Novi peptid izveden iz Netrina{0}} poboljšava zaštitu od neuronske smrti i ublažava intracerebralno krvarenje kod miševa, 1. dio

sažetak:

Prijavljeno je da je Netrin{0}} uključen u neuroprotekciju nakon povrede centralnog nervnog sistema. Međutim, minimalna funkcionalna domena Netrina-1 koja može sačuvati europrotekciju, ali izbjeći glavne nuspojave Netrina, ostaje nedostižna.

Centralni nervni sistem je jedan od najvažnijih nervnih sistema u ljudskom telu, koji kontroliše razmišljanje, osećanja i postupke ljudi. Kada je centralni nervni sistem oštećen, biće pogođeno i pamćenje ljudi. Ali ne brinite, možemo poduzeti neke pozitivne načine da pomognemo u obnavljanju pamćenja.

Prvo, morate razumjeti utjecaj oštećenja memorije. Oštećenje centralnog nervnog sistema može uticati na kognitivne sposobnosti ljudi, procese razmišljanja i pažnju, a sve to direktno utiče na pamćenje ljudi. Osim toga, oštećenje centralnog nervnog sistema može uzrokovati i emocionalnu nestabilnost, čineći ljude sklonijim panici, anksioznosti i depresiji, što utiče na oporavak pamćenja.

Međutim, iako oštećenje centralnog nervnog sistema može dovesti do nekih negativnih efekata, možemo preduzeti neke pozitivne mere za unapređenje pamćenja. Prvo, možemo isprobati neki kognitivni trening, kao što je čitanje, pisanje i rješavanje zagonetki. Ove aktivnosti mogu stimulirati mozak da proizvodi nove neurone i pomoći mozgu da izgradi nova sjećanja i načine razmišljanja.

Drugo, možemo također promovirati oporavak pamćenja kroz neke fizičke vježbe. Istraživanja su pokazala da pravilna tjelovježba može stimulirati mozak da proizvodi nove neurone i neuronske veze i promovira procesiranje novih informacija u mozgu. Zbog toga neki ljudi iznenada dođu na dobru ideju ili riješe težak problem dok trče ili hodaju.

Konačno, trebamo obratiti pažnju na ulogu pravilnog nutritivnog unosa na pamćenje. Za normalno funkcionisanje mozga potrebni su neki neophodni nutrijenti, kao što su proteini, vitamini i elementi u tragovima. Ako našoj hrani nedostaju ovi nutrijenti, to će uticati na naše pamćenje i sposobnost razmišljanja. Stoga u našoj ishrani treba da biramo namirnice bogate ovim nutrijentima, kao što su riba, nemasno meso, povrće i voće.

Ukratko, oštećenje centralnog nervnog sistema imat će određeni utjecaj na pamćenje ljudi, ali možemo promovirati oporavak pamćenja kroz odgovarajući kognitivni trening, fizičke vježbe i kontrolu prehrane. Nadam se da će se svi moći pozitivno suočiti sa životnim izazovima, zadržati optimističan stav i nastojati da povrate zdrav centralni nervni sistem i dobro pamćenje. Vidi se da moramo poboljšati pamćenje, a Cistanche može značajno poboljšati pamćenje jer je Cistanche tradicionalna kineska medicina sa brojnim jedinstvenim efektima, od kojih je jedno poboljšanje pamćenja. Djelotvornost Cistanchea proizlazi iz različitih aktivnih sastojaka koje sadrži, uključujući taninsku kiselinu, polisaharide, flavonoidne glikozide, itd., koji mogu promovirati zdravlje mozga na mnogo načina.

Kliknite Znaj da poboljšate kratkoročno pamćenje

Ovdje smo istraživali tada europrotektivni efekat peptida E1 izvedenog iz Netrin-10ovog EGF3 domena (ostaci 407–422). Otkrili smo da je u interakciji s izbrisanim kolorektalnim karcinomom (DCC) kako bi aktivirao fosforilaciju fokalne adhezione kinaze koja pokazuje neuroprotekciju.

