113296.

[6] Zhou Yu. Sistematska evaluacija i istraživanje pravila o lijekovima recepta tradicionalne kineske medicine za postmenopauzalnu osteoporozu i mehanizam Gujindan intervencijske terapije. Disertacija. Čangčun: Univerzitet kineske medicine u Čangčunu, 2023.

[7] Wu Tingyu, Yu Pei, Liu Zhiqiang, et al. Mehanizam Qigu kapsule protiv osteoporoze zasnovan na mrežnoj farmakologiji.Časopis Univerziteta Xinyu, 2021, 26(5): 29–37.

[8] Sun Qianhui. Studija o efektima Zuogui pilule i Yougui pilule na osteogenezu, adipogenezu i apoptozu mezenhimalnih matičnih ćelija koštane srži kod štakora sa ovariektomijom. Disertacija. Shenyang: Univerzitet tradicionalne kineske medicine Liaoning, 2017.

[9] Zhang QY, Gong HB, Jiang MY, et al. Regulacija enzimske peroksidacije lipida u osteoblastima štiti od postmenopauzalne osteoporoze.Nat Commun, 2025, 16(1): 758.

[10] Wang Dongdong, Ren Weimin, Chen Kai, et al. Prediktivna vrijednost mikro-CT parametara za recidiv nakon operacije kompresijskog prijeloma osteoporoze.Imaging Science and Photochemistry, 2022, 40(1): 22–27.

[11] Brown JP. Dugotrajno liječenje postmenopauzalne osteoporoze.Endocrinol Metab (Seul), 2021, 36(3): 544–552.

[12] Migliorini F, Maffulli N, Spiezia F, et al. Biomarkeri kao praćenje terapije za postmenopauzalnu osteoporozu: sistematski pregled.J Orthop Surg Res, 2021, 16(1): 318.

[13] Udagawa N, Koide M, Nakamura M, et al. Diferencijacija osteoklasta prema RANKL i OPG signalnim putevima.J Bone Miner Metab, 2021, 39(1): 19–26.

[14] Gomathi K, Akshaya N, Srinaath N, et al. Regulacija Runx2 post-translacijskim modifikacijama u diferencijaciji osteoblasta.Life Sci, 2020, 245: 117389.

[15] Sharma AR, Lee YH, Gankhuyag B, et al. Utjecaj čestica glinice na osteogenu sposobnost osteoblasta.J Funct Biomater, 2022, 13(3): 105.