Primjena peptida E1 je bila u mogućnosti da poboljša funkcionalni oporavak kroz smanjenu apoptozu u eksperimentalnom mišjem modelu intracerebralne hemoragije (ICH).

Ukratko, otkrivamo funkcionalnu sekvencu Netrin-1 koja je uključena u proces oporavka nakon ICH i identificiramo peptid kandidata za liječenje ICH.

Ključne riječi: intracerebralno krvarenje; hemin; neuroprotekcija; Netrin-1; peptid.

1. Uvod

Intracerebralna hemoragija (ICH) je razarajući podtip moždanog udara s visokom stopom mortaliteta i morbiditeta [1–3] koji uključuje abnormalnu rupturu cerebralnih krvnih žila unutar mozga [4,5].

Hirurško uklanjanje hematoma je poželjno za postizanje hemostaze i snižavanje intrakranijalnog pritiska [6]. Međutim, zaostali hematički ostaci i produkti razgradnje krvi još uvijek mogu potaknuti sekundarnu ozljedu mozga nakon ICH-a, izazivajući oštećenje neurona i odgađajući funkcionalni oporavak [7-9].

Stoga bi razvoj učinkovitih strategija usmjerenih na sekundarno oštećenje neurona uzrokovanih ozljedom mozga bio koristan za liječenje moždanog udara. Netrin-1 je jedan od najbolje proučavanih proteina koji reguliraju aksonsko vođenje i sinaptogenezu [10–12] putem interakcije sa svojim receptorima izbrisani kod kolorektalnog karcinoma (DCC) i UNC5H (nekoordinirani-5 homolog) kako bi se aktiviralo preživljavanje, diferencijaciju i proliferaciju ćelija [13–15].

Receptori indukuju signal smrti kako bi posredovali apoptozu kada je Netrin-1 odsutan [16]. Poznato je da vezivanje Netrina-1 sa DCC dovodi do dimerizacije DCC-a i inicira tirozin 861 fosforilaciju fokalne adheziokinaze (FAK) kako bi se inducirao rast neurita i aksonsko vođenje [17,18].

Vezivanje Netrin-1 sa DCC uključuje EGF3 domen Netrin-1 i FN5 domen DCC u aktivaciji Netrin-1 signalnog puta [19,20]. Nedavno je pokazano da Netrin{7}} ima neuroprotektivne efekte u ishemijskim regijama [21].

Nivo ekspresije Netrin-1 u serumu, koji inhibira ćelijsku apoptozu i promovira regeneraciju neurona, u pozitivnoj je korelaciji s oporavkom pacijenata od ishemijskog moždanog udara [22,23].

Zanimljivo je da transplantacija mezenhimalnih matičnih ćelija koštane srži koje luče Netrin-1 u oštećeni išijatični nerv štakora inicira regeneraciju aksona [24] i smanjuje smrt motornih neurona [25]. Stereotaksična injekcija Netrin-1 proteina u ventrikule smanjuje smrt nervnih ćelija nakon subarahnoidalnog krvarenja kroz aktivaciju DCC/APPL1/AKT signalizacije [26].

Polipeptid izveden iz EGF3 domena Netrin-1 (aminokiseline 423–433) značajno aktivira ERK fosforilaciju i podstiče proizvodnju NO, koji ima kardioprotektivne efekte [27,28]. Međutim, Netrin-1 je identificiran kao potencijalni biomarker za tumorigenezu [29–31] jer se regulacija Netrin-1 statusa nalazi u višestrukim tumorima koji potiču iz tkiva [32].

Kada je Netrin-1 vezan za svoj receptorDCC ili Unc5H, receptori prenose pozitivan signal koji vodi do preživljavanja, upale, angiogeneze i anti-apoptoze, što zauzvrat reguliše tumorigenezu [31].

Stoga je veoma važno identifikovati minimalni funkcionalni domen Netrina-1 koji može sačuvati neuroprotekciju i izbjeći glavne nuspojave Netrina-1. Ovdje smo otkrili da peptid E1 (ostaci 407–422), koji je izveden iz EGF3 domene Netrin-1, stupa u interakciju sa DCC-om kako bi zaštitio neurone od toksičnosti izazvane heminom.

U eksperimentalnom modelu ICH miševa, primjena peptida E1 poboljšala je funkcionalni oporavak, što je utvrđeno testovima ponašanja. Nadalje, peptid E1 može spriječiti degeneraciju neurona nakon ICH.

Na osnovu ovih rezultata identifikovali smo funkcionalnu sekvencu Netrin-1 koja je uključena u oporavak nakon ICH i utvrdili da se ovaj peptid može koristiti za liječenje ICH.

2. Rezultati

2.1. EGF3 domen je kritičan za Netrin-DCC interakciju

Netrin-1 se sastoji od VI domene, tri EGF ponavljanja i C-terminalnog domena [33]. Kristalna struktura ljudskog Netrin-1/DCC kompleksa otkriva da je Netrin-1 EGF3 domen ključan za Netrin-1/DCC interakciju, ali ne i domene EGF1 i EGF2 [34].

Mutageneza ključnih aminokiselinskih ostataka (His407, Gln442 ili Gln443) na EGF3 domeni potpuno je poremetila vezivanje Netrin-1/DCC [19]. EGF1/2 domeni su potrebni za prebacivanje atraktivne signalizacije u odbojnu signalizaciju kada Unc5 koegzistira sa DCC [20].

Stoga smo prvo generirali konstrukte pune dužine i EGF3-izbrisane (Netrin-1 ∆407–443) Netrin-1 konstrukcije (Slika 1A) i prolazno eksprimirali ove konstrukte u kultivisanim ćelijama HEK293T za GSTpulldown .

Uočeno je vezivanje za konstrukte koji su eksprimirali Netrin-1, ali ne i Netrin-1(∆407–443) (Slika 1C). Ovi rezultati sugeriraju da je domen EGF3 koji sadrži aminokiseline 407–443 odgovoran za interakciju Netrin-1 sa DCC. Da bismo istražili ulogu EGF3 domene u Netrin-DCC, prvo smo pročistili myc-taggedNetrin{{12 }} ili skraćeni Netrin-1 (∆407–443) (Slika 1B).

Zatim su ćelije HEK293T transficirane plazmidom koji nosi DCC cDNA i inkubirane sa Netrin-1 proteinom, a zatim je vezanje Netrin{2}} procijenjeno imunološkim bojenjem.

Otkrili smo da se Netrin-1 pune dužine, ali ne i skraćeni Netrin-1, mogao vezati za DCC na plazma membrani (Slika 1D). Da bismo utvrdili da li EGF3 domen može stupiti u interakciju sa DCC-om, generirali smo GST-EGF3 konstrukt za povlačenje liziranih ćelija koje prekomjerno eksprimiraju DCC. Uočili smo specifično vezivanje DCC sa GST-EGF3 (Slika 1E).

Nadalje, sintetizirali smo FITC-obilježeni peptid EGF3 i potvrdili da je, poput Netrina pune dužine-1, bio u stanju da se veže za DCC na plazma membrani (Slika 1F). Uzeti zajedno, naši podaci ukazuju da je EGF3 domen odgovoran za interakciju Netrin-1 sa DCC-om.

2.2. EGF3 domen inducira fosforilaciju nizvodnih puteva Netrina-1

Interakcija Netrin-1 i DCC-a aktivira višestruke signalne puteve, uključujući FAK, SFK i ERK [16,35]. Fokalna adheziona kinaza (FAK) je jedna od glavnih aktivnosti tirozinfosforilacije koja je povezana sa Netrin-1/DCC signalizacijom.

Netrin-1 aktivira fosforilaciju FAK i fosforilaciju protein tirozin kinaza (SFK) porodice Src [17]. I FAK i SFK signalni putevi igraju ključnu ulogu u razvojnoj fazi nervnog sistema i popravci povreda [36,37]. Štaviše, Netrin-1 može aktivirati ekstracelularno signalno reguliranu kinazu-1/2 (ERK1/2), koja posreduje u djelovanju puta proteinkinaze aktivirane Mitogenom (MAPK) [38–40].

Da bismo istražili da li je EGF3 domena kritična za aktivaciju nizvodnih signalnih puteva putem vezivanja Netrin-1 za DCC, prvo smo ispitali efekat EGF3 domene na fosforilaciju tirozina 861 FAK-a (Slika 2A) . Otkrili smo da delecija EGF3 inhibira fosforilaciju FAK-a u kultivisanim kortikalnim neuronima (Slika 2B, C), potvrđujući na taj način suštinsku ulogu EGF3 u Netrin-1 signalnom putu.

Zatim su kultivirani kortikalni neuroni stimulirani GST-EGF3 fuzionim proteinom u trajanju od 20 minuta, a western blotting je dalje potvrdio da tretman s GST-EGF3 fuzijskim proteinom inducira FAK, ERK i SFK fosforilaciju (Slika 2D-G).

Ovi rezultati sugeriraju da EGF3 domen Netrin-1 funkcionira kao snažan stimulator za aktiviranje nizvodnih signalnih puteva.

Slika 1. EGF3 domen Netrin-1 je kritična regija za Netrin-1/DCC interakciju. (A) Ilustracije Netrin-1konstrukcija. Netrin-1 konstrukcije su Netrin-1 pune dužine, Netrin-1-(∆407–443) i GST-EGF3. (B) Prečišćeni Netrin-1-(∆407–443)-Myc/His kvantifikovani su poređenjem sa BSA standardnom krivom. (C) Imunoblotiranje frakcije pull-down pomoću GST-DCC FN5 domena fuzionog proteina i samo GST. (D) Imunofluorescentne slike Flag-DCC koje eksprimiraju 293T ćelije inkubirane sa kontrolnim medijumom, Netrin-1-myc/his i Netrin-1-(∆407–443) -Myc/his tokom 30 minuta, respektivno, i kvantitativno analiza. Skala bar, 10 µm. (E) Imunoblotiranje padajuće frakcije pomoću GST-EGF3 fuzijskog proteina i GST zajedno. (F) Imunofluorescentne slike Flag-DCC koje eksprimiraju 293T ćelije inkubirane sa kontrolnim medijumom i FITC obeleženim Pep EGF3 tokom 30 minuta, respektivno, i kvantitativna analiza. Skala bar, 10 µm.

Slika 2. EGF3 domena aktivira nizvodne puteve Netrina-1. (A) Eksperimentalni postupak. (B) Kortikalni neuroni (E17 i DIV3) su stimulisani Netrinom-1, Netrinom-1-(∆407–443) ili kontrolnim medijumom 20 min. Ćelijski lizati su inkubirani sa anti-p-FAK-861 antitijelom da se potvrdi aktivnost Netrin-1. (C) Kvantitativna analiza western blot rezultata prikazana je u (B). n=3. (D) Kortikalni neuroni (DIV3) su tretirani sa 1,5 µM GST (+), 1,5 µM GST-EGF3 fuzionim proteinom (+), ili 1,5 µMNetrin-1 (+) medijumom tokom 20 minuta. Ćelijski lizati su inkubirani sa anti-p-FAK-861, anti-p-SFK-418 i anti-p-ERK-202/204.(E–G) Kvantitativna analiza zapadnog rezultati mrlja prikazani u (D). n=3. Podaci su predstavljeni kao srednje vrijednosti ± SEM. Jednosmjerna ANOVA je korištena za sve statističke analize prikazane na ovoj slici (* p < 0,05, ** p < 0,01; ns, nije značajno). Detalji analize podataka prikazani su u Dodatnoj tabeli S1.

2.3peptidi E1 i E2 stupaju u interakciju sa DCC-om kako bi aktivirali nizvodni signalni put Netrina-1

Kao što je prethodno opisano, mali peptid izveden iz EGF3 domena Netrin-1 (aminokiseline 423-433) inducirao je ERK fosforilaciju [27]. Sintetizirali smo peptide E1 (ostaci 407-422) i E2 (ostaci 423-433) koji su izvedeni iz EGF3 domena Netrina-1 (Slika 3A).

Otkrili smo da je inkubacija peptida E1 povećala nivoe fosforiliranog FAK-a i SFK (Slika 3B, D, E) u ćelijama kulture na način ovisan o dozi, ali nije promenio nivoe fosforilisanog ERK (Slika 3B, F).

Za razliku od peptida E1, peptid E2 ne samo da je inducirao tirozinsku fosforilaciju FAK-a (slika 3C, G) i fosforilaciju tirozina SFK (slika 3C, H), već je inducirao i fosforilaciju tirozina ERK (slika 3C, I) u kulturi neurona kore.

Kontrolni peptid (Pep Ctrl) nije imao uočljiv učinak na fosforilaciju tirozina FAK, SFK i ERK (slika S1). Nadalje, primijetili smo da je fosforilacija komponenti signalnog puta FAK inducirana peptidom E1 vremenski zavisna (slika S1). S2). Ovi rezultati pokazuju da su E1 i E2 minimalni funkcionalni peptidi Netrina-1.

Slika 3. Minimalne sekvence EGF3 domene aktiviraju nizvodne puteve Netrina-1. (A) Ilustracije peptida. (B) Kortikalni neuroni (DIV3) su stimulirani gradijentom koncentracija peptida E1. Ćelijski lizati su inkubirani sa anti-p-FAK-861, anti-p-SFK-418 i anti-p-ERK-202/204. (C) Kultivisani kortikalni neuroni su tretirani gradijentnim koncentracijama peptida E2.

Lizati su sakupljeni i inkubirani sa naznačenim antitelima za merenje fosforilacije FAK, SFK i ERK. (D–F) Kvantifikacija obima FAK, SFK i ERK fosforilacije izazvane peptidom E1 u neuronima prikazana je u (B). n=3. (G–I) Kvantifikacija obima FAK, SFK i ERK fosforilacije izazvane peptidom E2 prikazana je u (C). n=3. (J) Kortikalni neuroni izvedeni iz DCC divljeg tipa i homozigotnih mutantnih embriona stimulirani su peptidima izvedenim iz Netrin-1 ili Netrin-1- i lizirani su.

Dobijeni lizati su podvrgnuti imunoblotingu. (K) Kvantifikacija FAK PY{{0}} i DCC nivoa u DCC mutantnim neuronima je prikazana u (J). n=3. Podaci su predstavljeni kao srednja vrijednost ± SEM. Jednosmjerna ANOVA je korištena za sve statističke analize prikazane na ovoj slici (* p < 0,05; ns, nije značajno). Detalji analize podataka prikazani su u Dodatnoj tabeli S1.

Da bismo utvrdili da li je aktivacija FAK signalnog puta zavisna od DCC-a, izmjerili smo obim tirozinske fosforilacije FAK-a izazvane ovim peptidima u DCC+/+ i DCC−/− neuronima. Otkrili smo da oba peptida E1 i E2 nisu uspjela inducirati fosforilaciju FAK-a u DCC-/- neuronima (Slika 3J, K).

Također smo otkrili da se sintetizirani peptidi E1 i E2 označeni sa N-terminalnom zastavom (Flag-E1 i Flag-E2) direktno vezuju za DCCFN5 domen (slika S3).

2.4. Peptid E1 štiti neurone od smrti ćelija izazvane heminom in vitro

Da bismo pokazali zaštitu od neuronske ozljede peptida E1, koristili smo reakciju toksičnosti inducibilne heminom da oponaša sekundarnu ozljedu mozga nakon intracerebralne hemoragije [41,42].

Kultivisane neuronske ćelije koje eksprimiraju GnRH (NLT) [43–45] su inkubirane sa heminom u različitim koncentracijama i trajanju. Inkubacija NLT ćelija sa heminom u medijalnoj smrtonosnoj dozi (60 µM) rezultirala je vremenski ovisnim smanjenjem stope preživljavanja ćelija, što sugeriše da su hemin preuzeli neuroni i da se metaboliše (Slika S4).

Da bi se ispitalo da li ekspresija Netrin-1 i DCC reaguje na smrt neuronskih ćelija izazvanu heminom, kultivisane NLT ćelije su inkubirane sa heminom različitog trajanja. Western blot rezultati su pokazali da su nivoi ekspresije Netrin-1 i DCC značajno povećani 6 h nakon inkubacije hemina, a zatim postepeno opadali (Slika 4A, B).

Da bismo istražili da li su peptidi E1 i E2 bili u stanju ublažiti smrt neurona izazvanu heminom, izvršili smo CCK-8 test sa Netrin-1, PepCtrl, peptidom E1 i peptidom E2.

Otkrili smo da ovi peptidi nemaju efekta na vitalnost ćelije (Slika 4C i Slika S5). U poređenju sa inkubacijom sa Pep Ctrl i peptidom E2, peptid E1 i Netrin-1 su poboljšali neuronsku smrt izazvanu heminom (Slika 4D). Takođe smo obojeni kalceinom-AM i PI da bismo razlikovali žive i mrtve ćelije.

Rezultati su pokazali da i Netrin-1 i peptid E1 štite od smrti izazvane heminom in vitro (Slika 4E-G). Nadalje, 1,5 µM peptid E1 ublažio je smrt uzrokovanu heminom u primarno kultiviranim neuronima (Slika 4H, I). Sve u svemu, ovi rezultati su pokazali da peptid E1 štiti neurone od ćelijske smrti izazvane heminom.

2.5. Netrin-1-Peptid E1 izveden iz Netrina potiče funkcionalni oporavak nakon ICH

Da bismo istražili da li peptid E1 izveden iz Netrin-1 igra važnu ulogu u funkcionalnom oporavku nakon moždanog izljeva, uspostavili smo eksperimentalni ICH model miša ubrizgavanjem kolagenaze pomiješane sa mastilom u strijatum (slika S6A).

Nakon tri dana, prikazane su slike moždanog kriška kako bi se pratila pozicija ubrizgavanja i volumen kolagenaze pomoću mastila (slika S6B, C). Miševi sa strijatalnim krvarenjem pokazali su slabost na ipsilateralnoj strani zbog ozljede mozga (Slika S7A-C).

Hematomi u strijatumu nakon ICH su bili vidljivi u poređenju sa injekcijom fiziološkog rastvora (slika S7D). Relativni nivoi proteina Netrin-1 i DCC u perihematomalnom korteksu su povećani kod ICH miševa u poređenju sa kontrolnim miševima drugog dana, a Netrin-1 je još uvijek bio značajno viši 3. dana, što ukazuje da je Netrin-1 važan je za oporavak od ozljede mozga (Slika S7E, F).

Zatim je FITC-obilježen TAT-peptid E1 (FITC-Pep TE1), koji je dodao TAT sekvencu N-kraja peptida E1, ubrizgan u ICH miševe i pokazalo se da FITC-Pep TE1 prelazi krvno-moždanu barijeru ( Slika S8).

ICH i kontrolnim miševima intraperitonealno je ubrizgavan peptid (12 mg/kg) dnevno ili jednaka količina fiziološkog rastvora (Slika 5A). Otkrili smo da je primjena peptida TE1 poboljšala stopu preživljavanja i spasila defekte tjelesne težine nakon ICH (Slika 5B, C).

Također smo otkrili da je volumen kolagenaze praćen jednakim omjerom tinte u svakoj grupi bio sličan, potvrđujući da je ovaj standardni ICH model kolagenaze rezultirao reproducibilnim intrastriatalnim hematomima (slika 5D). Peptid TE1 je poboljšao rezultate ponašanja ICH miševa u testu uklanjanja trake (slika 5E ) i test cilindra (Slika 5F).

Kao što se očekivalo, peptid TE1 je smanjio infarkt volumena nakon ICH (Slika 5G, H). Uzeti zajedno, ovi rezultati sugeriraju da je peptid E1 mogao smanjiti volumen hematoma i poboljšati funkcionalni oporavak u mišjem modelu ICH.

Slika 4. Peptid E1 poboljšava in vitro ćelijsku smrt izazvanu heminom. (A) Western blot Netrin-1 i DCC u kultivisanim NLT ćelijama izloženim Heminu (60 µM). (B) Kvantitativna analiza western blotres rezultata prikazana je u (A). n=3. (C) CCK-8 testovi su pokazali da serijski peptidi nisu promijenili vitalnost ćelija. n=4. (D) 1,5 µM Pep E1 je sačuvao vitalnost NLT ćelija kada je dobro dodat nakon izlaganja heminu (60 µM). n=4. (E) Živa (zeleno)/mrtva (crvena) analiza NLT ćelija izloženih heminu (60 µM,6 h). Skala bar, 50 µm. (F, G) Kvantitativna analiza testa živi/mrtvi u (E). n=9. (H) CCK-8testovi su pokazali da Pep E1 može smanjiti smrt ćelija izazvanu heminom u neuronima primarne kulture. n=8.(I) Živo/mrtvo ispitivanje neurona primarne kulture (50 µM, 6 h). Skala bar, 50 µm. Podaci su prikazani kao srednja vrijednost ± SEM. Jednosmjerna ANOVA ili Dvosmjerna ANOVA korištena je za sve statističke analize prikazane na ovoj slici (* p < 0,05, ** p < 0,01, *** p < 0,001; ns, nije značajno). Detalji analize podataka su vidljivi u Dodatnoj tabeli S1.

Slika 5. Peptid E1 dobijen iz netrina{1}}a promovira proces oporavka nakon ICH. (A) Šema eksperimentalne paradigme intraperitonealne (IP) injekcije peptida TE1 u ICH modeliranju miševa. (B) Zabilježen je omjer preživljavanja nakon ICH svake grupe, a korištena je Kaplan-Meierova metoda. n=10. (C) Promjene tjelesne težine 5 dana nakon ICH. n=6.(D) Mešavina kolaž/fiziološki rastvor sa jednakim omjerom mastila (ukupno 0.6 µL) ubrizganog u striatum C57 miševa, reprezentativne slike koje prikazuju područje mastila bilo je slično kod miševa tretiranih sa/ bez peptida TE1 5 dana nakon ICH. (E, F) IP injekcija peptida TE1 (12 mg/kg), ali ne i TAT (12 mg/kg), kontrola, poboljšano ponašanje praćeno zadatkom uklanjanja trake (E) ili zadatkom u uglu (F).

fiziološki rastvor,n=10 pojedinačnih životinja; ICH, n=6 pojedinačnih životinja; ICH + TAT, n=6 pojedinačnih životinja; ICH + TE1, n=8 pojedinačnih životinja. (G) Reprezentativni preseci obojeni hematoksilinom i eozinom kod miševa tretiranih sa/bez peptida TE1 5 dana nakon ICH. Skala bar, 1 mm. (H) Kvantifikacija volumena krvarenja u dijelovima mozga prikazanim u (G).

fiziološki rastvor, n {{0}} pojedinačnih životinja; ICH, n=6 pojedinačnih životinja; ICH + TAT, n=6 pojedinačnih životinja; ICH + TE1, n=8 pojedinačnih životinja. Podaci su prikazani kao srednja vrijednost ± SEM. Jednosmjerna ANOVA ili Dvosmjerna ANOVA korištena je za sve statističke analize prikazane na ovoj slici (* p < 0.05, ** p < 0,01, *** p < 0,001; ns, nije značajno). Detalji analize podataka prikazani su u Dodatnoj tabeli S1.

2.6. Peptid E1 dobijen iz netrina smanjuje neuronsku apoptozu nakon ICH

Istražiti osnovne mehanizme peptida E1 u procesu funkcionalnog oporavka ICH. Mi smo detektovali neuronsku degeneraciju u perihematomskoj regiji bojenjem fluoro-žada C (FJC).

Otkrili smo da je primjena peptida TE1 značajno smanjila broj FJC-pozitivnih ćelija u regijama perihematoma, što ukazuje da pep TE1 inhibira neuronsku degeneraciju nakon ICH (Slika 6A, B). Izvršili smo TUNEL bojenje i otkrili da peptid TE1 značajno smanjuje broj TUNEL-pozitivnih neurona (Slika 6C, D).

Broj TUNEL-pozitivnih astrocita nije se mogao otkriti nakon tretmana peptidom TE1 (Slika 6E, F). Osim toga, korištenjem 4 kDa dekstrana označenog FITC-om kao atracera za označavanje permeabilnosti krvno-moždane barijere (BBB), otkrili smo da peptid TE1 nije utjecao na oporavak permeabilnosti BBB (Slika S9A, B).

Nivoi sirovih fluorescentnih jedinica (RFU) u serumu bili su slični, potvrđujući prisustvo ubrizganog tragača kod svih analiziranih životinja (slika S9C). Također smo koristili lektin označen fluoresceinom za obilježavanje mikrožila, ali nismo uspjeli uočiti bilo kakvo poboljšanje nakon tretmana TE1 (Slika S9D, E). Iznad svega, ovi nalazi sugeriraju da peptid E1 potiče oporavak neurona nakon ICH inhibirajući neuronsku apoptozu.

Slika 6. Peptid E1 dobijen iz netrina može zaštititi od neuronske smrti i degeneracije, ali ne i astrocite nakon ICH.(A) Reprezentativni dijelovi obojeni fluoro-žadom C kod miševa tretiranih sa/bez TE1 5 dana nakon ICH. Skalirana traka, 50 µm, odnosno 10 µm. (B) Kvantifikacija Fluoro-žad C pozitivnih ćelija u perihematomskoj regiji (n=4). (C) TUNEL bojenje koje pokazuje efekte TE1 na sekundarnu ozljedu mozga (SBI) 5 dana nakon početka ICH. Reprezentativne slike iz grupa Saline, ICH, ICH + TAT i ICH + TE1.

Svaka grupa je bila podvrgnuta ICH osim grupe sa slanim rastvorom. Skalirana traka, 50 µm, odnosno 10 µm. (D) Kvantitativne analize za procenat TUNEL-pozitivnih neurona prikazane su u (C). n=4. (E) Kolokalizacija TUNEL-a sa GFAP-om 5 dana nakon ICH. Reprezentativne slike iz grupa Saline, ICH, ICH + TAT i ICH + TE1. Skalirana traka, 50 µm, odnosno 10 µm. (F) Kvantitativne analize za procenat TUNEL-pozitivnih astrocita prikazane su u (E). n=4. Podaci su predstavljeni kao srednja vrijednost ± SEM.

Jednosmjerna ANOVA je korištena za sve statističke analize prikazane na ovoj slici (* p < 0.05, ** p < 0.01, *** p < 0,001, **** p < 0,0001, nije značajno). Detalji analize podataka prikazani su u Dodatnoj tabeli S1.

3. Diskusija

Naša studija je identifikovala jezgro peptidne sekvence Netrin-1 koja je ključna za funkcionalni oporavak nakon ICH. Interakcijom sa DCC-om, ovaj peptid izveden iz Netrina{1}} štiti od neuronske smrti zbog sekundarnog oštećenja nakon ICH i stoga je obećavajući tretman za ICH.

Terapeutska primjena Netrin-1, proteina visoke molekularne težine, zahtijeva identifikaciju minimalne funkcionalne sekvence Netrina-1 koja promovira signalizaciju nizvodno. U našoj studiji generisani su peptidi E1 (ostaci 407–422) i E2 (ostaci 423–433), koji su izvedeni iz EGF3 domena Netrin-1, respektivno. Otkrili smo da je peptid E1 (ostaci 407-422) zaštićen od smrti neurona nakon ICH.

Otkrili smo da su nivoi ekspresije Netrin-1 i DCC povećani u NLT ćelijama nakon tretmana heminom. Hemin se oslobađa iz hemoglobina nakon ICH i inducira sekundarnu povredu i glije i neuronskih ćelija [46–48].

Osim toga, primijetili smo i povećane nivoe proteina Netrin-1 i DCC nakon eksperimentalnog ICH. Pored toga, također smo primijetili povećane nivoe proteina netrina-1 i DCC-a nakon eksperimentalnog ICH.

Ovi rezultati su u skladu s prethodnim rezultatima koji pokazuju da netrin-1 igra važnu ulogu u oporavku nakon ICH [49].

For more information:1950477648nn@gmail.com